全 文 ：·研究论文·
［基金项目］国家自然科学基金（编号：８１１０２４８２）；广州市科技计划项目；南方医科大学广东省新药筛选重点实验室开放基金项目（编号：
ＹＸＹ００４）　［作者简介］谭穗懿，博士，讲师，研究方向：抗病毒药物药理，电话：０２０－６１６４８５９０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｉｙｉｔａｎ＠ｓｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　［通讯作者］段
文军，硕士，副教授，研究方向：分析化学，电话：０２０－６２７８９４１９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｎｄｙｄｕａｎ＠１２６．ｃｏｍ
青果氯仿提取组分体外抗人类免疫缺陷病毒活性及其作用机制
谭穗懿，段恒，梁铮林，刘叔文，段文军　 （南方医科大学药学院，广东省新药筛选重点实验室，广东 广州５１０５１５）
［摘要］　目的：用高速逆流色谱法从青果氯仿萃取液中分离出不同组分，考察其抗人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）的活性并初步
探讨其作用机制。方法：青果的氯仿萃取液用高速逆流色谱法分离出各组分；利用 ＨＩＶ－１假病毒检测各组分抑制 ＨＩＶ－１感
染的活性；ＸＴＴ比色法检测各组分对细胞的毒性；采用酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）研究各组分体外抗病毒活性的机理。结
果：青果氯仿萃取液能抑制 ＨＩＶ－１ＪＲＦＬ及 ＨＩＶ－１ＨＸＢ２假病毒感染活性；用高速逆流色谱法从青果氯仿萃取液中分离出３个组
分：组分Ⅰ，组分Ⅱ，组分Ⅴ，其中组分Ⅱ纯度达９０％以上，３个组分均能抑制 ＨＩＶ－１ＪＲＦＬ及 ＨＩＶ－１ＨＸＢ２假病毒感染的活性，其中
组分Ⅰ和组分Ⅴ能抑制 ＨＩＶ－１　ｇｐ４１六螺旋的形成，其半数抑制浓度分别为（３１．４２±３．００）、（９４．１０±１４．８７）μｇ·ｍｌ
－１。结论：
用高速逆流色谱法从青果中分离了具有抗 ＨＩＶ－１感染活性的不同组分。
［关键词］　青果；氯仿；人类免疫缺陷病毒；抗病毒活性；高速逆流色谱法
［中图分类号］Ｒ９６６　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１４）１５－１２４７－０５　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１４．１５．０２
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ＨＩＶ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｃａｎａｒｉｕｍ
Ａｌｂｕｍｆｒｕｉｔｓ
ＴＡＮ　Ｓｕｉ－ｙｉ，ＤＵＡＮ　Ｈｅｎｇ，ＬＩＡＮＧ　Ｚｈｅｎｇ－ｌｉｎ，ＬＩＵ　Ｓｈｕ－ｗｅｎ，ＤＵＡＮ　Ｗｅｎ－ｊｕｎ（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｎｅｗ　Ｄｒｕｇ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ
５１０５１５）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｃａｎａｒｉｕｍ　Ａｌｂｕｍｆｒｕｉｔｓ　ｂｙ　ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ
ｃｏｕｎｔｅｒ－ｃｕｒｒｅｎｔ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅｉｒ　ａｎｔｉ－ＨＩＶ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎｓ．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｄｉｆｆｅｒ－
ｅｎｔ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｃａｎａｒｉｕｍ　Ａｌｂｕｍｆｒｕｉｔｓ　ｂｙ　ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ　ｃｏｕｎｔｅｒ－ｃｕｒｒｅｎｔ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．
Ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ＨＩＶ－１　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＨＩＶ－１　ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ　ｖｉｒｕｓ．Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｃｏｍｐｏ－
ｎｅｎｔｓ　ｗａｓ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＸＴＴ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ
ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｃａｎａｒｉｕｍ　Ａｌｂｕｍｆｒｕｉｔ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｐｓｅｕｄｏ－
ｔｙｐｅｄ　ＨＩＶ－１ＪＲＦＬａｎｄ　ＨＩＶ－１ＨＸＢ２．Ｔｈｒｅｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｆｒａｃｔｉｏｎⅠ，ｆｒａｃｔｉｏｎⅡａｎｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎⅤ，ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ．Ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ
ｆｒａｃｔｉｏｎⅡ ｗａｓ　ｏｖｅｒ　９０％．Ｔｈｅｙ　ａｌ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ＦｒａｃｔｉｏｎⅠａｎｄⅤｃｏｕｌｄ　ｂｌｏｃｋ　ｔｈｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｐ４１　ｓｉｘ－ｈｅｌｉｘ
ｂｕｎｄｌｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ｗｉｔｈ　ＩＣ５０ｉｓ　ｂｅｉｎｇ（３１．４２±３．００）μｇ·ｍｌ
－１　ａｎｄ（９４．１０±１４．８７）μｇ·ｍｌ
－１　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｂｙ　ｕｓｉｎｇ
ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ　ｃｏｕｎｔｅｒ－ｃｕｒｒｅｎｔ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｔｈａｔ　ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ　ａｎｔｉ－ＨＩＶ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ
ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｃａｎａｒｉｕｍ　Ａｌｂｕｍｆｒｕｉｔｓ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｃａｎａｒｉｕｍ　ａｌｂｕｍ，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ，ＨＩＶ－１，ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ　ｃｏｕｎｔｅｒ－ｃｕｒｒｅｎｔ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
　 　 艾 滋 病 （Ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎ－
ｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）是由人类免疫缺陷病毒（Ｈｕｍａｎ　ｉｍ－
ｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　Ｉ，ＨＩＶ－１）感染引起的疾病。
由于现在还没有有效的、安全的疫苗或杀微生物剂
在临床上用于预防 ＨＩＶ－１的感染，所以在今后相当
长的一段时期内，发展安全有效的抗艾滋病药物是
当前艾滋病预防和治疗的重点。我国中草药资源丰
富、低毒、长效、可长期服用等优点使得中医药在我
国防治艾滋病方面具有独特的优势［１］。
