全 文 ：◎研究原著 ◎ 中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办
CN 34-1206 R , ISSN 1009-2501
http: www.DrugChina.net
2004 Mar;9(3):337-339
2003-10-13收稿　2003-11-28修回
闫军 ,通讯作者 ,男 ,主管药师 ,研究方向:临床药学及制剂开发。
Tel:0531-7931386-8008 　 E-mai l:yjcsl 123@hotmai l.com
咖啡酸 、阿魏酸和香草酸对酪氨酸酶活性的影响
闫 军 ,李昌生 ,陈声利1 ,张君仁2
济南市皮肤病防治院药剂科 ,济南 250001 ,山东;1山东省皮肤病性病研究所
皮肤科 ,济南 250022 ,山东;2山东大学药学院药物分析教研室 ,济南 250012 ,山东
摘要　目的:研究咖啡酸 、阿魏酸和香草酸对酪氨酸
酶活性的影响 ,寻找酪氨酸酶抑制剂 ,从而为治疗色
素增加性皮肤病筛选药物 。方法:酪氨酸酶多巴速
率氧化法体外测定药物干预前后酪氨酸酶活性 ,求
出酪氨酸酶抑制率 。采用 Lineweaver-Burk双倒数法
制得酶动力学曲线 ,推断抑制类型 。结果:3种试药
中仅香草酸对酪氨酸酶具有抑制作用 ,与氢醌比较
无显著差异(P>0.05),咖啡酸 、阿魏酸对酪氨酸酶
具有上调激活作用。结论:香草酸为良好的混合型
酪氨酸酶抑制剂 。
关键词　咖啡酸;阿魏酸;香草酸;酪氨酸酶;抑制剂
中图分类号:R965.1;R758.54
文献标识码:A
文 章 编 号:1009-2501(2004)03-0337-03
皮肤酪氨酸酶即一元酚单氧酶(monophenol mo-
nooxygenase)具有多种特征性催化活性 ,既可以作为
酪氨酸羟化酶 、多巴氧化酶 ,又可以作为 5 ,6-二羟基
吲哚氧化酶 ,是皮肤黑素生物合成的关键酶 、限速
酶[ 1] ,不仅决定黑素合成的速率 ,还是黑素细胞分化
成熟的特征性标志[ 2] 。酪氨酸酶的活性与黑素合成
量有关 ,控制其活力即可控制黑素生成量[ 3] 。国内
外学者常利用抑制酪氨酸酶活性试验 ,研究筛选治
疗皮肤色素沉着症的药物 ,并将一些酪氨酸酶抑制
剂应用到增白美容化妆品中[ 4-9] 。我们选择了 3种
与酪氨酸酶天然底物化学结构相似的有机酸 —咖啡
酸 、阿魏酸 、香草酸 ,测定其对酪氨酸酶活性的影响 。
1　材料与方法
1.1　试剂和仪器　L-多巴(L-DOPA),蘑菇酪氨酸
酶 ,咖啡酸(美国 Sigma公司);阿魏酸 ,香草酸(中国
药品生物制品检定所);氢醌(批号:20010905 ,天津
市天河化学试剂厂);其它试剂均为市售分析纯。
UV-2401分光光度计(日本岛津),AE240电子分析天
平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。
1.2　方法　将 L-DOPA 、咖啡酸 、阿魏酸 、香草酸和
氢醌用 pH 6.8 磷酸缓冲液配成 0.1%的溶液。蘑
菇酪氨酸酶用 pH 6.8 磷酸缓冲液配成 100 U·ml-1
的溶液 。取 pH 6.8磷酸缓冲液 7 ml , 加入 0.1%
(5.071 mmol·L-1)L-DOPA反应液 2 ml 与蘑菇酪氨
酸酶 1 ml(100 U)混合 ,室温放置 5 min 后 ,置于分
光光度计上 300 ～ 600 nm扫描。可见在 475 nm 处有
最大吸收峰(图 1)。同法分别测定 L-DOPA 、蘑菇酪
氨酸酶均未见有吸收。采用酪氨酸酶多巴速率氧化
法 ,在 pH 6.8 磷酸缓冲液中 ,用酪氨酸酶促化多巴
变成多巴醌 ,精确反应 5 min ,有肾上腺素红色 ,总反
应量为 10 ml ,利用分光光度计在 475 nm 处的特定
吸收测定生成多巴醌时的吸收度:A=A(药+L-DOPA+酶)
-A(药+酶)。采用 Lineweaver-Burk双倒数法制得酶动
力学曲线 ,决定药物对酪氨酸酶作用类型 ,用米氏公
式计算 Km 、Vm 。
图 1　酪氨酸酶催化 L-多巴反应生成物光谱图
1.3　数据处理　采用配对 t 检验 ,比较组间药物抑
制酪氨酸酶的活性 。
·337·
2　结果
2.1　药物对酪氨酸酶活性的影响　酪氨酸酶酶促
反应为一斜线 ,调整酶浓度可得同斜率的平行斜线 ,
加入不同药物可得不同斜率的斜线(图 2)。咖啡
酸 、阿魏酸有不同程度的上调酪氨酸酶活性作用 ,香
草酸对酪氨酸酶呈较好的抑制作用 ,且反应 3 min
后的吸收度值与氢醌比较无显著差异(P >0.05)。
见表 1。
图2　药物对酪氨酸酶活性的影响时-量图(药 1 ml+L-多巴
