全 文 ：穗花杉双黄酮（Amentoflavone, ATF）是卷柏科卷
柏属植物江南卷柏（Selaginella moellendorfii Hieron）中
提取纯化出来的一种黄酮类化合物，具有抗炎［1-2］等多种
药理活性。而近年来，研究发现 ATF 能够抑制多种肿
瘤增殖［3-5］并诱导其死亡，但其具体机制仍不清楚。近年
来随着结肠癌的发病率逐年提升，寻找一种控制结肠癌
肿瘤进程的有效药物并研究其机制是十分必要的。为
给ATF抗结肠癌作用及其临床应用提供实验依据，本课
题组用ATF作用于SW480细胞，观察ATF对SW480细
胞活力影响，细胞死亡的形态，并找出其诱导结肠癌细胞
死亡的相关蛋白，为ATF治疗肿瘤提供更多的理论支持。
1 材料和方法
1.1 材料
结肠癌细胞株SW480为南方医科大学中医分子生
物实验室保存；1640培养基、胎牛血清来自Hyclone；穗
花杉双黄酮购自Sigma；检测caspase-3、COX-2、β-catenin
等一抗均为Cell signaling产品；Annexin V+PI细胞凋
亡检测试剂盒购自 Invitrogen；未做说明试剂来自MP
Biomedicals。
1.2 检测方法
1.2.1 MTT法检测细胞活力 收集对数期细胞，调整细
胞密度约10 000/孔。待细胞贴壁后，分别加入浓度梯
度的ATF（20、40、80、100、120、150、200 μmol/L），每孔
100 μ1，继续培养24 h。每个浓度设4个复孔，同时设立
穗花杉双黄酮通过影响 caspase-3和β-catenin表达诱导结肠癌细
胞SW480凋亡
杨 雨，徐文娟，彭 康，孙学刚
南方医科大学中医药学院分子生物学实验室，广东 广州 510515
Amentoflavone induces apoptosis in SW480 human colorectal cancer cells via regulating β-
catenin and caspase-3 expressions
YANG Yu, XU Wenjuan, PENG Kang, SUN Xuegang
Laboratory of Molecular Biology, School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Chi-
na
摘要：目的 观察穗花杉双黄酮对人结肠癌细胞SW480增殖及凋亡相关因子caspase-3、β-catenin的影响，初步探讨其诱导结肠
癌细胞凋亡的作用机制。方法 MTT细胞增殖试验检测穗花杉双黄酮对SW480细胞活力的影响，流式细胞术检测其对SW480
细胞凋亡的诱导作用，Western blot法检测穗花杉双黄酮作用细胞后caspase-3、β-catenin蛋白的表达。结果 穗花杉双黄酮对
SW480细胞生长有抑制作用，具有剂量依赖性。150 μmol/L穗花杉双黄酮明显促进其凋亡，凋亡率显著高于对照组（P<0.01）。
Western bolt结果表明，穗花杉双黄酮干预可以使caspase-3表达明显增强，β-catenin表达明显减弱。结论 穗花杉双黄酮可诱导
人结肠癌细胞SW480凋亡，并影响凋亡相关因子caspase-3、β-catenin的表达，从而达到抗肿瘤作用。
关键词：穗花杉双黄酮；SW480；caspase-3；β-catenin
Abstract: Objective To investigate the role of β- catenin and caspase- 3 in amentoflavone- induced apoptosis of human
colorectal cancer SW480 cells. Methods MTT assay was used to detect the viability of SW480 cells exposed to amentoflavone,
and flow cytometry was employed to assess the cell apoptosis. Western blotting was performed to determine the protein
expressions of β-catenin and caspase-3 in the exposed cells. Results Amentoflavone dose-dependently inhibited the viability of
SW480 cells, and a high concentration of amentoflavone (150 μmol/L) obviously induced apoptosis of the cells. Amentoflavone
exposure caused significantly increased expression of caspase-3 and suppressed β-catenin expression in the cells. Conclusion
Amentoflavone-induced apoptosis in SW480 human colorectal cancer cells is associated with altered expressions of β-catenin
and caspase-3.
