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·
万寿菊花干粉中总叶黄素的分离测定
张小吐 张建武 王朝晖 王熙竹
青岛卫生检疫局
提要 本文报道 了万寿菊花干粉中总叶黄素的分离测定方法 。 样品经提取 、 热皂化 、 由氧
化镁硅藻土混合柱进行色谱分离 , 先用正 已烷 丙酮 ( 9 : 1) 洗脱胡萝 卜素 , 再用正己烷 一丙
酮一 甲醇 (8 : 1 : l) 洗脱叶黄素 , 于 4 7 4n m 波长处测定其吸光度而进行定量测定 。
关键词 叶黄素 柱色谱 万寿菊
叶黄素是天然色素中的一种 , 是胡萝 卜
素类含氧衍生物 , 属类胡萝 卜素 , 主要以醛 、
酸 、 醇 、 醋和环氧化合物的形式存在于植物
体中 :l[ , 万寿菊花中其含量较丰富川 。 对于叶
黄素的分离测定国外在 70 年代就有文献报
道过 。 F . W . Q u a e k e n b u s h 等人 巨, 、 ` 口在 1 9 7 0
年对首蓓及玉米产品中胡萝 卜素 、 一经色素 、
二经色素及总叶黄素进行 了分离测定 , 并对
饲料中叶黄素和胡萝 卜素的测定作了协同研
究 。 1 9 7 2 年 B e n n y E . K u n e k l e s 等人 [5」在前
人工作的基础上作了改进后应用于鲜首稽及
含水样 品中叶黄素 的测定 。 1 9 7 3 年 A ir v in
L
.
L i v in g s t o n 等人 [ 6二运用两种方法对玉米
粉 、 干首楷 、 草及混合饲料中叶黄素的测定
作了比较 , 认为两种方法所得结果无显著性
差异 , 均可用于以上物质的测定 。 迄今为止 ,
国内对叶黄素的分离测定工作未见有文献报
道 。 叶黄素因是天然色素 , 具有芳香性 , 且
安全无毒 , 现正被用作食品添加剂而进人食
品领域 , 而万寿菊是提取叶黄素的原料 , 故
对叶黄素的分离测定有必要 , 本文就此作一
探讨 。
材料与方法
仪器及设备
层 析 柱 内 径 12 · s m nt 火
30 o m m 硬质玻璃层析柱 。
1
.
1
.
2 真空抽滤装置 (美国 W a t e r s 公
司 )
1
.
1
.
3 u v 一 2 1 0 0 紫外 /可见分光光度
计 ( 日本 S h i m a d i z )
1
.
1
.
4 水浴 (温控精度士 I C )
1
.
2 试剂
1
.
2
.
1 提取剂 正已烷 一丙酮 一水 乙婷 -
甲苯 ( 1 0 : 7 : 6 : 7 )
1
.
2
.
2 40 %氢氧化钾甲醇溶液 称取
4 09 氢氧化钾溶于甲醇中 , 冷却后用 甲醇定
容为 I OOnr l 。
1
.
2
.
3 洗脱液 I 正已烷一丙酮 (9 : 1)
1
.
2
.
4 洗脱液 I 正已烷一丙酮一 甲醇
( 8
: 1 : 1 )
1
.
2
.
5 苏丹红 I 标液溶液 准确称取
干燥至恒重的苏丹红 0 . 0 2 4艳 溶于 1。。ml 丙
酮一异 丙醇 (1 : 1) 中 , 此 溶 液 浓 度 为
0
.
i M m o l / L
。 工作液浓度为 0 . o 4M m o l / L ,
由 0 . I M m ol / L 标准溶液用丙酮一异丙醇 l(
:
1) 稀释得到 , 配好后于暗处避光保存 。
1
.
2
.
6 10 %硫酸钠溶液
1
.
2
.
7 吸附剂 氧化镁和硅藻土经活
化后按重量 比 1 : 1充分混匀 。 硅藻土为德国
E
.
M E R C K 公司产品 。
1
.
3 提取
DOI : 10. 16408 /j . 1004 -9770. 1994. s5. 049
·
1 10
.
将样品磨碎 ,过 40 目筛 , 准确称取 50 m g
左右样 品于 I OOm l 容量瓶中 , 加人 3o rn l 提
取剂 , 加 3一 4 滴水 , 加塞振荡 1 分种 , 用移
液管加人 Zm l4 o % K O H 一 C H oO H 溶液 , 剧
烈振荡 1 分种 , 于 56 ℃水浴 中加热 20 分种 ,
取出于暗处放置 1 小时 , 加入 3 0m l 正 已烷 ,
摇 1 分种 , 用 10 环N a ZS仇 溶液定容 , 后 即可
进行色谱分离 。
1
.