青果为橄榄科植物橄榄（Ｃａｎａｒｉｕｍ　ａｌｂｕｍＲａｅ－
ｕｓｃｈ．）的干燥成熟果实。我们小组的前期研究表
明，青果水提物中依次用石油醚、氯仿和醋酸乙酯萃
取的各部位均显示出抑制 ＨＩＶ－１　ｇｐ４１形成六螺旋
束结构的活性［２］。我们用高速逆流色谱法成功从醋
酸乙酯萃取部位中分离出４个纯度较高并具有显著
抑制 ＨＩＶ－１病毒感染活性的成分［３］。在本研究中，
我们应用高速逆流色谱法从青果氯仿萃取部位中分
离各成分，并探讨其抗 ＨＩＶ－１感染的活性并初步研
·７４２１·中国医院药学杂志２０１４年８月第３４卷第１５期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｕｇ　２０１４，Ｖｏｌ　３４，Ｎｏ．１５
究其作用机制。
１　材料
１．１　 细胞株 及 质 粒 　 ＨＥＫ２９３Ｔ，Ｕ８７．ＣＤ４．
ＣＣＲ５，Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＸＣＲ４等细胞株以及质粒含荧
光酶素（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）报告基因的 ＨＩＶ－１缺陷型质粒
ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－，质粒ｐＨＸＢ２来源于美国ＮＩＨ
ＡＩＤＳ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ。
质粒ｐＪＲＦＬ由南京大学医学院公共健康中心吴稚
伟教授惠赠。
１．２　试剂　ＤＭＥＭ 培养基、ＦＢＳ、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ
消化液均购自美国Ｇｉｂｃｏ公司。转染试剂ＰＥＩ购自
上海起福生物科技有限公司，荧光素酶报告基因检
测试剂盒购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＸＴＴ以及链亲
合素标记的辣根过氧化酶（ＳＡ－ＨＲＰ）购自美国Ｓｉｇ－
ｍａ公司。生物素标记的羊抗鼠ＩｇＧ购自美国Ｂｏｅ－
ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｎ公司。ＴＭＢ显色液由本实验室
自制。ＡＤＳＪ－１，Ｔ－２０，ＨＩＶｇｐ４１的 Ｎ－多肽（Ｎ３６）和
Ｃ－多肽（Ｃ３４）及单克隆抗体２１Ｆ５由纽约血液中心
姜世勃教授提供。氯仿、正己烷、醋酸乙酯、甲醇、冰
醋酸均为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）；
青果采集于广东潮州，经南方医科大学中西药学院
刘强副教授鉴定为真品。
１．３　仪器　ＲＥ－２１０Ｅ型旋转薄膜蒸发仪（巩义市
予华仪器有限公司）；Ｇｅｎｉｏｓ　Ｐｒｏ型 Ｔｅｃａｎ酶标仪
（美国Ｔｅｃａｎ公司）；ＴＢＥ－３００Ａ高速逆流色谱仪（上
海Ｔａｕｔｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈ公司）。
２　方法
２．１　青果氯仿萃取物的制备　新鲜的青果洗净后
置干燥箱内６０℃干燥５　ｈ，剥取果肉后继续在６０℃
干燥箱内烘干。粉碎后取４００　ｇ，分别加水４　０００，
２　０００，２　０００　ｍｌ煮沸提取３次，提取时间分别为６０
ｍｉｎ、４５　ｍｉｎ、３０　ｍｉｎ，滤过后合并３次水提液，浓缩
至４　０００　ｍｌ。取上述水提液，按水∶石油醚＝２∶１的比
例，用石油醚萃取４次并合并，将石油醚萃取后的水
提液同法用氯仿萃取，回收溶剂后真空干燥得氯仿
提取物粗品。粗品用二甲基亚砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘ－
ｉｄｅ，ＤＭＳＯ）溶解成１０　ｍｇ·ｍｌ－１即得氯仿萃取物。
２．２　高速逆流色谱法分离青果氯仿萃取物的各成
分　选取正己烷－醋酸乙酯－甲醇－水（４２０∶５００∶４２０∶
５００）为高速逆流色谱法的溶剂体系，按其比例分别
将各种溶剂加入分液漏斗中，剧烈振荡使溶液充分
混合，静置分相平衡后，分出上相和下相，使用前分
别用超声波脱气４０　ｍｉｎ。取约２００　ｍｇ青果氯仿粗
提物，溶于上、下相各７．５　ｍｌ的混合溶剂中，超声振
荡使之完全溶解，得分离所用的样品溶液。
以２０　ｍｌ·ｍｉｎ－１的速度将上相泵入高速逆流色
谱仪螺旋柱内作为固定相，直至有液体流出溢出口，
停止泵入固定相；开启恒温循环器电源，设置温度为
２５℃，待恒温循环器工作稳定后，将主机的电源打
开，设置正转的转速８５０　ｒ·ｍｉｎ－１，以流速１．５　ｍｌ·
ｍｉｎ－１将下相泵入柱内作为流动相；当柱末端流出