1 ml+酶 1.5 ml)
a:咖啡酸;b:阿魏酸;c:空白对照;d:氢醌;e:香草酸
表 1　药物对酪氨酸酶活性的影响
药物 药量 ml
缓冲液
ml
L-多巴
ml
酪氨酸
酶 ml
3 min
吸引度 抑制率
对照组　1.0 7.5 1.0 0.5 0.0587
　　　　1.0 7.0 1.0 1.0 0.1292
　　　　1.0 6.5 1.0 1.5 0.2033
　　　　1.0 6.0 1.0 2.0 0.2608
　　　　1.0 5.5 1.0 2.5 0.3414
咖啡酸　1.0 7.5 1.0 0.5 0.1733 -195.2
　　　　1.0 7.0 1.0 1.0 0.3427 -165.2
　　　　1.0 6.5 1.0 1.5 0.515 -153.3
　　　　1.0 6.0 1.0 2.0 0.6522 -150.1
　　　　1.0 5.5 1.0 2.5 0.7848 -129.9
阿魏酸　1.0 7.5 1.0 0.5 0.0803 -36.8
　　　　1.0 7.0 1.0 1.0 0.1581 -22.4
　　　　1.0 6.5 1.0 1.5 0.2536 -24.7
　　　　1.0 6.0 1.0 2.0 0.3305 -26.7
　　　　1.0 5.5 1.0 2.5 0.4086 -19.7
香草酸　1.0 7.5 1.0 0.5 0.0453 　 22.8
　　　　1.0 7.0 1.0 1.0 0.1047 　 19.0
　　　　1.0 6.5 1.0 1.5 0.1511 　 25.7
　　　　1.0 6.0 1.0 2.0 0.2077 　 20.4
　　　　1.0 5.5 1.0 2.5 0.2741 　　9.7
氢醌　　1.0 7.5 1.0 0.5 0.0398 　 32.2
　　　　1.0 7.0 1.0 1.0 0.0996 　 22.9
　　　　1.0 6.5 1.0 1.5 0.1515 　 25.5
　　　　1.0 6.0 1.0 2.0 0.1973 　 24.4
　　　　1.0 5.5 1.0 2.5 0.2389 　 30.0
2.2　药物对酪氨酸酶作用类型的判别　抑制剂与
酶结合可通过共价和非共价结合 ,共价结合为可逆
性结合 ,非共价结合为不可逆性结合。可逆性结合
反应完成后 ,反应液中为结合态底物与非结合态底
物达到的动态平衡 , A-E 曲线延长线多于原点与 x
轴交第Ⅰ项限 ,不可逆性结合破坏了酶与底物结合
或酶的催化功能 ,A-E 曲线延长线与 x 轴交第Ⅳ项
限 。咖啡酸 、阿魏酸 、香草酸的 A-E曲线皆多于原
点 ,初步证明 3种试药对酪氨酸酶的抑制作用均为
可逆性的。见表 1 、图 3。
图 3　药物对酪氨酸酶活性影响的反应类型判别
a:咖啡酸;b:阿魏酸;c:空白对照;d:香草酸
2.3　酪氨酸酶活性的动力学观察结果　阿魏酸组
Km 减小 、Vm 减小 ,与空白对照组的曲线相交于第Ⅰ
象限 ,表明阿魏酸对酪氨酸酶具有反竞争型激活作
用 。咖啡酸组 Km 减小 、Vm 增大 ,与空白对照组的
曲线相交于第 Ⅱ象限 ,表明咖啡酸对酪氨酸酶趋于
混合型激活作用 ,香草酸组 Km 增大 、Vm 减小 ,与空
白对照组的曲线相交于第 Ⅱ象限 ,表明香草酸对酪
氨酸酶趋于混合型抑制作用 。见表 2 、图 4。
表 2　酪氨酸酶活性的动力学变化
药物 回归方程 　r Vm μmol·L-1·min-1
Km
mmol·L -1
空白 1 A=1.86×1 S+3.83 0.998 261.3 0.485
咖啡酸 1 A=0.62×1 S+1.56 0.993 639.8 0.400
阿魏酸 1 A=0.57×1 S+4.65 0.992 215.1 0.123
香草酸 1 A=2.60×1 S+4.85 0.996 206.1 0.537
氢醌 1 A=4.20×1 S+2.84 0.997 352.1 1.477
图 4　药物对酪氨酸酶活性影响的动力学影响
a:阿魏酸;b:空白对照;c:香草酸;d:咖啡酸
·338· Chin J Clin Pharmacol Ther 2004 Mar;9(3)
3　讨论
酶抑制剂结构一般与底物相似 ,通过与底物相
似的方式与酶结合 。酪氨酸酶是一种含铜的金属
酶 ,每一个亚基含两个金属铜离子 ,两个铜离子分别
与蛋白质分子中组氨酸结合 ,另有一个内源桥基将
两个铜离子联系在一起 ,构成酪氨酸酶催化氧化反
应活性中心。酪氨酸等物质与酶形成过渡态络合物
时 ,主要是羟基与酶的活性中心上的原子键合而发
生作用[ 8] 。目前 ,从天然产物中寻找酪氨酸酶抑制
剂是一个非常重要途径 ,对位具有极性基团的苯酚
