全 文 ：药 物 生 物 技 术
Pharmaceutical Biotechnology 2012，19(2) :0138 ～ 0141
培养条件对三叶青愈伤组织生长及总黄酮含量的影响
彭 昕
*，林言娜，何军邀，凌庆枝
(浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100)
摘 要 研究培养条件对三叶青愈伤组织生长及黄酮积累的影响，建立用愈伤组织生产三叶青黄酮的方法。
以三叶青的叶诱导产生的愈伤组织为材料，分别采用单因素实验、正交实验的方法比较了不同光照周期、不同有
机添加物、不同前体、3 种基础培养基、不同 6-BA与 NAA浓度的培养条件下愈伤组织生长的情况及黄酮含量。用
愈伤组织生产三叶青黄酮可采用两步培养法来进行:先在促进愈伤组织生长的最佳处理组合条件:12 h /d间断性
光照、MS + 3. 0 mg / L6-BA + 2. 0 mg /L NAA + 2 g /L蛋白胨下培养 30 d，再转入最利于黄酮积累的处理组合:连续
光照、B5 + 4. 0 mg /L 6-BA + 2. 0 mg /L NAA + 40 mg /L苯丙氨酸下培养 20 d。采用该方法培养的愈伤组织中总黄
酮最大浓度可以达到 28. 4 ± 3. 9 mg /g DW。采用愈伤组织培养方式生产三叶青黄酮，不仅可以大大地缩短生产周
期，而且培养物中的总黄酮含量也明显高于原植株叶片，接近于根茎中的黄酮含量，具有较大的可行性。
关键词 三叶青;愈伤组织;黄酮;培养条件
中图分类号 S567 文献标志码 A 文章编号 1005-8915(2012)02-0138-04
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)又名金线吊葫芦，是葡
萄科多年生蔓生藤本植物，以块根或全草入药，是我国独有
的珍贵物种。其主要活性成份黄酮可用于治疗高热、扁桃体
炎、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病，也是抗
肿瘤常用药物［1-2］。三叶青对生长环境的要求非常苛刻，近
年来，随着自然环境恶化以及人们无序的采挖，致使野生三
叶青资源已濒临灭绝，其组培快繁［3］和栽培［4］技术虽已初步
取得成功，但由于生长速度慢，形成块根周期长，远远满足不
了需求。因此利用植物组织培养技术进行三叶青次级代谢
产物的生产是解决目前供需矛盾的有效途径之一。
目前，对三叶青中黄酮类物质的研究主要集中在其药
理作用上，对三叶青愈伤组织培养和黄酮类物质合成的研
究尚少见报道，有学者发现三叶青愈伤组织中黄酮含量与
原植株中接近［5］，因此，用愈伤组织生产三叶青黄酮具有极
大可行性。本文研究不同培养条件对三叶青愈伤组织生长
和黄酮类物质积累的影响，旨在建立三叶青愈伤组织生长
及其黄酮积累适宜的培养条件，为规模化生产三叶青黄酮
类物质提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
实验材料采自浙江省丽水市，经安徽师范大学生命科学
学院周守标教授鉴定为三叶青(Tetrastigma hemsleyanum) ，
外植体取叶片。
1. 2 主要试验仪器
722S型紫外可见分光光度计(上海棱光) ;组织光照培
养箱(RXZ-500C，宁波东南仪器) ;电热恒温鼓风干燥箱
(DHG-9240A，上海一恒) ，电子天平(SE602F，Ohaus) ;所有
试剂均为分析纯。
1. 3 愈伤组织诱导与继代培养
选取生长良好的三叶青植株，取幼嫩叶片，自来水冲洗
2 h，8%次氯酸钠消毒 5 min，再用 0. 1% HgCl2 溶液消毒
5 min，然后用无菌水冲洗 8 次，无菌滤纸吸干水分，切成
1. 5 ～ 2. 0 cm2 的小块，接种在诱导培养基:MS + 0. 2 mg /L
α-萘乙酸(NAA)+ 2. 0 mg /L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+ 3%
蔗糖 + 0. 7%琼脂，pH 5. 8 上，(26 ± 2)℃培养，光照强度
1 500 ～ 2 000 Lx，光照周期 12 h /d，大约 3 d 时叶片边缘开
始膨胀，第 10 天时边缘处长出愈伤组织，20 d 后挑选生长
良好的愈伤组织，称重后分别在不同培养条件下继代培养，
20 d后收获称重。
1. 4 愈伤组织生长测试指标
从培养容器中取出的三叶青愈伤组织，蒸馏水洗涤
3次，用滤纸吸净其表面水分，称重即得其鲜重，鲜重增长倍
数 =(最终收获鲜重-接种鲜重)/接种鲜重;测定干重时，将
愈伤组织置于 60 ℃下干燥至恒重，实验重复 3次取平均值。
1. 5 总黄酮含量测定
1. 5. 1 标准曲线的绘制 以芦丁为标准品，参照文献［5］的
方法进行，得标准曲线线性回归方程为 Y = 0. 090X +
831
* 收稿日期:2011-09-25 修回日期:2012-02-07
基金项目:浙江省新苗人才计划项目(ZJPCKJCX201006) ;浙江医药高等专科学校校级科研项目(ZPCSR2010003)。
作者简介:彭昕，讲师，硕士，主要研究方向:生物制药技术，Tel:0574-88223161，E-mail:pengx@ mail. zjpc. net. cn。
