全 文 ：微量显色法测定五指毛桃抑菌活性
陈 琼，叶思霞 (广东食品药品职业学院，广东广州 510520)
摘要 ［目的］采用微量显色法评价五指毛桃水提物对常见食源性致病菌的抑菌活性，并与传统抑菌测定方法比较，探讨其灵敏度。［方
法］以五指毛桃根为材料，采用微量显色法、滤纸片扩散法和倍比稀释法研究五指毛桃水提取物的抑菌活性。［结果］噻唑蓝法检测五指
毛桃水提物抑菌活性条件优化:菌液初始浓度 105 ～106 CFU/ml，噻唑蓝终浓度 0． 5 mg /ml;在该试验条件下，五指毛桃水提取物对大肠
杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，最低抑菌浓度分别为 11． 21和 14． 07 mg /ml。滤纸片法和倍比稀释法检测出五指毛桃水提物具
有抑菌活性。［结论］噻唑蓝法比传统抑菌测定方法的灵敏度高，更适用于颜色较深的植物提取物的抑菌活性检测。
关键词 显色法;五指毛桃(RADIX FICI HIRIAE);抑菌
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)15 －08452 －03
Antibacterial Activity of RADIX FICI HIRTAE by Chromotest Microassay
CHEN Qiong et al (Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou，Guangdong 510520 )
Abstract ［Objective］Compared with the traditional antibacterial methods，antibacterial activity of water extracts from RADIX FICI HIRTAE
on the food-induced pathogenic bacteria was researched． ［Method］With RADIX FICI HIRTAE as the materials，antibacterial activity of water
extracts from RADIX FICI HIRTAE was researched by chromotest microassay，filter paper dispersion method and doubling dilution method．
［Result］The optimal condition of thiazolyl blue (MTT)method was 105 － 106 CFU /ml initial concentration of bacterial liquid，0． 5 mg /ml fi-
nal concentration of MTT． Under this condition，water extracts of RADIX FICI HIRTAE showed bacteriostatic action against Escherichia coli．
and Staphylococcus aureus;and the minimal inhibitory concentrations were 11． 21 and 14． 07 mg /ml，respectively． Results of filter paper dis-
persion method and doubling dilution method showed that water extracts of RADIX FICI HIRTAE had bacteriostatic activity． ［Conclusion］
Compared with the traditional antibacterial methods，MTT method had the advantages of high sensitivity，which was more suitable for the anti-
bacterial activity detection of plant extracts with deep color．