4 分离
于层析柱底部塞上脱脂棉或玻璃毛 , 然
后用吸附剂填柱 , 至高 1 c2 m 时抽真空 , 同时
加人吸附剂 , 使其高度为 c7 m 左右 , 然后将
其顶部压平 , 再加人无水 N a ZS O 、 , 高为 Z e m
左右并压平 。
从上层提取液 中吸取 5 m l 于层析柱上 ,
当最后那部分样液进人色谱柱时 , 立即加洗
脱液 I , 以洗脱胡萝 卜素再改用洗脱液 I 洗
脱总叶黄素 。 收集这一馏分并以洗脱液 l 定
容至 50 m l 用于测定 。
1
.
5 仪器的校正
于 U V 一 2 1 0 0 上 用 标 准 工 作 液 于
4 0 0 n rn 一 6 0 0 n m 之 间 扫 描 吸 收 光 谱 , 在
4 7 4 n m 附近应有一吸收峰 。 在 4 7 4 n m , 狭缝
宽度为 0 . 03 时 , 工作吸收值应为 。 . 5 6 1 。 仪
器若不工作在此条件下 , 则应求出仪器校正
因子 f 一 0 . 5 6 1 / A , 47 4 , 此处 sA 47 4 为工作
液 , 在 4 7 4n m 处的实测吸收值 。
.1 6 样品的测定及计算
将定容的馏分于 4 7 4n m 处 以洗脱液 I
为参比测定其吸光度 A 4 7 4 ,并按下式进行计
算 :
总叶黄素 (m g / k g ) 一 ( A 4 7 4 火 f x v 。 只
V
、
) / ( 2 3 6 X b 只 W K V Z )
式中 : f 为仪器校正因子 ;
2 36
: 为给定波长下反式叶黄素的 a 值 ;
b
: 为吸收池长度 (C M ) ;
V o
: 上层液相体积 (为 S Om l ) ;
V
z :
V
Z :
( m l ) ;
W
:
馏分定容后的体积数 ( m l ) ;
用 于 色谱分离 的提取液体积数
取样量 (g )
结果与讨论
2
.
1 胡萝 卜素与叶黄素在柱上保留行
为 叶黄素分子 中两个六元环上的 3 , 3 `位
上各有一酚经基 , 而胡萝 卜素没有ljL 。 故叶黄
素分子的极性要 比胡萝 卜素大 。 因此 , 在氧
化镁硅藻土混合柱上两者的保留行为不同 ,
柱子对叶黄素的吸附性大于胡萝 卜素 , 两者
可在此柱子上得到分离 。 当用非极性溶剂正
已烷一丙酮洗脱时 , 胡萝 卜素先被洗脱而叶黄
素保留在柱子上 。 当加大洗脱液极性时 (加
入甲醇 ) , 叶黄素即被洗脱 ,这与文献 .3[ ,〕所报
道相符 。 实验结果表明 : 当用 1写胡萝 卜素食
品添加剂如同样品作同样处理后 , 过柱时以
洗脱液 I 脱 , 可看到黄色色带快速下移而不
在柱子上保留 。 但对于含叶黄素醋的样 品用
洗脱液 I 洗脱时 , 色带几乎不移动 ; 而改用
洗脱液 诬时 , 色带下移而被洗脱 。
.2 2 叶黄素和胡萝 卜素的洗 脱曲线
见图 1 、 图 2 。
从以上两图可知胡萝 卜素与叶黄素可以
完全分开 , 从而在测总叶黄素时可以避免胡
萝 卜素的干扰 。 对于叶黄素的测定只须收集
s m l一 2 5 m l 间的馏分即可 。
2
.
3 叶黄素 、 胡萝 卜互及苏丹红 I 的吸
收光谱
见图 3 。
2
.
4 放置时间对测定结果的影响
文献 「3 ] 、 〔7 ] 均要求样品在经过提取 、
皂化 、 定容后还需于暗处放置 1 小时 , 然后
再作分离测定 。 我们认为对总叶黄素的测定 ,
这一步是不必要 的 , 对此我们通过实验得到
关系曲线图 4 。
吸
光
度 o · 1 5
1 1 1
0
.
0 9
0
。
0 3
0
.
0 0
8
.
0 l2 1 6
.
0 2 0
.
0 m 1
洗脱剂 : 正已烷一丙酮 9 ( , 1)
图 l 胡萝 卜素的洗脱图
0
.
0 9
0
.
0 3
0
.
0 0
1 0
.
0 12
.
0 1 6
.
0 2 0
.
0 m l
洗脱剂 : 正 已烷一丙酮一甲醉 (8 , 1 , l)
图 2 叶黄素洗脱图
护
,
.
户 .叱货火
一护r从
4 0 0 6 0 0
波长 ` , l m )
a 为叶黄素
图 3 叶黄素 、
b 为胡萝索 C 为苏丹红
胡萝 卜表及苏丹红 I 的吸收光谱
.1 1 2
.