的固定相不再增加时，即螺旋管内上下相达到流体
动力学平衡后进样，柱后流出物以紫外检测器检测，
检测波长为２８０　ｎｍ。根据色谱图手动收集各色谱
峰流分，进样３２０　ｍｉｎ后停机，收集各流分，各流分
用旋转薄膜蒸发器回收溶剂后，氮吹仪吹干得到粗
组分。
２．３　抗病毒活性的研究
２．３．１　ＨＩＶ－１　Ｅｎｖ假病毒的包装及收获　在六孔
板中接种 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞（２×１０５个／孔），次日细
胞长至５０％～６０％汇合时，换用无血清的ＤＭＥＭ
培养基，接着每孔加入混合好的转染试剂ＰＥＩ　１２
μｌ，２μｇ　ｐＮＬ４－３．ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ－质粒以及２μｇ　ｐＪＲ－ＦＬ或
２μｇ　ｐＨＸＢ２包膜蛋白质粒。转染２４　ｈ后更换新鲜
的含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基，于转染后４８　ｈ收
集细胞上清，４　０００　ｒ·ｍｉｎ－１离心１０　ｍｉｎ，上清分装
后置于－８０℃备用，即得 ＨＩＶ－１ＪＦＲＬ假病毒及 ＨＩＶ－
１ＨＸＢ２假病毒。
２．３．２　各组分抗假病毒感染活性的检测　在９６孔
板中接种 Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５细胞或 Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＸ－
ＣＲ４细胞１×１０４／孔。次日将 ＨＩＶ－１假病毒（５０
μｌ）和梯度稀释的化合物（５０μｌ）混合，置于３７℃预
孵育３０　ｍｉｎ，然后加入至细胞培养板中。４８　ｈ后用
荧光素酶报告基因检测试剂盒及多功能酶标仪
（Ｔｅｃａｎ）检测化学发光数值，从而确定化合物抗
ＨＩＶ－１假病毒的活性。
２．４　化合物对细胞毒性的检测　采用ＸＴＴ法检
测化合物对细胞的毒性。在９６孔板中接种１×１０５
ｃｅｌ／ｍｌ的 Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５细胞，每孔接种１００μｌ。
次日将不同浓度的各组分（１００μｌ）加入细胞孔中，
同时设正常细胞对照孔。培养７２　ｈ后吸取细胞培
养基，每孔加入２００μｌ新鲜无酚红１６４０培养基以
及５０μＬ的含有０．０２　ｍｍｏｌ·Ｌ
－１ＰＭＳ的ＸＴＴ溶液
（１　ｍｇ·ｍｌ－１），继续培养４　ｈ后倾去培养液，震荡溶
解１０　ｍｉｎ，用多功能酶标仪于４５０　ｎｍ处测定吸光
度。计算细胞存活率。
２．５　ＥＬＩＳＡ法检测各组分抑制ｇｐ４１六螺旋束结
构形成的活性　根据文献［４］报道，将２μｍｏｌ·Ｌ
－１
衍生于ｇｐ４１　ＮＨＲ区的多肽 Ｎ３６先与稀释后的待
测各组分在３７℃孵育３０　ｍｉｎ，然后再加入２μｍｏｌ·
·８４２１· 中国医院药学杂志２０１４年８月第３４卷第１５期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｕｇ　２０１４，Ｖｏｌ　３４，Ｎｏ．１５
Ｌ－１衍生于ｇｐ４１　ＣＨＲ 区的多肽Ｃ３４，继续孵育３０
ｍｉｎ。将孵育好的混合液加入到包被好兔抗 Ｎ３６／
Ｃ３４的多抗（２μｇ·ｍｌ
－１，用ｐＨ８．８的０．１　ｍｏｌ·Ｌ－１
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液稀释）的９６孔酶标板中，孵育１　ｈ。
然后依次加入ｇｐ４１六螺旋束特异的鼠单抗 ＮＣ－１，
生物素标记羊抗鼠ＩｇＧ，ＳＡ－ＨＲＰ和 ＴＭＢ，检测
４５０　ｎｍ处的吸光度值，判断化合物抑制ｇｐ４１六螺
旋束结构形成的活性。
各组分对ｇｐ４１六股α－螺旋束结构形成的抑制
率按下式计算。ＩＣ５０用Ｃａｌｃｕｓｙｎ软件计算。
抑制率（％）＝
样品孔Ａ４５０－ＰＢＳ空白孔Ａ４５０
未加样品的（Ｎ３６＋Ｃ３４）Ａ４５０－ＰＳＢ空白孔Ａ４５０
×１００％
３　结果
３．１　青果氯仿萃取物抗 ＨＩＶ－１假病毒活性　我们
首先考察了青果氯仿萃取物的抗 ＨＩＶ－１假病毒的
活性，包括ＣＣＲ５受体嗜性的 ＨＩＶ－１ＪＲＦＬ和ＣＸＣＲ４
受体嗜性的 ＨＩＶ－１ＨＸＢ２，结果如表１所示。阳性药
物Ｔ－２０能显著抑制假病毒的感染活性，证明构建
的假病毒感染模型是成功的。青果氯仿萃取物在
１００，５０，２５μｇ·ｍｌ
－１均具有明显的抗 ＨＩＶ－１假病毒
的活性，而且其抗病毒活性呈浓度梯度依赖的关系。
表１　青果氯仿萃取物抗 ＨＩＶ－１假病毒的活性
Ｔａｂ　１　Ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｆｒｏｍＣａ－