Key words Microassay;RADIX FICI HIRTAE;Antimicrobial activity
基金项目 广东中医药管理局资助项目(20111277)。
作者简介 陈琼(1974 － ) ，女，江西南昌人，讲师，硕士，从事食品化学
研究，E-mail:chenq@ gdyzy． edu． cn。
收稿日期 2012-01-31
五指毛桃(RADIX FICI HIRTAE)是道地的中国岭南药
材，也是中国广东地区广泛应用的最具特色的野生食材。其
俗名有牛奶木、土黄芪、火龙叶和九龙根等，为桑科植物粗叶
榕(Ficus hirta Vahl．)的干燥根，也称为“五爪龙”，有健脾补
肺、行气利湿和止咳化痰之功效［1 －3］。五指毛桃功似黄芪而
无黄芪之燥热，更适合岭南气候，广东地区群众惯用五指毛
桃根煲鸡、煲猪骨、猪脚汤作为保健汤饮用，其汤味道鲜美、
气味芳香、营养丰富，具有很好的保健作用，而且对支气管
炎、气虚、食欲不振、慢性胃炎及产后少乳等病症也有一定的
作用［1 －3］。因此，五指毛桃既是药品又是食品，是极具开发
潜力的岭南植物资源，深入开发、充分利用这一特色种质资
源对植物资源开发领域有重要的研究意义。
现有的研究证实五指毛桃具有调节免疫功能、抗炎和镇
咳等功效［4 －6］。五指毛桃的体外抗菌活性亦有报道，但由于
植物材料提取物的颜色较深，采用常规纸片琼脂扩散法和试
管肉汤稀释法进行研究的误差较大。
噻唑蓝(Methylthiazol tetrazoliam，MTT)是一种能接受氢
原子的染料，活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原
MTT，同时在细胞色素 C的作用下，生成蓝色(或蓝紫色)不
溶于水的甲臜(Formazan) ，而死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，
加入 MTT 不会有反应。在一定的细胞数量范围内，甲臜的
吸光值与活细胞数量呈正相关［7］。目前，噻唑蓝法一般应用
于生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细
胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等，具有灵敏度高和经
济节约的特点［8 －10］。关于噻唑蓝法用于植物成分的抑制植
物病原菌活性的研究也有一些报道［11 －12］。试验拟用噻唑蓝
显色法来测定五指毛桃的抗菌活性，并与传统抑菌活性测定
方法比较，以期建立适用于五指毛桃等植物材料抑菌活性测
定的快速检测方法。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。五指毛桃，购于广州二天堂药店，经鉴定
为 RADIX FICI HIRTAE。
1． 1． 2 主要仪器。冷冻干燥机，购自德国 Christ 公司;旋转
蒸发仪，购自 BUQHI公司;酶标仪，购自美国 Thermo公司。
1． 1． 3 主要试剂。营养肉汤培养基，购自广州环凯生物公
司;噻唑蓝，购自 sigma公司;96孔板，购自 COSTA公司;二甲
基亚砜、甲醇为国产分析纯，市售。
1． 1． 4 供试菌株。大肠杆菌(Escherichia coli) ，批号:
ATCC259222;金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ，批号:
ATCC 25923;均由广东省中药研究所提供。
1． 2 方法
1． 2． 1 噻唑蓝的配置。用浓度 0． 2 mol /L，pH 7． 2 的磷酸缓
冲液配成 20 mg /ml 的工作母液，经 0． 22 μm微孔滤膜过滤
除菌，避光 4 ℃ 保存，使用时稀释至工作浓度。
1． 2． 2 五指毛桃提取物的制备。称取五指毛桃全草 50． 00
g，按料液比 1∶10(g /ml)加入蒸馏水浸泡 1 h，加热煮沸后文
火煎煮 1 h，过滤，滤渣按料液比 1∶5(g /ml)加入蒸馏水，煎煮
30 min后过滤，合并 2次滤液，旋转蒸发浓缩后冻干，称量后
密闭冷藏备用。
1． 2． 3 菌液的制备。将病原菌菌株分别在斜面培养基上活
