全 文 :北方园艺2012(16):117~120 ·植物保护·
第一作者简介:肖仲久(1980-),男,湖南武冈人,博士,副教授,现
主要从事植物病原真菌学研究工作。E-mail:xzj198099@
163.com.
基金项目:遵义师范学院“生物学”重点学科资助项目;遵义师范
学院博士启动基金资助项目(ZD2011N16);遵义师范学院贵州省
普通生物实验教学示范中心开放基金资助项目(2011ZN003)。
收稿日期:2012-05-02
贵州省铁树新病害叶枯病病原菌生物学特性研究
肖 仲 久,李 小 霞,许 艾 斌,罗 华 燕,潘 合 俊
(遵义师范学院 生物系,贵州 遵义563002)
摘 要:对贵州省铁树上发生的一种新病害-叶枯病病原菌进行了生物学特性研究,探讨不同
温度、pH、光照、碳源及氮源等条件对该病原体菌丝生长、分生孢子萌发的影响,以期系统掌握该
病原菌的生物学特性,为铁树叶枯病防治提供理论依据。结果表明:铁树叶枯病菌菌丝在10~
35℃温度范围内均能生长,在15~35℃之间孢子均能萌发,菌丝生长和孢子萌发最适温度分别为
30℃和25℃;在pH 2~12之间,病原菌菌丝(孢子)均能生长(萌发),其中pH为6时病原菌菌丝
生长最好,pH为10时病原菌孢子萌发率最高;光照条件对菌丝的扩展和孢子萌发影响不明显;
该病原菌对单糖、双糖、多糖等碳源以及有机氮和无机氮均能利用,其中以蔗糖作碳源时,菌丝生
长和孢子萌发最佳,以硝酸钾作氮源时,菌丝生长最好,供试氮源对分生孢子的萌发均不佳。
关键词:铁树;拟茎点霉;生物学特性
中图分类号:S 436.8(273) 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2012)16-0117-04
铁树(Cycas revolute Thunb)属苏铁科苏铁属常绿
乔木,又名苏铁、凤尾蕉,是苏铁属植物中人们最为熟悉
的一个物种,是国家一级重点保护植物资源。古籍记载
其性味甘、平、涩,有小毒,现医学上很多证据证实其有
体外抑制肿瘤细胞增殖的作用,故常将其水煎剂用于治
疗多种肿瘤[1-3]。另外,铁树树型优雅,叶片别致,宛如孔
雀开屏,广泛用作观赏植物,在世界各地都有栽培,也是
我国传统观赏树种,在我国具有悠久的栽培历史[4]。
近年来,随着医药材料和城市环境美化的需求,铁
树的需求量迅速上升。侵染性病害也日益严重,对铁树
物种资源的保护造成较大威胁,但目前国内外系统地研
究铁树病害的报道较少[5-6]。在贵州遵义市的很多花
圃、公园、庭院及盆栽铁树叶片上发现了一种新的病害,
根据其典型症状命名为铁树叶枯病,在前期对该病原菌
进行了准确鉴定的基础上(另文发表,结合传统及分子
鉴定,病原菌为铁树拟茎点霉(Phomopsis cycadis),Gen-
bank登陆号:JN417709)。现从生长温度、pH、光照、碳氮
源的利用等方面对铁树叶枯病病原菌的生物学特性进
行了较为系统的研究,以便为探明病菌生长与环境条件
的关系,为铁树叶枯病的发生发展规律以及病害的防治
提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
病原菌分离自自然发病的盆栽铁树上(症状如图1),
在PDA培养基上进行常规组织分离和病原菌纯化[7-8],
获得纯培养菌(病原菌分生孢子见图2,包括α和β型2
种孢子,β型不常见)。
图1 自然发病叶片症状 图2 病原菌分生孢子(α和β型)
1.2 试验方法
1.2.1 温度对病原菌的影响 用直径为5mm的无菌
打孔器,沿菌落边缘切取菌龄一致的菌饼置于PDA平
板中央,分别置于5、10、15、20、25、30、35、40℃共8个温
度下培养,观察菌落状况,4d后用十字交叉法测量菌落
直径,3次重复[9]。配制孢子悬液,选用载玻片(凹)萌发
法[7],置于5、10、15、20、25、30、35℃,40℃温度下恒温箱
中保湿培养,3次重复,24h后测定孢子萌发率。
1.2.2 光照对病原菌的影响 菌饼切取方法同1.2.1,
置于3个不同的光照(普通日光灯:20W,距离36cm)环
境:连续光照、连续黑暗、12h光暗交替,25℃下培养4d,
观察菌落状况,然后测量菌落直径,3次重复[11]。配制
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孢子悬液,用载玻片萌发法(方法同上),置于连续光照、
连续黑暗、12h光暗交替环境中,3次重复,24h后测孢
子萌发率。
1.2.3 pH对病原菌的影响 供试pH范围2~12,pH
值间隔为1,切取菌饼的方法同1.2.1,将直径5mm的
菌饼接种于上述不同pH值的PDA培养基上(用0.1%
的NaOH和HCl溶液调配),培养箱中25℃下培养,观
察菌落状况,4d后测量菌落直径,3次重复。把洗脱的
孢子置于不同pH值的PD培养液中,采用载玻片萌发
法,每处理重复3次,24h后测孢子萌发率。
1.2.4 碳、氮源对病原菌的影响 以未添加碳源的
Czapek培养基为基础培养基,按比例分别加入等量的葡
萄糖、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、肌醇、果糖配置成不同碳
源的培养基,灭菌后制成10mL平板,接入菌饼,25℃培
养,4d后观察菌落状况,然后测量菌落直径。以未添加
氮源的Czapek培养基为基础培养基,按比例分别加入等