ｎａｒｉｕｍ　ａｌｂｕｍａｇａｉｎｓｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｐｓｅｕｄｏ－ＨＩＶ－１
组别抑制
ＨＩＶ－１ＪＲＦＬ
假病毒感染率／％
抑制 ＨＩＶ－１ＨＸＢ２
假病毒感染率／％
Ｔ－２０／２μｇ·ｍｌ－１　 ９５．４８±８．２３　 ９３．０４±９．１８
氯仿提取物／１００μｇ·ｍｌ－１　 ８９．２３±１２．６５　 ８２．０６±１３．０３
氯仿提取物／５０μｇ·ｍｌ－１　 ４７．９０±７．８４　 ４２．０４±８．５６
氯仿提取物／２５μｇ·ｍｌ－１　 ３８．９１±９．４５　 ３３．０９±６．２４
３．２　青果氯仿萃取物中分离的３个组分抗 ＨＩＶ－１
假病毒活性　为了进一步研究青果氯仿萃取物中抗
艾滋病毒的活性成分，我们用高速逆流色谱法，从青
果氯仿萃取物中分离出８个成分，由于组分Ⅰ、Ⅱ、
Ⅴ含量和纯度较高，因此我们主要研究这３个组分，
其中组分Ⅱ纯度达９０％以上。我们探讨了这３个
组分抗 ＨＩＶ－１假病毒的活性，结果如图１所示。３
个组分均具有显著的抑制 ＨＩＶ－１ＪＲＦＬ、ＨＩＶ－１ＨＸＢ２的
感染活性，其中组分Ⅱ抗病毒活性最好，在１００，５０
μｇ·ｍｌ
－１质量浓度下能完全抑制病毒感染，２５μｇ·
ｍｌ－１浓度下抑制病毒感染活性仍然在８０％左右。
３．３　从氯仿萃取液中分离的３个组分对细胞的毒
性作用　接着，我们考察从氯仿萃取液中分离的３
个组分对 ＨＩＶ－１ＪＲＦＬ感染的靶细胞Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５
的毒性作用。结果如图２所示。３个组分在１００μｇ
·ｍｌ－１质量浓度下，对 Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５细胞的没有
毒性。
图１　高速逆流色谱法从青果氯仿萃取物中分离的三组分抗 ＨＩＶ－１
假病毒的活性
Ａ．抑制 ＨＩＶ－１ＪＲＦＬ活性；Ｂ．抑制 ＨＩＶ－１ＨＸＢ２活性
Ｆｉｇ　１　Ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＨＳＣＣＣ　ｆｒｏｍ
ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｇａｉｎｓｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｐｓｅｕｄｏ－ＨＩＶ－１
Ａ．ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＶ－１ＪＲＦＬ；Ｂ．ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｉｎ－
ｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＶ－１ＨＸＢ２
图２　青果氯仿萃取物中分离的三组分对 Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５活力的
影响
Ｆｉｇ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ
Ｕ８７．ＣＤ４．ＣＣＲ５
３．４　ＥＬＩＳＡ 检测３个氯仿提取组分抑制 ＨＩＶ－１
ｇｐ４１六螺旋束的形成 　我们探讨了３个组分抑制
ＨＩＶ－１感染的活性是否通过抑制 ＨＩＶ－１　ｇｐ４１六螺
旋束结构的形成。我们采用夹心 ＥＬＩＳＡ 方法和
Ｎ３６、Ｃ３４多肽，在体外检测各组分是否能抑制
ＨＩＶ－１　ｇｐ４１六螺旋束结构的形成。结果如图３所
示。在１００μｇ·ｍｌ
－１质量浓度下，组分Ｉ和组分 Ｖ
能抑制 ＨＩＶ－１　ｇｐ４１六螺旋束结构的形成，而组分Ｉ
抑制六螺旋束结构的形成和阳性药物 ＡＤＳＪ－１（１００
μｇ·ｍｌ
－１）效果相当。但是组分Ⅱ却不能抑制 ＨＩＶ－
１　ｇｐ４１六螺旋束结构的形成。进一步研究结果如
图４所示，组分Ⅰ和组分Ⅴ抑制 ＨＩＶ－１　ｇｐ４１六螺
旋束结构的形成的ＩＣ５０分别为（３１．４２±３．００）μｇ·
ｍｌ－１，（９４．１０±１４．８７）μｇ·ｍｌ
－１。
·９４２１·中国医院药学杂志２０１４年８月第３４卷第１５期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｕｇ　２０１４，Ｖｏｌ　３４，Ｎｏ．１５
图３　青果氯仿萃取物中分离的三组分抑制ｇｐ４１六螺旋束形成
Ｆｉｇ　３　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｐ４１　ｓｉｘ－ｈｅｌｉｘ　ｂｕｎｄｌｅ（６－ＨＢ）ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ
ｔｈｒｅｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ
图４　组分Ｉ和组分Ｖ抑制ｇｐ４１六螺旋束形成
Ｆｉｇ　４　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｐ４１　ｓｉｘ－ｈｅｌｉｘ　ｂｕｎｄｌｅ（６－ＨＢ）ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｆｒａｃ－
ｔｉｏｎ　Ｉ　ａｎｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ
４　讨论
高速逆流色谱法以其快速、进样量大、费用低、
回收率高等优点，在天然产物活性成分的分离纯化
领域备受重视［５］。本研究在前期工作的基础上［２－３］，
利用高速逆流色谱法的快速分离与应用安全、无感
染性的假病毒体系［６］，成功从青果氯仿萃取液中分
离出３个具有抗 ＨＩＶ－１感染的组分。
青果收载于《中国药典》２０１０年版１部，其为橄
榄科植物橄榄的干燥成熟果实。青果主要含三萜
类、香豆素、蛋白质、脂肪、矿物质等化学成分，有清
热、利咽、生津、解毒等功效，用于治疗咽喉肿痛、咳
嗽、烦渴、鱼蟹中毒等［７］。本研究小组首先发现青果
具有抗 ＨＩＶ感染的活性。在本研究中，青果的氯仿
萃取液具有明显的抗 ＨＩＶ－１假病毒的活性。应用
高速逆流色谱法，通过一次进样，从青果的氯仿萃取
液中高效地分离出８个粗组分，考虑到含量和纯度，
组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ是本次研究的主要对象，３个组分均
具有明显的抗病毒感染的作用，而且各组分抑制
ＨＩＶ－１感染的活性在微克级水平。其中组分Ⅱ纯
度高达９０％。此结果表明从青果氯仿萃取液中分
离抗 ＨＩＶ－１活性成分具有良好的前景。
ＨＩＶ进入抑制剂能把病毒阻挡在靶细胞膜外，
因此是研究抗 ＨＩＶ药物的热点之一［８］。由于 ＨＩＶ
假病毒模拟病毒进入靶细胞的过程而不具备复制的
作用，因此，假病毒广泛用于筛选 ＨＩＶ－１的进入抑
制剂。从青果氯仿萃取液中提取的３个组分具有抑
制 ＨＩＶ假病毒的活性，提示这３个化合物很可能是
作用于病毒进入阶段的。
在 ＨＩＶ－１进入靶细胞过程中，病毒跨膜糖蛋白
ｇｐ４１发挥重要作用，其功能是介导 ＨＩＶ－１包膜与
靶细胞的融合［９］。而其中Ｎ－末端重复序列（Ｎ－ｔｅｒ－
ｍｉｎａｌ　ｈｅｐｔａｄ　ｒｅｐｅａｔ，ＮＨＲ）和Ｃ－末端重复序列（Ｃ－
ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｈｅｐｔａｄ　ｒｅｐｅａｔ，ＣＨＲ）参与形成的六股α－螺
旋束结构（ｓｉｘ－ｈｅｌｉｘ　ｂｕｎｄｌｅ）在病毒融合阶段中发挥
关键作用［１０］。在机制研究工作中，利用本研究团队
建立的夹心ＥＬＩＳＡ法［１１］，发现组分Ｉ和组分 Ｖ能
抑制ｇｐ４１六螺旋束结构的形成，其中组分Ｉ抑制
ｇｐ４１六螺旋束结构的形成与阳性药物 ＡＤＳＪ－１抑
制活性相当［１２］。因此ｇｐ４１的六螺旋束结构很可能
就是组分Ｉ和组分 Ｖ的作用靶点。而组分Ⅱ却不
能抑制ｇｐ４１六螺旋束结构，提示组分Ⅱ可能是作用
于 ＨＩＶ进入中的其它靶点，比如ｇｐ１２０与ＣＤ４的结
合［１３－１４］，ｇｐ１２０与辅助受体的结合［１５－１６］，融合多肽
等［１７］。组分Ⅱ的作用靶点亟待明确。
本实验旨在探讨青果氯仿萃取液中抗艾滋病毒
的活性成分。研究结果表明，利用高速逆流色谱法，
从青果氯仿萃取液中分离出３个具有显著抗ＨＩＶ－１
活性的组分，其中组分Ｉ、Ｖ作用于ｇｐ４１六螺旋束
结构，组分Ⅱ抗病毒活性有待进一步研究。各组分
有待进一步纯化，寻找抗 ＨＩＶ－１的活性成分，有望
开发出天然产物来源的抗病毒药物。
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［收稿日期］２０１４－０１－０８
［基金项目］黑龙江省教育厅面上项目（编号：１２５３１８００）　［作者简介］崔立然，女，博士，副主任药师，研究方向：中药多糖活性成分研究，电
话：１３７９６８７７０７７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｌｒｘｈ＠１２６．ｃｏｍ
姬松茸多糖对Ｔ淋巴细胞表面分子表达及γ干扰素分泌的影响
崔立然１，李洪军１，王宏艳１，刘颖２，徐浩２　 （１．齐齐哈尔医学院第一附属医院，黑龙江 齐齐哈尔，１６１０４１；２．齐齐哈尔医