彭 昕等:培养条件对三叶青愈伤组织生长及总黄酮含量的影响
0. 001，R2 = 0. 999 6。
1. 5. 2 样品总黄酮含量测定 精密称取烘干至恒重的样
品 0. 2 g，加 10 mL 50%乙醇超声浸提 2 h，过滤后量取提取
液 1 mL，置于 25 mL 的容量瓶中，按标准曲线的绘制中所
用的方法对样品溶液进行显色，依据标准曲线，计算样品中
的总黄酮含量。
1. 6 愈伤组织生长及黄酮积累曲线
将三叶青叶愈伤组织继代于筛选出的利于愈伤组织生
长培养基中培养，每 5 d随机抽取 3 瓶培养物，称其鲜重，计
算愈伤组织生长指数，并测定黄酮含量。
1. 7 统计分析
本研究中正交设计及所有数据的统计分析均使用
SPSS 13. 0 软件，数据以 x ± s表示。
2 结果与分析
2. 1 光照对愈伤组织生长及黄酮合成的影响
采用了连续光照、12 h /d光照及黑暗 3 种光照形式，进
行三叶青愈伤组织继代培养。结果表明(表 1) :光照对愈
伤组织鲜重增长倍数和总黄酮积累均有显著影响。12 h /d
间断性光照最有利于愈伤组织的生长;连续光照最有利于
总黄酮的积累但不利于愈伤组织生长，愈伤致密，褐化较严
重;黑暗对愈伤组织生长影响较小，暗中诱导的愈伤组织几
乎没有褐化现象，质地较疏松，但黑暗条件对愈伤组织中总
黄酮的积累有明显抑制作用，在连续光照的条件下，叶愈伤
组织总黄酮含量是黑暗条件下的近 3 倍。
Tab 1 Effects of light on callus growth and flavonoid synthesis
Illumination
time
Fresh weight
growth
Flavonoid content
(mg /g DW)
24 h /d 0. 88 ± 0. 01a 28. 1 ± 0. 71a
12 h /d 1. 17 ± 0. 08b 21. 8 ± 0. 64b
0 h /d 1. 07 ± 0. 04b 10. 3 ± 1. 20c
Note:Different English letters showed the significance of
difference by LSD multiple comparison test (P ＜ 0. 05)。
2. 2 基础培养基和植物生长调节剂对愈伤组织生长及黄
酮合成的影响
用正交试验 L9(3
4)对继代培养基类型和 2 种植物生
长调节剂进行优化(表 2)。
Tab 2 Factors and levels of L9(3
4)orthogonal design
Levels
Basic culture
medium
6-BA
(mg /L)
NAA
(mg /L)
1 B5 2 0. 5
2 MS 3 1
3 N6 4 2
正交试验结果分析见表 3、表 4。基础培养基及植物
生长调节剂对愈伤组织生长影响的极差 R顺序为:基础培
养基 ＞ 6-BA ＞ NAA，其中基础培养基对愈伤组织生长有显
著影响(P ＜ 0. 05) ，促进愈伤组织生长的最佳处理组合是
A2B2C3，即 MS + 3. 0 mg /L 6-BA + 2. 0 mg /L NAA。基础培
养基及植物生长调节剂对黄酮含量影响的极差 R顺序为:
基础培养基 ＞ NAA ＞ 6-BA，基础培养基对黄酮含量有极显
著影响(P ＜ 0. 01) ，NAA 浓度对黄酮含量有显著影响
(P ＜ 0. 05) ，最利于黄酮积累的处理组合为 A1B3C3，即
B5 + 4. 0 mg /L 6-BA + 2. 0 mg /L NAA。
Tab 3 Effects of basic culture medium and plant growth
regulator on callus growth and flavonoid synthesis
Experimental
number
Fresh weight
growth
Flavonoid content
(mg /g DW)
1 0. 489 23. 8
2 0. 668 26. 5
3 0. 588 34. 3
4 1. 006 12. 4
5 1. 335 19. 3
6 0. 962 13. 9
7 0. 867 28. 4
8 0. 946 21. 9
9 0. 896 22. 6
Tab 4 ANOVA of the effects of basic culture
medium and plant growth regulator on
callus growth and flavonoid synthesis
Sources of
variation
Fresh weight
growth
S2 F
Flavonoid content
(mg /g DW)
S2 F
Basic culture medium 0. 412 45. 78 267. 02 133. 04
6-BA 0. 067 7. 44 6. 41 3. 19
NAA 0. 026 2. 89 102. 85 51. 24
Note:F0. 05 = 19，F0. 01 = 99，df = 2
2. 3 有机添加物对愈伤组织生长和黄酮合成的影响