从图 4可以看出 , 放置时间对测定结果
影响不大 , 故对总叶黄素的测定若要求快速
的话则完全可以立即进行 , 只要上下分层即
可 。 另外在定容后的 2 小时内测定结果变化
不大 , 故能满足快速测定的要求 。
2
.
5 狭缝宽度对结果的影响
文献 「3 ] 中提到 , 在校正仪器时要求狭
缝宽度为 0 . 03 , 在我们实验中 , 仪器的最小
狭缝宽度为 0 . 1 , 与文献要求在差异 。 为此对
狭缝对测定结果的影响作了试验 , 得到如图
5 曲线 。
11及
光
度 0 . 4 7
11及
光
度 0 . 4 8
。一 .一 。 ~ ~ ~ ~ .
0
.
4 1 0
.
4 4
0
.
3 5
0 3 0 6 0 9 0 1 20
时间 (分 ) 1
.
0 3
。
0 5
.
0
于夹缝 ( ,: : 1 1 、
图 4 放置不同时间测定的结果
从图 5 的结果可知 , 狭缝增大吸光度也
增大 , 为了尽可能减小测量误差应尽量采用
小的缝宽 , 但缝宽减小后会给读数带来困难 ,
因为缝宽减小后读数会不稳定 。 我们认为采
用 .0 3 或 .0 5 的狭缝宽度较合适 。
3 结 语
本文所报道的方法也可用于其它干植物
及产品中叶黄素与胡萝 卜素的分离测定 。 相
信今后对食品中的添加剂叶黄素的分离测定
也会有一定的参考价值 。
参 考 文 献
.l 黄梅丽 , 姜汝熹 · 江小梅 . 食品色香味化学 . 北京 :
0
·
4 0 L
图 5 不同狭缝宽度测定的结果
轻工业出版社 1 98 7 : 1 1
2
· 江苏新医学院编 . 中药大辞典 , 上册 . 上海科技出版社
1 9 9 3
: 7
3
.
F
.
W
.
Q u a
e
k
e n b u
s
h
, 入1 . A . D y e r · R . L . S m a ll idg e ,
J
. 产0 A C · 19 70 : 5 3 ( l ) : 18 1一 18 5 .
4
.
F
.
W
.
Q
u a e k e n b
u s h
.
J
.
A O A C
.
1 9 7 0 ; 5 3 ( 1 )
: 1 8 6
.
5
.
eB
n n y E
.
K n u e k l e
s .
E
.
M
.
B i e k o f f
,
G e o r g e Q
.
K o h l e r
·
J
.
A O A C
.
1 9 72 ; 5 5 ( 4 )
: 1 2 0 2
6
.
A r v i n L
.
L i v i n g s t o n
,
R i e h a r d E
.
K n o w l e s
,
G e o r g e 0
.
K o h l e r
.
J
.
A O A C
.
19 7 3 ; 5 6 ( 6 )
:
13 7 8
.
7 国家商检局 A O A C 编译委员会编译 . A O A C 公定分析方
法 . 第 巧 版 . 北京 : 中国科学技术出版社 19 9 0
(上接 1 0 2 页 )
参 考 文 献
1
.
M a r t
s .
R
.
W
.
B l a h a
.
J
6 6
。
1 4 2 1
.
2
.
I k i t z
.
e t
.
a l ( 1 9 7 3 ) J
.
3
.
E
.
T
.
H a l l
.
J
,
A O A C
,
4
.
L o u i e
.
e t
.
a [ ( 19 8 5 ) J
( 1 9 8 3 ) J
.
A O A C V O L
.
A O A C
.
V O L 5 6
, 3 78 ~ 3 8 1
.
V O L 5 7
.
1 0 6 8 ~ 1 0 7 3
.
A O A C
.
V O L
.
6 8
5
.
W
e s t
o
,
G ( 19 6 8 ) A e t a
,
C h e m
.
cS a n d
, 2 2
,
2 2 7 7
.
6
·
G a g e ( 1 9 6 1 ) J
.
C
.
A n a ly s r
,
8 6
, 4 5 7
.
7
.
Z e l e n k
.
V ( 1 97 3 ) T a la n t a 2 0
, 1 1 5
.
8
·
N o r d
,
P
.
J ( 1 9 77 ) M e r e u r y i n H
.
A r e h i r e s o f E n v i r o m e n
-
t a l H e a l t h 2 7 ( l )
: 4 4
.
9
· 食品卫生国家标准汇编 G B 50 09 . 17 一 85 .
10
.
L o u i e H
,
W ( 1 1 9 8 3 ) A n a ly
s t 。 10 8
.
3 13 ~ 1 3 1 7
.