责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(15):8452 － 8454，8461
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.15.108
化培养 24 ～48 h，挑取单菌落于液体培养基中悬浮培养 10 ～
14 h(液体培养基置于温度 30 ℃，转速 130 r /min 的摇床培
养) ，取对数生长期的菌悬液等倍稀释，于波长 600 nm 处测
定吸光值，同时测定稀释前菌悬液菌落数，建立菌落形成单
位(CFU)对数和吸光值(OD)的线性方程。使用时用培养基
稀释菌悬液至所需的工作浓度。
1． 2． 4 噻唑蓝法抑菌试验。
1． 2． 4． 1 初始菌量的确定。取对数期菌液，用培养基调整
浓度至5 ×108、108、5 ×107、107、5 ×106、1 ×106、1 ×105 和1 ×
104 CFU /ml ，分别取上述各浓度菌液 90 μl 于 96 孔板孔中，
30 ℃下振荡(80 r /min)反应22 h后，加入10 μl MTT(终浓度
0． 5 mg /ml) ，于 30 ℃(80 r /min)作用 3 h，然后于 2 500 r /min
离心 10 min，小心吸弃上清液，然后加入 200 μl 的 DMSO，于
30 ℃(80 r /min)反应 30 min，再在 10 000 r /min离心 10 min，
小心吸取上清液到另一新 96孔板中，于波长 570 nm处测量
吸光值，重复 3次。
1． 2． 4． 2 噻唑蓝工作浓度的确定。于 96 孔板中每孔加入
90 μl浓度 1 ×108 CFU /ml的菌液后，分别加入 10 μl不同浓
度的 MTT，使 MTT 终浓度为 0． 031 3、0． 062 5、0． 125、0． 25、
0． 50、1． 00、1． 50和 2． 00 mg /ml，其他步骤按“1． 2． 4． 1”，重复
3次。
1． 2． 4． 3 五指毛桃抑菌活性的测定。于 96 孔板每孔加入
90 μl浓度为 1 × 105 CFU /ml 的菌液，提取物用浓度 20%甲
醇溶解后按不同比例稀释，取 10 μl 不同稀释度提取液分别
加入菌液后混匀(对照组为 90 μl 菌液加 10 μl 浓度 20%甲
醇) ，于 30 ℃下振荡(80 r /min)反应 16 ～ 22 h后，每孔加入
100 μl的MTT，使MTT终浓度为0． 50 mg /ml，然后于30 ℃下
振荡(80 r /min)反应 3 h，接着于 2 500 r /min离心 10 min，小
心吸弃上清液，然后加入 200 μl 的 DMSO，于 30 ℃下振荡
(80 r /min)反应 30 min，显色的液体于 10 000 r /min离心 10
min，取上清液于波长 570 nm处测吸光值(用 DMSO 调零) ，
重复 3次。抑菌率计算公式为:
抑菌率(%)=(无药对照 －药液)/(无药对照 － DMSO
调零)×100。
1． 2． 5 滤纸片扩散法观测抑菌效果。在无菌条件下，将直
径为 6 mm的圆形滤纸片浸入梯度稀释的样品溶液中，1 h后
取出，沥干，贴在涂布菌液的平板上，每皿放入 3 片，用无菌
水作空白对照，于 37 ℃培养 24 h，然后用游标卡尺测量各抑
菌圈直径大小(mm) ，取平均值评价其抑菌效果，重复 3次。
1． 2． 6 微量肉汤倍比稀释法确定最低抑菌浓度 MIC。参
照 CLSI M7-A5(2000)的方法，并稍加更改［13］。采用营养肉
汤培养基稀释样品成梯度浓度后，分配到 96 孔板上，每孔
100 μl;调整菌液浓度，将稀释后的菌液接种到孔内，每孔 5
μl，使每孔中细菌的最终测试浓度为 5 × 104 CFU /孔，设置
生长对照孔(不加样品)和阴性(不接种菌)孔。肉眼观察，
并在波长 600 nm处测定各孔吸光值，当生长对照孔生长良
好，其他孔随样品浓度升高，菌株生长梯度受抑制，以不生
长的最小样品浓度为最小抑菌浓度(MIC)。每个试验重复
3次，3次结果若不完全相同，则按以下方法判定:如果 2 次
结果相同且与另一次的 MIC 值仅相差 1 个稀释度，取相同
的 2次结果为最终结果;如果 3 次都不同，或 2 次结果相同