Key words: amentoflavone; SW480; caspase-3; β-catenin
基础研究
收稿日期：2014-02-15
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81273621）；高等学校博士学科点
专项科研基金（20134433110007）
Supported by National Natural Science Foundation of China (81273621).
作者简介：杨 雨，在读硕士研究生，E-mail: xiaopilv2001@163.com
通信作者：彭 康，博士生导师，E-mail: pkang12@fimmu.com；孙学刚，博
士生导师，E-mail: 316915059@fimmu.com
J South Med Univ, 2014, 34(7): 1035-1038 doi 10.3969/j.issn.1673-4254.2014.07.24 ··1035
空白对照组，分别培养12、24 h后，每孔中加入5 mg/ml
MTT 20 μl，继续培养4 h。弃旧液，每孔加入150 μl二
甲基亚砜，置摇床振荡10 min，至紫色结晶完全溶解。
酶联免疫检测仪D490 nm处测量吸光值。细胞生存率=试
验组吸光度值/对照组吸光度值。实验重复3次。
1.2.2 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋
亡率 SW40细胞以 l×105/孔接种于6孔板中，待细胞贴
壁后，分别加入浓度梯度的ATF（0、50、100、150 μmol/L），
每孔1 ml，继续培养24 h。按照 Annexin V/PI流式试剂
盒说明书进行，采用美国Beckman公司EPICS XL分析
型流式细胞仪进样测定，根据Annexin V-FITC（x）/PI
（Y轴）荧光做对数散点图，可获得由4个象限组成的双
参数图：左上象限（K1）为细胞收集过程中产生的损伤
细胞，右上象限（K2）为晚期凋亡细胞和坏死细胞，左下
象限（K3）为活细胞，右下象限（K4）为早期凋亡细胞，每
个象限的细胞数即为受检总细胞数中所占的比例。实
验重复3次。
1.2.3 Hoechst 33342染色观察细胞核形态学变化 细
胞处理同 1.2.2 项方法，用 PBS 将 20 mg/ml Hoechst
33342储存液制备成5~10 μg/ml工作液。贴壁细胞弃
培养基，用PBS清洗1~2次。每孔加入35 μl Hoechst
33342工作液，置于37 ℃温育15~20 min。弃Hoechst
33342染液，PBS洗涤1~2次，用荧光显微镜拍照分析。
1.2.4 Western blot 检测蛋白表达 Bradford法蛋白定
量后，每组取约80 μg蛋白样品，加入5倍上样缓冲液后
进行12% SDS-PAGE，将湿转法转印至PVDF膜。5%
脱脂奶粉室温封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜。HRP偶联
的相应二抗（1∶1000 稀释）室温孵育 1 h。然后利用
IS2000 MM 图像工作站（Kodak）进行化学发光法检
测。曝光获取的图像用 Molecular Imaging Software
Version 4.0（Kodak）进行蛋白条带灰度分析。每组样
品重复上样检测3次。
1.3 统计学处理
实验数据计量资料用SPSS 13.0软件进行分析，采
用单因素方差分析，所有方差齐多重比较采用LSD方
法检验。若方差不齐多重比较采用Dunnetts T3，P<
0.05被认为之间差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 穗花杉双黄酮能够降低SW480细胞的生长活性
不同浓度的穗花杉双黄酮与SW480细胞作用12 h
和24 h后，用MTT 法测得的生存率见图1。ATF在24 h
150 μmol/L能显著抑制SW480细胞活性（P<0.05），作
用24 h后，随着ATF剂量的增加，细胞SW480生存率逐
步下降，呈剂量依赖性。SPSS计算出ATF的细胞生长
半数抑制浓度［6］，SW480 IC50=162 μmol/L。
2.2 穗花杉双黄酮诱导结肠癌细胞核形态变化
我们用 150 μmol/L ATF作用结肠癌细胞SW480
后，用终浓度为5 μg/mL Hoechst 33342染细胞核。荧
光显微镜下可观察到大量细胞核固缩，并形成典型的凋
亡小体（图2）。从Hoechst 33342染色结果中看到典型
的细胞核凋亡形态学改变。
2.3 ATF增加sw480细胞凋亡率
用3种浓度 ATF作用结肠癌细胞SW480 24 h后，