量的草酸铵、硝酸钙、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠、L-精氨酸、
L-苯丙氨酸配置成不同氮源的培养基,灭菌后将其制成
10mL平板,接入菌碟,25℃培养,4d后观察菌落状况,
然后测量菌落直径。采用1%的上述不同碳、氮源的培
养基(液体),配制孢子悬液,采用凹载玻片萌发法,25℃
条件下保湿培养,3次重复,24h后测定孢子萌发率。
2 结果与分析
2.1 温度对病菌菌丝生长和孢子萌发的影响
温度对铁树叶枯病菌菌丝生长的影响见表1。在不
同温度下菌株生长表现差异显著,10~35℃下菌丝都能
生长,适宜生长温度为15~20℃,最适生长温度30℃,菌
丝生长迅速且菌落致密;10℃以下和35℃以上菌丝几乎
不能生长。孢子萌发试验表明,在温度15~35℃范围,
孢子均能萌发,其中以25℃条件下萌发率最高,为46%,
在温度为10℃以下及40℃以上条件均不萌发(图3)。
表1 不同温度对铁树叶枯病病菌菌丝生长的影响
温度
/℃
菌落直径/mm
重复1 重复2 重复3 平均
菌落状况 差异显著性
5 5.0 5.0 5.0 5.0 - eD
10 6.0 6.0 6.0 6.0 + eD
15 20.0 21.0 22.5 21.2 + cdC
20 29.0 24.5 28.5 27.3 ++ cC
25 42.5 44.5 43.0 43.3 +++ bB
30 72.5 54.5 63.5 63.5 +++ aA
35 13.5 17.5 12.5 14.5 ++ deCD
40 5.0 5.0 5.0 5.0 - eD
注:1.接种菌饼直径为5mm;2.“+++”表示菌落致密;“++”表示菌落较致
密;“+”表示菌落稀疏;“-”不能生长(下同);3.小写字母为0.05极显著水平,大写
字母为0.01显著水平(下同)。
2.2 光照对病原菌生长及孢子萌发的影响
测定结果表明(表2,图4),不同的光照条件下铁树
叶枯病菌菌丝的生长速度差别很小,菌落直径在58.5~
64mm之间,菌落致密;3种光照条件下,孢子萌发率均
图3 温度对分生孢子萌发的影响
在50%左右。说明光照对该病菌菌丝的生长和分生孢
子萌发没有明显的促进作用。
表2 光照对铁树叶枯病病菌菌丝生长的影响
光照状况
菌落直径/mm
重复1 重复2 重复3 平均
菌落状况
差异
显著性
24h光照 62.5 63.0 64.0 63.2 +++ aA
12h光照 60.5 58.5 58.5 59.2 +++ bA
全黑暗 60.5 60.5 59.0 60.0 +++ bA
图4 光照对分生孢子萌发的影响
2.3 pH对病原菌菌丝生长速度的影响
病菌在pH 2~12较宽的范围内均可生长,但存在
显著性差异。最适宜生长的pH为6,菌落扩展速度最
快、菌落致密,直径达45mm(图5);pH在2~12范围内
分生孢子均可萌发,但在pH 10条件下萌发最迅速,萌
发率最高,达55%(图6)。
图5 pH值对病菌菌丝生长的影响
图6 pH值对病菌孢子萌发的影响
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2.4 不同碳源对病菌菌丝生长和孢子萌发的影响
由表3可知,在缺少碳源的条件下(对照1),病原菌
的生长速度也较快,达35mm,但菌落极稀薄,疏松。单
糖、双糖、多糖等碳源均能被该病原菌利用。在供试的
几种碳源中,以蔗糖为碳源的培养基上菌丝扩展最快,菌
落致密,菌落直径达51mm;而以多糖类如淀粉为碳源的
培养基上菌丝生长速度尚可,达36.8mm,但菌丝极其稀
薄,状况较差。孢子萌发试验结果表明,各种碳源的培
养液中,分生孢子均能萌发,尤以蔗糖培养基(液)中,萌
发率最高,达56%(图8)。
表3 不同碳源对铁树叶枯病病菌生长的影响
碳源
菌落直径/mm
重复1 重复2 重复3 平均
菌落状况 差异显著性
对照1 34.0 36.5 35.0 35.2 + cBC
葡萄糖 27.5 30.5 28.0 28.7 +++ dC
蔗糖 52.0 53.0 48.0 51.0 +++ aA
淀粉 37.5 37.0 36.0 36.8 ++ bcB
乳糖 37.5 37.5 45.0 40.0 + bcB
麦芽糖 35.0 37.0 39.5 37.2 ++ bcB
肌醇 42.0 43.0 41.5 42.2 ++ bB
果糖 40.5 41.0 42.5 41.3 ++ bcB
图7 不同碳源上病菌菌丝生长状况
图8 不同碳源对孢子萌发的影响
2.5 不同氮源对病菌生长的影响
由表4和图9可知,在未添加氮源的基础培养基上
(对照2),菌丝扩展速度较快,但是菌落极其稀薄。供试
的无机氮和有机氮氮源都能被该病原菌所利用。以硝
酸钾、硝酸钠、硝酸钙为氮源的培养基上菌丝扩展较快,
菌落致密,菌落直径分别达61.7、51.8、49mm;在以硫酸
铵、L-苯丙氨酸、草酸铵等为氮源的培养基上菌丝扩展
较缓慢,菌落状况较差。孢子萌发试验发现,各种供试
氮源的孢子萌发率均较低,除L-精氨酸外,孢子萌发率
均在10%以下(图10)。
表4 不同氮源对铁树叶枯病病菌生长的影响
碳源
菌落直径/mm
重复1 重复2 重复3 平均
菌落状况
差异显
著性
对照2 49.0 51.0 52.5 50.8 - bB
草酸铵 36.5 34.5 37.5 36.2 ++ eE
L-苯丙氨酸 42.5 46.5 43.5 44.2 + cdCD