但与另一次的 MIC值相差超过 1个稀释度，则重复试验直至
符合要求。
1． 2． 7 数据分析。采用 Excel2007 进行方差分析，以回归分
析法计算回归方程、R和半抑制浓度 IC50。
2 结果与分析
2． 1 噻唑蓝法抑菌条件的优化
2． 1． 1 菌液浓度对显色结果的影响。图 1 表明，处于对数
生长期的 2个菌株初始菌量的改变会造成甲臜吸光值的波
动，但吸光值比较接近。当初始菌量在 1 × 105 ～ 1 × 106
CFU /ml时，甲臜的吸光值接近峰值，且在线性范围内。因此
选择 1 ×105 ～ 1 ×106 CFU /ml为初始菌量较为适宜。
注:a为 E． coli 培养 22 h后加入 MTT;b为 S． aureus培养 22 h后
加入 MTT。
图 1 初始菌液浓度对甲臜的吸光值的影响
2． 1． 2 噻唑蓝工作浓度对显色结果的影响。图 2 表明，随
着 MTT浓度增加，甲臜的吸光值随之增大。当 MTT终浓度
小于 0． 5 mg /ml时，MTT浓度与甲臜的吸光值的回归方程为
Y =0． 368X + 0． 042，R2 = 0． 992 (E． coli．) ;Y = 0． 316X +
0. 034，R2 = 0． 990 (S． aureus)。当 MTT 终浓度超过 0． 5
mg /ml时，吸光值增加速度减缓(E． coli．)或吸光值基本保持
稳定(S． aureus)。因此，在 MTT终浓度为 0． 5 mg /ml时，甲臜
吸光值在线性范围内，故选择MTT的终浓度为 0． 5 mg /ml。
注:a为 E． coli;b为 S． Aureus。
图 2 MTT浓度对甲臜的吸光值的影响
2． 1． 3 不同方法评价五指毛桃的抑菌活性。滤纸片扩散
法是检测药物抑菌效果常用的方法，为扩散法中的一种，有
354840 卷 15 期 陈 琼等 微量显色法测定五指毛桃抑菌活性
效药物可致纸片周围出现一圈不长菌的区域，称抑菌圈。
抑菌圈越大，表示药物抑菌作用越强，即细菌对该药物敏感
度越高。由表 1 可知，滤纸片扩散法检测出 100 和 50
mg /ml的五指毛桃提取液对 E． coli 和 S． aureus 均有抑制作
用;当五指毛桃浓度小于 25 mg /ml 时，对 E． coli 和 S． aureus
均无抑制作用。
表 1 滤纸片扩散法检测五指毛桃提取物的抑菌效果
浓度∥mg /ml
抑菌圈大小∥mm
E． coli S． aureus
100． 00 12． 3 ±1． 3 15 ±1． 8
50． 00 7． 1 ±1． 1 8． 5 ±1． 2
25． 00 ND ND
12． 50 ND ND
6． 25 ND ND
注:ND为未见抑菌圈。
由表 2可见，当五指毛桃提取液浓度为 25 mg /ml，倍比
稀释法检测出 E． coli不能生长;浓度小于 12． 5 mg /ml 时，可
以观察到因为菌生长导致的浑浊;随着浓度降低，浑浊程度
越大，说明菌量增大。当五指毛桃提取液浓度为 25 mg /ml
时，可以观察到因为菌生长导致的浑浊;随样品浓度降低，浑
浊越严重，说明对菌株抑制减弱。当五指毛桃提取物浓度大
于 25 mg /ml时，由于提取液浓度较深，导致无法准确判断
E． coli和 S． aureus是否生长。
由表 3 可知，噻唑蓝法检测出五指毛桃对 E． coli 和
S． aureus的 IC50分别为 11． 21和 14． 07 mg /ml，MIC分别为 25
和50 mg /ml;而滤纸片扩散法无法检测出 IC50和MIC;倍比稀
释法由于提取物颜色较深，在浓度超过 50 mg /ml 时造成干
扰，很难判断是否长菌，也无法准确检测出 IC50和 MIC。
表 2 倍比稀释法检测五指毛桃提取物的抑菌效果
浓度∥mg /ml
浑浊情况
E． coli S． aureus
100 ND ND
50 ND ND
25 － +
12． 5 + + + +
6． 25 + + + + + +
注:“－”为不浑浊，“ +”轻度浑浊，“ + +”中度浑浊，“ + + +”高度
浑浊。
表 3 不同方法检测抑菌效果的比较
提取方法
E． coli
MIC∥mg /ml IC50∥mg /ml 回归方程 R
S． aureus
MIC∥mg /ml IC50∥mg /ml 回归方程 R