流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示，对照组细胞凋
亡率为0.01%，50、100、150 μmol/L ATF处理后细胞凋
亡率分别为2.96%、3.13%、44.41%（图3）。150 μmol/L
药物处理组的细胞凋亡率明显升高，且差异具有统计学
意义（P<0.01）。流式实验重复3次，统计结果如图4。
2.4 ATF通过caspase通路诱导细胞凋亡
Western blot方法观察发现在ATF作用 24 h后，
caspase-3为50、100、150 μmol/L在17 000处均出现分
解条带，同时，PARP也在50 μmol/L后出现降解体，并
随着浓度升高表达增强（图5）。
2.5 穗花杉双黄酮对SW480 COX-2、β-catenin表达的
影响
Western blot方法检测发现COX-2和β-catenin蛋
白在对照组合和100 μmol/L 150 μmol/L ATF组有不同
程度的表达（图6），在ATF作用24 h后，ATF组的COX-
2表达明显比对照组高，但β-catenin蛋白表达明显比对
照组低。吸光度值（A）/β-actin比值如图7，150 μmol/
L ATF 组和空白组比较，差异具有统计学意义（P<
0.05）。
3 讨论
穗花杉双黄酮是从植物江南卷柏中提取出来的一
种黄酮类化合物，实验证明对多种肿瘤［3-5］有抑制作用，
且毒副作用较低。但有关ATF抗结肠癌的研究尚少。
肿瘤的明显特征是逃逸正常细胞增殖调控系统而自主
无限生长。本文MTT结果显示，150 μmol/L ATF给药
24 h可以明显降低结肠癌SW480活力，且随着浓度和
图1 MTT检测ATF对SW480细胞活力的影响
Fig.1 Effect of ATF on viability of SW480 cells.
12 h 24 h
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 80 100 120 150 200
ATF (μmol/L)
C
el
lv
ia
bi
li
ty
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时间的增加抑制效果更明显，有较良好的时效和量效关
系。在形态上，Hoechst 染色明显观察到给药组的
SW480细胞出现核固缩和核碎片化等典型细胞凋亡特
征。我们统计Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量
检测ATF作用于SW480后的凋亡率，进一步证明了
ATF呈剂量依赖性地诱导细胞凋亡。
为更好的探讨ATF诱导SW480凋亡机制，我们采
用Western blot检测了凋亡相关蛋白COX-2、β-catenin、
caspase-3和PARP的表达。Caspase-3是 caspase家族
中关键的凋亡蛋白酶，它的激活可以水解特异性细胞蛋
白和PARP。而PARP是真核细胞内具有多聚腺苷酸二
磷酸核糖基（PAR）催化活性的蛋白酶，可以修复DNA损
图2 Hoechst 33342检测ATF处理结肠癌细胞SW480后细胞核形态变化
Fig.2 Amentoflavone-induced apoptosis in SW480 cells determined by Hoechst 33342 staining
(Original magnification: ×400). A: blank; B: 150 μmol/L ATF treated for 24 h.
A B
→ →
100 101 102 103 104
ANEXIN
P
I
104
103
102
101
100
P
I
104
103
102
101
100
100 101 102 103 104
ANEXIN
P
I
104
103
102
101
100
100 101 102 103 104
ANEXIN
P
I
104
103
102
101
100
100 101 102 103 104
ANEXIN
A B C D
图3 ATF作用于SW480细胞凋亡流式图
Fig.3 Apoptosis of amentoflavone- exposed SW480 cells detected by flow cytometry. A: Control; B: 50 μmol/L ATF; C: 100
μmol/L ATF; D: 150 μmol/L ATF.
图4 ATF作用于细胞凋亡率流式统计结果
Fig.4 Apoptosis rate of amentoflavone-exposed
SW480 cells detected by flow cytometry.
