全 文 ：天山堇菜中总黄酮的提取和测定
沈小燕 , 解成喜 , 邓卫萍 , 艾尔肯·艾米尔
(新疆大学理化测试中心 , 乌鲁木齐 830046)
摘　要:以芦丁为对照品 , NaNO2-AlC13-NaOH体系为显色剂分光光度法测定天
山堇菜的总黄酮类含量 。通过回流法和超声法提取总黄酮 , 再进行比较 , 从而
得到最佳的提取方法-超声法是合适的提取方法。确定了提取总黄酮的适当溶
剂 、时间和显色剂用量。建立了芦丁浓度-吸光度关系的回归方程为 A =
14.675c-0.0201 , r=0.9999。平均回收率为 100.24%。RSD为 1.79%(n=5)。
方法简单 、可行 、重现性好。
关键词:分光光度法;天山堇菜;回流法;超声法;总黄酮
　　天山堇菜 , 维药名为比那夫西(Herba Violae
tianshanicae)是堇菜科(Violaceae)植物天山堇菜 Vi-
ola tianshanica Maxim 的干燥全草 。其气微味微苦
辛 , 凉 , 清热解毒 , 具有调理 、软化 、发汗的作用 。
主要用于轻泻异常胆液质 , 调节血液热性过盛 ,
生津止渴 , 发汗退烧。临床用于热性感冒 , 发烧 ,
头痛 , 咽痛 , 肢肿 , 小儿惊厥 , 也可外用于疔疮肿
痛等[ 1] 。其药用部位是全草 , 全草经预试检出含挥
发油 、黄酮类 、生物碱 、氨基酸 、粘液质皂苷 , 鞣
质等[ 2] 天山堇菜作为一种维吾尔民族药在新疆民
间应用 , 尤其是在新疆和田地区广泛应用。国内
外学者对其化学成分及药理作用做了一些研
究[ 3 ～ 6] , 本实验是在前人的基础上对天山堇菜中
的黄酮类化合物的提取做了进一步研究 。
1　实验部分
1.1　仪器和试剂
λ-17紫外-可见光谱仪(美国 PE公司)、 LA204
分析天平 、 RE-52A型旋转蒸发仪 、KQ5200B超声
波仪芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);乙
醇(分析纯);NaNO2 、AlCl3 、NaOH 和石油醚(60 ～
90 ℃)均为化学纯;实验用水为蒸馏水;天山堇菜
(购于新疆维吾尔医医院)。
1.2　溶液的制备
1.2.1　标准溶液的制备 　精密称取芦丁标准品
20 mg , 置于 100 mL 容量瓶中 , 加乙醇适量 , 使芦
丁标准品完全溶解 。再用乙醇稀释至刻度 , 摇匀 ,
配成浓度为 0.2 mg mL的芦丁标准溶液。
1.2.2　样品溶液的制备　a.回流法:精确称取80
℃下干燥 3 h 并粉碎过 60 目筛的天山堇菜粉末
1.0 g , 加 85%乙醇溶液 50 mL 回流提取 6 h , 抽
滤 , 用 85%乙醇洗涤滤渣两遍 , 用适量石油醚脱
色后 , 以85%乙醇定容至 100 mL。
b.超声波法[ 7 , 8] :精确称取 80 ℃下干燥 3 h
并粉碎过 60目筛的天山堇菜粉末 1.0 g , 加 85%
乙醇溶液 50 mL超声提取60 min , 抽滤 , 用85%乙
醇洗涤滤渣两遍 , 用适量石油醚脱色后 , 以 85%
乙醇定容至 100 mL。
1.2.3　最大吸收波长的确定 　准确移取 0.2
mg mL芦丁标准溶液 8.0 mL 于 25 mL 容量瓶中 ,
加水至约 10 mL , 加入 5%NaNO2溶液 0.7 mL , 摇
匀 , 静置 5 min后 , 加入 0.3 mol L AlCl3 溶液 0.7
mL , 摇匀 , 静置5min , 加入 1mol L NaOH 溶液4.0
mL , 用水定容至刻度[ 9] 。对此溶液在 450 ～ 750 nm
区间扫描 , 确定最大吸收波长为 510 nm。故以下
实验测定吸光度的波长均采用 510 nm。芦丁标样
显色后的扫描曲线如图 1所示 。
1.2.4　标准曲线的绘制　准确移取 0.2 mg mL 芦
丁标准溶液 1.0 , 2.0 , 3.0 , 4.0 , 5.0 , 6.0 mL , 分
别置于 25 mL容量瓶中 , 加入 5%NaNO2 溶液 0.7
mL , 摇匀 , 静置 5 min后 , 再加入 0.3 mol L AlCl3