从表 5 可以看出，蛋白胨对愈伤组织生长有显著促进
作用(P ＜ 0. 05) ，牛肉膏对黄酮的合成有抑制作用，而酵母
粉对愈伤组织生长和总黄酮的积累量都有明显抑制作用。
据此认为，蛋白胨是比较好的促进愈伤增殖的有机添加物。
Tab 5 Effects of organic additives on callus
growth and flavonoid synthesis
Organic additives
(2 g /L)
Fresh weight
growth
Flavonoid content
(mg /g DW)
Contrast sample 1. 10 ± 0. 03a 25. 6 ± 0. 35a
Beef extract 1. 02 ± 0. 03a 20. 1 ± 0. 91b
Peptone 1. 39 ± 0. 04b 24. 8 ± 0. 37a
Yeast powder 0. 43 ± 0. 05c 19. 3 ± 0. 99b
2. 4 前体对愈伤组织生长和黄酮合成的影响
从表 6 可以看出，在继代培养基中添加 40 mg /L 的苯
931
药 物 生 物 技 术 第 19 卷第 2 期
丙氨酸可以显著增加黄酮的含量(P ＜ 0. 05) ，对细胞增殖
没有显著影响。而肉桂酸显著抑制细胞的生长，促进细胞
褐化死亡，对黄酮含量没有明显的影响。
Tab 6 Effects of precursors on callus
growth and flavonoid synthesis
Precursors
(40 mg /L)
Fresh weight
growth
Flavonoid content
(mg /g DW)
Contrast sample 1. 10 ± 0. 03a 25. 6 ± 0. 35a
Phenylalanine 1. 03 ± 0. 05a 31. 6 ± 0. 58b
Cinnamic acid 0. 67 ± 0. 04b 24. 7 ± 0. 98a
2. 5 愈伤组织生长及黄酮积累曲线
从图 1 可以看出培养的前 10 d为适应期，生长较缓慢，
培养的 10 ～ 30 d进入指数生长期，生长速度呈线性迅速增
长，30 d后还有缓慢增殖的趋势，在此期间，黄酮含量变化
的趋势是在第 20 天达到积累的最大值，之后逐渐降低。因
此，三叶青愈伤组织的最大生物量积累和最大黄酮积累不
同步。
Fig 1 Curve of Tetrastigma hemsleyanum callus
growth and flavonoid synthesis
3 讨论
研究表明，光照在诱导分化时可激活某些酶的活性和
光诱导的叶绿体或叶绿体代谢产物，从而影响细胞的生长
和次生代谢物的积累，影响效果因植物种类不同而不
同［6-8］。光照使长春花组织培养细胞生长速度较快［9］，而
对甘草愈伤组织生长影响不大［10］，但也有报道，黑暗对愈
伤组织的生长是有利的［11］。光照对许多植物中黄酮类化
合物的合成具有诱导作用［12］。可能是光照条件下有叶绿
体的分化，而叶绿体分化与黄酮积累有关［13］，或是因为光
照对苯丙氨酸解氨酶的激活作用［14］。本研究表明 12 h /d
间断性光照最有利于三叶青愈伤组织的生长，连续光照对
愈伤组织增殖有明显抑制作用，这可能与三叶青适生于耐
荫环境有关。但连续光照对总黄酮的合成有明显的促进作
用，黑暗不影响愈伤组织的生长，但却抑制总黄酮的形成，
与杜仲组织培养时的结果类似［15］。
基础培养基类型和植物生长调节剂是植物组织培养中
的关键因子，一般来说，高盐的培养基较适合愈伤组织的生
长，低盐的培养基较适合次生代谢产物的积累［16］。在本试
验中基础培养基类型对三叶青愈伤生长有显著的影响
(P ＜ 0. 05) ，对黄酮合成有极显著的影响(P ＜ 0. 01)。高盐
的 MS培养基适合三叶青愈伤组织生长;高硝酸钾的 B5 比
较适合愈伤组织中黄酮的合成。这一规律与在甘草细胞培
养生产黄酮时得出的:“硝态氮有利于甘草黄酮类化合物的
积累而铵态氮抑制黄酮类化合物的形成”的结果相
类似［17］。
一般认为，加入一些有机添加物对愈伤组织的早期生
长有利。本实验中，蛋白胨能促进三叶青愈伤组织的生长，
对黄酮的积累没有太大的影响，而酵母粉对愈伤组织生长
和黄酮的积累都有显著的抑制作用，这一点与甘草愈伤组
织培养的结果不同［18］，可能是因为酵母提取物是一种化学
成分不明的复杂的营养混合物，其中含有某些抑制三叶青
细胞生长的成分所致。
在植物细胞培养中加入次生代谢物生物合成的前体是
提高次生代谢物产量的有效途径之一，可以消除关键酶的
阻碍或阻断内源性中间体的分隔或有效贮存。在黄酮生物
合成途径中，苯丙氨酸裂解酶催化苯丙氨酸生成肉桂酸。
有研究表明，植物细胞培养中加入前体物苯丙氨酸后对其
苯丙烷合成代谢及下游分支途径相关成分的积累有明显的
促进作用［19］。本研究发现苯丙氨酸可以显著增加黄酮的
含量，而肉桂酸不能促进黄酮的合成，可能与肉桂酸对苯丙
氨酸解氨酶活性的反馈抑制作用有关［20］。
综上所述，最适于三叶青愈伤组织生长的培养条件
是:12 h /d间断性光照、MS培养基中加入 3. 0 mg /L 6-BA、
2. 0 mg /L NAA和 2 g /L 蛋白胨;最适于其黄酮积累的培