硝酸钠 52.5 50.5 52.5 51.8 +++ bB
硝酸钙 50.0 49.0 48.0 49.0 +++ bcBC
L-精氨酸 42.0 38.5 37.5 39.3 ++ deDE
硝酸钾 64.0 61.0 60.0 61.7 +++ aA
硫酸铵 37.0 35.5 34.0 35.5 + eE
图9 不同氮源上病菌菌丝生长状况
图10 不同氮源对孢子萌发的影响
3 结论与讨论
拟茎点霉是重要的植物内生真菌[11-12]和资源真
菌[13],但也是一种重要的植物病原真菌,诸多报道其引
起多种植物病害,为害寄主植物[14-15]。
叶枯病是贵州铁树新病害,在贵州呈爆发之势,为
有效控制该病的发生和蔓延,有针对性地制定防治措
施,对引起该病的病原菌(Phomopsis cycadis)进行了生
物学特性研究,研究结果表明,除光照条件外,不同的营
养、温度、pH等条件对铁树叶枯病菌的菌丝生长和孢子
萌发均有显著影响。该病原菌菌丝在10~35℃的范围
内均能生长,病菌生长和产孢的最适温度分别为30、
25℃,这与该病害在贵州省7、8月高温多雨季节迅速传
播蔓延的发病规律相吻合;pH 2~12范围内病菌均能生
长,病菌生长和产孢的最适pH分别为7、10;以蔗糖作
碳源,该病菌菌丝扩展最快,菌丝致密,孢子萌发率最
高,供试氮源中,以硝酸钾为氮源的培养基上,该病菌菌
丝扩展迅速,菌落致密,各供试氮源对孢子的萌发效果
均较差。该试验的研究结果将为进一步开展该病害病
原学以及病害控制相关研究奠定基础。
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Biological Characteristic of Leaf Blight:A New Cycad Disease in Guizhou Province
XIAO Zhong-jiu,LI Xiao-xia,XU Ai-bin,LUO Hua-yan,PAN He-jun
(Department of Biology,Zunyi Normal Colege,Zunyi,Guizhou 563002)
Abstract:This paper aimed to study the biological characteristics of the pathogen(Phomopsis cycadis)causing leaf blight
on cycad in Guizhou province,the efects of temperature,pH,ilumination,the sources of nitrogen and carbon on the
mycelium growth and the germination of conidiospore of the pathogen were explored,the study of this paper
systematicaly made a research on the biological characteristics of Phomopsis cycadis,it could provide a theoretical basis
for the prevention and control of the cycad disease.The temperature range was 10~35℃for the mycelia growth and
15~35℃for the conidiospore germination of the pathogen,the optimal temperature for mycelia growth and conidiospore
germination were 30℃and 25℃.The pathogen could grow and conidiospore germination with a pH of 2~12,while the
optimal pH was 6.0for mycelia growth and 10for conidiospore germination.Light hardly afected the growth of fungus
mycelium and the conidiospore germination.The pathogen could use monosaccharide,disaccharide,polysaccharide,the best
mycelia growth and conidiospore germination were observed with sucrose as the carbon source,and the pathogen could
use organic and inorganic nitrogen,the best mycelia growth were observed with KNO3as the nitrogen source,but not
suitable for conidiospore germination.
Key words:cycad;Phomopsis cycadis;biological characteristic
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