MTT法 25 11． 21 y =26． 27ln(x)－23． 17 0． 97 50 14． 07 y =27． 76lnx － 24． 68 0． 95
滤纸片扩散法 ND ND
倍比稀释法 ND ND
注:ND为无法判断。
3 结论与讨论
(1)研究结果显示，使用噻唑蓝法检测植物提取物的抑
菌活性时，菌液初始浓度为 105 ～ 106 CFU /ml，MTT 终浓度
0． 5 mg /ml较为适宜。显色法结果表明，五指毛桃提取物对
E． coli和S． aureus均有抑菌作用，五指毛桃对 E． coli和 S． au-
reus的 IC50分别为 11． 21 和 14． 07 mg /ml，MIC 分别为 25 和
50 mg /ml。
(2)传统的抑菌方法一般采用倍比稀释法和滤纸片扩散
法。倍比稀释法对于无色化合物的抑菌活性是适宜的;但对
于天然植物的提取物，特别是粗提物常常伴有较深的颜色，
倍比稀释法灵敏度会大大降低。另外，倍比稀释法受菌液分
散性影响较大，灵敏度和精密度均不够理想。滤纸片扩散法
的优点是操作简单、结果直观，但无法测出 IC50和MIC。当滤
纸片扩散法未能检出抑菌活力时，即使浓度降低 10 倍，噻唑
蓝法仍能检出其具有抑菌活性。噻唑蓝法在 96 孔板中进
行，所需要样品微量，操作简单快捷，观察结果直观，反应灵
敏、结果可靠。噻唑蓝法是以活菌数量和细胞酶活力为基础
的，生长代谢异常的菌酶活性降低，而传统方法无法区分活
菌和死菌，因此噻唑蓝法可以弥补传统方法的不足，可以用
于植物化合物的抑菌活性测定［14］。
(3)与噻唑蓝法相似，刃天青法(resazurin)也常用于植
物化合物成分的抑菌活性测定、细胞毒性试验、检测对抗生
素的敏感性等试验中［15］。刃天青是一种非荧光染料，在活
细胞的多种还原酶的作用下，可将蓝色的刃天青还原成粉红
色的荧光染料试卤灵(resorufin)［15］。刃天青法在测定无色
化合物的抑菌效果与噻唑蓝法结果一致［16］。该试验的操作
虽然比刃天青法复杂，但减少了培养液的用量，特别是减少
了提取液的颜色对试验的干扰，使测定结果更加准确可靠。
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(下转第 8461页)
4548 安徽农业科学 2012年
扰血小板信号转导通路中的花生四烯酸代谢途径有
关［26 －27］。水杉总黄酮能抗血小板聚集活性、改善血液流变
性，其抗血小板聚集的作用机制可能与抑制血小板释放反
应、增加体内 NO合成及 Ca2 +的拮抗作用有关［28］。
2． 3 抗氧化作用 翁德宝报道，水杉黄酮类化合物具清除
活性氧的能力［29］。
2． 4 抑菌作用 Yoon发现水杉中的化合物 glyptostroboides
能抑制食品中病原微生物的生长［30］。Bajpai 发现水杉提取
物对枯萎病、镰刀菌、辣椒疫病、辣椒炭疽病、菌核病、灰霉病
和水稻纹枯病菌的抑制功效较好;乙酸乙酯提取物对食源性
致病菌(鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌、大肠杆菌、产
气肠杆菌和金黄色葡萄球菌)最低抑菌浓度和最低杀菌浓度
分别为 62． 5 ～250和 125 ～500 mg /ml［31］。杨俊杰发现，水杉
种子挥发物质中含有多种活性成分，其中每培养皿 100 μl的
剂量对大蒜叶枯病菌、小麦赤霉病菌及茶轮斑病菌的抑菌率
均在 60%以上［32］。Bajpai比较了水杉乙酸乙酯提取物、精油
及萃取物(正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇)的抗菌作用，发现
乙酸乙酯提取物抑菌活性最高［33］。姜明凯报道，水杉叶的
甲醇提取物对苹果腐烂病菌、棉花枯萎病菌、葡萄白腐病菌、
葡萄黑痘病菌、瓜果腐霉菌及立枯丝核菌等有抑制活性［34］。
3 小结与展望
水杉提取物具多种生物活性，但其目前的药学研究还不
够深入，尚无临床应用报道。为此应当加强相关研究，对其
进行充分开发并加以保护，探索濒危植物保护的新路子，同
时研究开发新药，为人类健康服务。
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