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第 27卷增刊
2008 年 12 月　　　　　　　　　　　　 分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory　　　　　　　　　　　　Vol.27.Suppl.2008-12
作者简介:沈小燕(1983-), 女 , 硕士研究生;E-mail:shen-xiaoyan2007r@yahoo.cn、 xiecx@xju.edu.cn
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2008.0589
溶液 0.7 mL , 摇匀 , 静置5min , 加入1 mol L NaOH
溶液4.0 mL , 用 85%乙醇定容至刻度 , 摇匀。以
试剂空白做参比 , 在波长 510 nm 处测定吸光度 。
测定结果见表 1。以吸光度 A为纵坐标 , 以芦丁标
准溶液的浓度 C(mg mL)为横坐标 , 绘制校准曲
线 , 如图 2 所示。回归方程为:A =14.675c -
0.0201 , R2=0.9999。线性范围为:8 ～ 48μg mL。
图 1　芦丁标样显色后的扫描曲线
表 1　芦丁标准溶液 C-A 数据
序号 1 2 3 4 5 6
c (mg mL) 0.008 0.016 0.024 0.032 0.040 0.048
A 0.096 0.217 0.331 0.449 0.569 0.683
图 2　芦丁标准曲线
1.2.5 　样品总黄酮含量的测定 　准确移取按
1.2.2 b法所制得的溶液 5份各 10 ～ 25 mL 容量瓶
中 , 按校准曲线项下测定吸光度值 , 根据如下公
式计算样品中总黄酮的含量 , 测定结果见表 2 。从
表2中可看出 , 样品的总黄酮含量为 6.969 mg g ,
RSD为 0.386%(n=5)。
公式:X=C×V1×V2
M×V3
式中:X -样品中总黄酮含量 , mg g;C-校准曲
线中黄酮的浓度 , mg mL;V1-稀释体积 , mL;(实
验中 V1=25 mL)V2-样品溶液的体积 , mL;(实
验中 V2=100 mL);M-样品质量 , g;V3-取样体
积 , mL(实验中 V3=10 mL)。
表 2　样品测定结果
序号 吸光度 A c (mg mL) 总黄酮含量 (mg g)
平均值
(mg g)
1 0.389 0.0279 6.969 6.969
2 0.387 0.0277 6.935
3 0.391 0.0280 7.003
4 0.390 0.0279 6.986
5 0.388 0.0278 6.952
2　结果与讨论
2.1　显色剂的用量
移取 0.2 mg mL芦丁标准溶液 3.0 mL , 置于
25 mL容量瓶中 , 改变各显色剂的用量 , 依次测定
吸光度值。加入的显色剂NaNO2 、AlCl3和NaOH 分
别在 0.4 ～ 0.8 mL 、0.4 ～ 0.8 mL 、4.0 ～ 8.0 mL 范
围内 , 测定的吸光度值基本不变 。实验过程中 , 选
用NaNO2 、AlCl3 各 0.7 mL , NaOH 4.0 mL。
2.2　提取方法的选择
2.2.1　回流法　提取溶剂浓度的选择:按 1.2.2a
法改变乙醇浓度提取所得溶液按校准曲线项下测
定总黄酮含量 , 结果如表 3。以 85%乙醇溶液提取
黄酮含量最高 , 并且提取液清澈透明 , 因此本实
验选 85%乙醇溶液作为提取溶剂。
表 3　溶剂浓度对提取效果的影响
乙醇浓度 % 吸光度 A 总黄酮含量 (mg g)
45 0.297 5.400
65 0.310 5.624
85 0.345 6.220
100 0.314 5.692
提取时间的选择:按 1.2.2a法改变回流时间
所得溶液按校准曲线项下测定总黄酮含量 , 结果
如表4。由测定结果可知 , 提取时间选用6 h即可 。
2.2.2　超声波法　超声浓度的选择:按 1.2.2b法
分别用 45%, 65%, 85%, 100%的乙醇超声提取
所得溶液按标准曲线下的方法测定总黄酮的含量 ,
结果见表 5。说明 85%提取总黄酮较完全 , 故本实