及其衍生物:对羟基肉桂酸 、白藜芦醇 、2-羟基-4-甲
氧基-苯甲醛等均对酪氨酸酶具有抑制作用[ 4-7] 。
香草酸 、阿魏酸 、咖啡酸与酪氨酸均是生物合成
桂皮酸途径中重要的苯丙酸类有机酸 。阿魏酸 、咖
啡酸 、酪氨酸和 L-DOPA 均具有 C6 -C3 骨架 ,咖啡
酸仅较酪氨酸酶的天然底物左旋多巴脱掉一个氨
基 ,阿魏酸在咖啡酸基础上将间位酚羟基甲基化 ,与
左旋多巴化学结构非常相似 ,香草酸与酪氨酸酶抑
制剂氢醌的化学结构相似 ,化学结构为 3-甲氧基-4-
羟基-苯甲酸 ,与文献报道的非洲草药中的高效酪氨
酸酶抑制剂结构非常相似[ 5] 。实验结果证明:具有
C6-C3 骨架的二酚及其衍生物不具抑制酪氨酸酶
的作用 ,像香草酸 、氢醌一样 ,仅具有 C6 结构对位具
有极性基团的苯酚及其衍生物是非常好的酪氨酸酶
抑制剂 。可能是酪氨酸酶可明显催化咖啡酸氧化 ,
对阿魏酸也有微弱的作用 ,加入咖啡酸 、阿魏酸也就
是相当于增加了底物浓度 ,同时随着时间的变化咖
啡酸 、阿魏酸的浓度也在减低的原因 。具体原理尚
待进一步阐明。
另外 ,试验的加药顺序对测定结果也有一定影
响 ,以上香草酸 、阿魏酸 、咖啡酸 、氢醌等 4种试药与
L-DOPA化学性质相似 ,不发生化学反应 ,可先添加
混合 ,酪氨酸酶宜最后添加 。
参 考 文 献
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Effects of caffeic acid , ferulic acid and vanillic acid on tyrosinase
YAN Jun ,LI Chang-Sheng , CHEN Sheng-Li1 , ZHANG Jun-Ren2
Department of Pharmacy , Jinan Hospital for Skin Diseases Prevention , Jinan 250001 ,Shandong , China;1Department of
Dermatology , Shandong Provincial Institute of Dermatology and Venereology , J inan 250022 , Shandong , China;2Depart-
ment of Pharmaceutical Analysis , School of Pharmacy , Shandong University , Jinan 250012 , Shandong , China
ABSTRACT AIM:To evaluate the effects of monomers
of caffeic acid , ferulic acid and vanillic acid on the activ-
ity of tyrosinase , so as to provide a kind of drug in the
treatment of hyperpigmentation.METHODS:Tyrosinase
activity was estimated by measuring the oxidation rate of
L-DOPA.The inhibitory pattern of each monomer was
determined according to their Lineweaver-Burk curve com-
pared to the controlled group.RESULTS:Vanillic acid
showed an inhibition to tyrosinase activity , and the rate of
inhibitory was similar to hydroquinone , which had no sta-
tistically significant difference between them(P>0.05).
Caffeic acid and ferulic acid showed an up- regulation to
tyrosinase activity.CONCLUSION:Vanillic acid , a
mixed-type inhibitor of tyrosinase , can inhibit the activity
of tyrosinase greatly.
KEY WORDS　caffeic acid;ferulic acid;vanillic acid;
tyrosinase;inhibitor
·339·中国临床药理学与治疗学 2004Mar;9(3)