学院，黑龙江 齐齐哈尔，１６１０００）
［摘要］　目的：研究姬松茸中分离纯化的低分子量多糖（ＡＢＰ－ＡＷ１）促进卵清白蛋白（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，ＯＶＡ）抗原诱导小鼠脾淋巴
细胞亚群效应细胞的应答格局的影响。方法：ＡＢＰ－ＡＷ１和ＯＶＡ皮下两点免疫ＩＣＲ小鼠，于０，１５　ｄ各免疫一次，第２８天分
离培养脾淋巴细胞，ＭＴＴ法测定脾淋巴细胞增殖，ＦＣＭ（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）分析免疫鼠脾中Ｔ淋巴细胞亚群ＣＤ４＋Ｔ和ＣＤ８＋Ｔ
的百分含量；免疫鼠脾淋巴细胞体外给予同种抗原再刺激２４　ｈ，分析ＡＢＰ－ＡＷ１对脾ＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞的表达及胞内
因子ＩＦＮ－γ＋ＣＤ４＋Ｔ的调节作用。结果：ＡＢＰ－ＡＷ１能增强ＯＶＡ诱导的Ｔｈ淋巴细胞亚群ＣＤ４＋Ｔ细胞，ＣＴＬ淋巴细胞亚群
ＣＤ８＋Ｔ细胞增殖；ＡＢＰ－ＡＷ１也能增进ＣＤ４＋Ｔ细胞早期活化标志ＣＤ６９＋百分比增加，诱导ＣＤ４＋Ｔ胞内Ｔｈ１型细胞因子
ＩＦＮ－γ分泌水平增多。结论：ＡＢＰ－ＡＷ１佐剂上调脾脏中淋巴细胞亚群的增殖，特别是Ｔｈ１细胞的募集和活化，研究结果为设
计理想的免疫佐剂提供了基础研究数据资料。
［关键词］　卵清白蛋白；姬松茸多糖；ＩＦＮ－γ；Ｔｈ细胞
［中图分类号］Ｒ９３２　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１４）１５－１２５１－０５　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１４．１５．０３
Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍＡｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ　Ｍｕｒｉｌ　ｏｎ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｃｅｌｓ　ｓｕｒ－
ｆａｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ＩＦＮ－γｓｅｃｒｅｔｉｏｎ
ＣＵＩ　Ｌｉ－ｒａｎ１，ＬＩ　Ｈｏｎｇ－ｊｕｎ１，ＷＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｙａｎ１，ＬＩＵ　Ｙｉｎｇ２，ＸＵ　Ｈａｏ２（１．Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｑｉｑｉｈａｒ
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｑｉｑｉｈａｒ　１６１０４１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｑｉｑｉｈａｒ
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｑｉｑｉｈａｒ　１６１００６，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｄｉｓｃｏｖｅｒ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＡＢＰ－ＡＷ１　ｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｓ　ｏｆ　ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ　ｓｕｂｓｅｔｓ　ｏｆ　ｍｉｃｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＯＶＡ
ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｍｉｃｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｏｗ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＡＢＰ－ＡＷ１）ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｏｆ　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ
Ｍｕｒｉｌ．ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＣＲ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｔｗｉｃｅ　ｗｉｔｈ　ＯＶＡ　ｍｉｘｅｄ　ｉｎ　ＡＢＰ－ＡＷ１　ｏｎ　Ｄａｙ　１　ａｎｄ　Ｄａｙ　１５．Ｓｐｌｅｎｏ－
ｃｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｏｎ　Ｄａｙ　２８，ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ．Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｅｒｃｅｎｔ　ｏｆ　ＣＤ４＋ａｎｄ　ＣＤ８＋Ｔ－ｃｅｌ　ｉｎ　ｐｅ－
ｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＦＡＣＳ．Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｗｉｔｈ　ＯＶＡ，ａｆｔｅｒ
ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｆｏｒ　２４　ｈ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ　ｓｕｒｆａｃｅ　ＣＤ４，ＣＤ６９（Ｔ　ｃｅｌ　ｅａｒｌｙ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒ）ａｎｄ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ
ＩＦＮ－γｗｅｒｅ　ａｓｓａｙｅｄ　ｗｉｔｈ　ＦＣＭ．ＲＥＳＵＬＴＳ　ＡＢＰ－ＡＷ１　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｅｒｃｅｎｔ　ｏｆ　ＣＤ４＋ａｎｄ　ＣＤ８＋Ｔ　ｌｙｍ－
ｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｂｏｔｈ　ｉｎ　ｓｐｌｅｅｎ；ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｓ（ＣＤ６９＋ＣＤ４＋）ｔｏ　ＣＤ４＋Ｔ　ｃｅｌｓ　ｉｎ　ＡＢＰ－ＡＷ１ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ
ＯＶＡ　ａｌｏｎｅ，Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＦＮ－γ＋ＣＤ４＋ Ｔ　ｄｏｕｂｌｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｓ　ｆｒｏｍ　ｍｉｃｅ　ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ　ＡＢＰ－ＡＷ１　ｗａｓ　ｍａｒｋｅｄｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ａｌｓｏ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　ＡＢＰ－ＡＷ１　ｃａｎ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｓｕｂｓｅｔｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｙ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔｈ１　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｕｓｉｎｇ　ＡＢＰ－ＡＷ１　ａｓ　ａｄｊｕｖａｎｔｓ　ｉｎ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｗｉｌ　ｂｅ　ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：ＯＶＡ；Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｌａｚｅｉ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＩＦＮ－γ；Ｈｅｌｐｅｒ　Ｔ　ｃｅｌ
·１５２１·中国医院药学杂志２０１４年８月第３４卷第１５期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｕｇ　２０１４，Ｖｏｌ　３４，Ｎｏ．１５