验采用 85%乙醇做提取溶剂。
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表 4　提取时间对提取效果的影响
提取时间 h 吸光度 A 总黄酮含量 (mg g)
2 0.321 5.811
4 0.334 6.032
6 0.346 6.237
8 0.339 6.118
10 0.317 5.743
表 5　提取浓度对提取效果的影响
提取浓度 % 吸光度 A 总黄酮含量 (mg g)
45 0.336 6.409
65 0.358 6.441
85 0.384 6.884
100 0.361 6.492
超声时间的选择:按 1.2.2b 法改变超声时间
所得溶液按标准曲线项下的方法测定总黄酮的含
量 , 结果见表 6。说明 60 min提取总黄酮较完全 ,
故本实验采用 60 min作为提取时间 。
表 6　超声时间对提取效果的影响
超声时间 min 吸光度 A 总黄酮含量 (mg/ g)
20 0.354 6.373
40 0.372 6.680
60 0.386 6.918
80 0.379 6.799
通过以上数据的对比 , 可以看出超声法优于
回流法 , 故在以下实验均采用超声法:以 85%的
乙醇为提取剂 , 超声时间 60 min。
2.3　精密度试验
准确移取 0.2 mg mL 芦丁标准溶液 3 mL于 25
mL容量瓶中 , 以 85%乙醇定容 , 测定总黄酮含
量。由回归方程计算分别为:0.0238 、 0.0238 、
0.0235 、 0.0235 、 0.0237 、 0.0235 mg g , RSD 为
1.79%(n=5)。
2.4　重现性试验
精密称取 5 份天山堇菜样品 , 按样品制备方
法制备样品 , 按校准曲线项下测定总黄酮含量 ,
RSD为 0.034%(n=5), 结果见表 7。
表 7　重现性试验
序号 样品质量 总黄酮含量 (mg g) 平均值 (mg g)
1 1.0011 6.977
2 0.9998 6.954
3 1.0007 6.975 6.964
4 1.0002 6.966
5 0.9999 6.950
2.5　加标回收试验
向已知含量的样品中添加一定量的芦丁标准
品 , 按校准曲线项下测定总黄酮含量 , 计算回收
率 , 结果见表8。
表 8　加标回收试验(n=5)
序号 样品中黄酮量 mg 加标量 mg 增加量 % 黄酮总量 mg 回收率 % 平均回收率 %
1 0.6975 0.2 28.67 0.9048 100.81
2 0.6925 0.4 57.76 1.1010 100.78
3 0.7000 0.6 85.71 1.2939 99.53 100.24
4 0.6975 0.8 114.70 1.5111 100.91
5 0.6950 1.0 143.88 1.6908 99.16
2.6　稳定性试验
按样品测定的方法配制样品溶液 , 每隔 10
min测定吸光度值 , 测试结果见图 3。可以看出 ,
比色溶液显色后 , 在1小时内吸光度值基本不变 ,
表明黄酮类化合物与铝盐生成络合物显色是稳定
的。
3　结论
与回流过程相比 , 超声空化作用加速了提取
速度 , 缩短了提取时间 , 进而提高了天山堇菜中
总黄酮类物质提出率。故采用超声 60 min的提取
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条件下测定天山堇菜的总黄酮含量。以 85%乙醇
超声提取 60 min , 用适量石油醚脱色 , 用 5%
NaNO2 溶液 0.7 mL 、 0.3 mol L AlCl3 溶液 0.7 mL 、
1 mol L NaOH 溶液 4.0 mL 显色后 , 在510 nm处测
定 , 天山堇菜中总黄酮含量为 6.969 mg g , 精密度
为1.8%, 回收率为 100.24%。
图 3　吸光度随时间变化曲线
超声空化效应引起组织破碎 , 震荡和热效应
加快了物质的转移[ 10] , 明显提高提取效率。
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