C
el
la
po
pt
os
is
(%
)
60
50
40
30
20
10
0
0 50 100 150
ATF (μmol/L)
*
图 5 Western blot 检测 50、100、150 μmol/L ATF 作用
SW480 24 h后caspase-3, PARP蛋白表达水平
Fig.5 Western blot analysis of caspase- 3 and PARP
expressions in SW480 cells 24 h after 50, 100 and 150 μmol/
L amentoflavone treatment．
Caspase-3
PARP
β-actin
Blank 50 μmol/L 100 μmol/L 150 μmol/L
图6 Western blot检测100、150 μmol/L ATF作用
SW480 24 h后COX-2、β-catenin蛋白表达情况
Fig.6 Western blot analysis of COX- 2 and β-
catenin expression in SW480 cells 24 h after 100
and 150 μmol/L amentoflavone treatment.
Blank 100 μmol/L 150 μmol/L
β-catenin
COX-2
β-actin
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伤和促进肿瘤细胞的生长。本实验显示，24 h 50 μmol/L
ATF已经能够检测出caspase-3和PARP的分体，并随着
浓度升高逐渐加强。所以初步推测ATF是通过激活
caspase-3蛋白，促使了PARP的降解，导致结肠癌细胞
的生长受到抑制并发生了凋亡。
β-catenin是恶性肿瘤的标志物。从E-cadherin- β-
catenin功能复合体中解离出来后入核，促进癌细胞的黏
附性、运动性，进而影响组织结构和形态的变化。同时，
β-catenin也参与细胞信号传导途径［7］。正常组织中β-
catenin很少表达，在低级瘤中其仅在胞膜、胞质中有少
量表达，随着肿瘤级别增高其表达率亦增加。现在普遍
认为成熟细胞中β-catenin表达的增强是肿瘤恶化的标
志。24 h 100 μmol/L ATF已经明显降低β- catenin的蛋
白表达水平，在150 μmol/L时其表达量更弱，我们推测
ATF可能通过促进axin/GSK-3/APC 复合体（降解复合
体）的形成，促使游离的β-catenin表达量降低，抑制了肿
瘤的恶性增殖。
COX-2花生四烯酸合成前列腺素的限速酶［8］，在炎
症和癌症进程中发挥着重要作用。COX-2在多数组织
的生理条件下是不表达的，在肿瘤组织中会异常升高，
COX-2促进肿瘤生长的机制之一就是合成前列腺素，
促使血管生成，给肿瘤提供氧气和营养。目前认为
COX-2在癌症组织中是一种保护性酶，通过调控相关
蛋白磷酸化过程和其他抗凋亡因子抑制癌细胞凋亡［9］。
动物实验研究表明，在肿瘤进程受到阻碍，COX-2会发
挥作用［10］。当肿瘤细胞在生长过程中受到干预，为保护
癌细胞免受凋亡损伤，COX-2 表达增强［11］。可以说
COX-2是肿瘤损伤时的一种负反馈调控机制。本课题
认为其抗肿瘤活性可能与COX-2相关，Western 结果说
明，ATF在150 μmol/L上调了COX-2。 β-catenin作为
恶性增殖的标志物，同时也是COX-2的重要调节因子，
COX-2的表达受到β-catenin调控。在癌细胞受到损伤
β-catenin的降解会促使COX-2的表达升高。
综上所述，穗花杉双黄酮能够抑制结肠癌细胞
SW480增殖并诱导其凋亡。穗花杉双黄酮诱导结肠癌
细胞凋亡可能通过促进β-catenin的降解复合形成，导致
β-catenin的磷酸化降解，同时抑制了凋亡因子的作用，
促使caspase-3表达的增强，激活PARP的表达，导致了
癌细胞走向凋亡的道路，同时COX-2作为肿瘤的保护
蛋白，反馈性的升高。
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（编辑：孙昌朋）
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to
β-a
ct
in
)
图7 定量分析ATF处理SW480 24 h后COX-2、
β-catenin与actin相对灰度值
Fig.7 Quantitative analysis of protein
expressions of COX- 2 and β- catenin in SW480
cells at 24 h following amentoflavone treatment.
0 100 150
ATF (μmol/L)
120
100
80
60
40
20
0
COX-2 β-catenin
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