养基是:连续光照、B5 培养基中加入 4. 0 mg /L6-BA、
2. 0 mg /L NAA和 40 mg /L苯丙氨酸。本研究中发现三叶
青愈伤组织生长曲线类似“S”型，10 ～ 30 d 进入指数生长
期，30 d后还有继续缓慢增殖趋势。可能是由于愈伤组织
中细胞不同步化，在培养后期还有一部分细胞在不断增殖，
从而造成愈伤组织生长曲线不是标准的“S”型，但由于增
长速度很慢，从经济角度来说，最佳收获时期为 30 d 左右。
而黄酮积累的最大值为继代后第 20 d 左右。用常规培养
方法在收获最大生物量时得不到最高的黄酮产量，因此生
产上可采用两步法培养，先在有利于愈伤组织生长的培养
基上培养 30 d，使细胞数量大量增加，得到较大的生物量，
再更换到生产培养基中培养 20 d收获黄酮。
作者采用本研究中的方法对三叶青原植株的叶片、根
茎中的总黄酮含量进行了测定，其测定结果分别为 15. 2 ±
3. 5 mg /g DW、29. 3 ± 2. 9 mg /gDW，而本研究所建立的愈伤
组织生产三叶青黄酮的方法，经过一个培养周期 50d，愈伤
组织鲜重增长倍数为 3. 38 ± 0. 5;总黄酮积累的最大浓度可
以达到 28. 4 ± 3. 9 mg /g DW，显著高于原植株叶片，接近于
041
彭 昕等:培养条件对三叶青愈伤组织生长及总黄酮含量的影响
根茎中的黄酮含量，并显著高于未优化条件下所培养的愈
伤组织［5］。因此，采用愈伤组织培养方式生产三叶青黄酮
不仅可以大大地缩短生产周期，而且细胞培养物中的总黄
酮含量也明显增高，具有较大的可行性。
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Influence of Culture Conditions on the Growth of Callus and Content of
Total Flavonoids in Tetrastigma Hemsleyanum
PENG Xin，LIN Yan-na，HE Jun-yao，LIN Qing-zhi
(Zhejiang Medical Vocationcl College，Ningbo 31500，China)
Abstract To set up the optimal culture conditions for the callus growth and the accumulation of total flavonoids，the influence of
light，medium，plant growth regulators and organic additives on the growth of callus and content of total flavonoids in Tetrastigma
hemsleyanum was analyzed． The callus growth and the accumulation of total flavonoids under different culture conditions
(photoperiods，organic additives，basic meida，concentrations of 6-BA and NAA )were studied by single factor experiment and
orthogonal test． For callus growth the optimum medium was 12 h /d photoperiods，MS + 3mg /L 6-BA + 2 mg /L NAA + 2 g /L
peptone;For accumulation of total flavonoids the optimum medium was 24 h /d photoperiods，B5 + 4 mg /L 6-BA + 2 mg /L NAA +
40 mg /L Phenylalanine． Callus of Tetrastigma hemsleyanum could be cultured by a Two-step Method:callus was cultured in the
former medium for 30 days and then in the latter for 20 days． By using this method，total flavonoids in cultured callus of maximum
concentration could reach 28． 4 ± 3． 9 mg /g DW． Tetrastigma hemsleyanum grew significantly faster in callus culture． The total
flavonoids content in callus was significantly higher than that of raw plant leaves，close to the rhizomes．
Key words Tetrastigma hemsleyanum，Callus，Flavonoid，Culture conditions
141