全 文 ：＊广东省高校重点科研项目和广东省重点科技攻关项目资助课题
＊＊通信联系人 , E-mail:tshenwz@jnu.edu.cn
作者简介:黄丽波(1975-),女 ,广东 ,硕士 ,从事天然产物的提取和
分析研究。
红藻琼枝麒麟菜中凝集素的提取 、纯化及其性质研究＊
黄丽波1 ,沈伟哉2＊＊ ,李药兰1 ,岑颖洲1 ,许少玉1
1.暨南大学生命科学技术学院化学系 ,广东 广州 510632
2.暨南大学医学院解剖学教研室 ,广东 广州 510632
摘要:目的 从琼枝麒麟菜中分离纯化凝集素 ,并测定其生物活性。方法 采用缓冲液低温提取 、40%～ 90%
(NH4)2SO4 分级盐析沉淀 、Sephadex G-75 凝胶过滤层析进行纯化;SDS-PAGE检测其纯度和测定分子量;考察该凝
集素凝血活性的血型专一性 ,糖抑制性及高温 、酸 、碱处理下的稳定性。结果 琼枝麒麟菜中有凝集素 , 分子量为
29000。该凝集素对人 A、B 、O和 AB 4种类型血细胞均显凝血活性 , 该活性对高温 、酸 、碱处理有较好的稳定性。结
论 琼枝麒麟菜中存在凝集素 ,其生物活性显著 。
关键词:琼枝麒麟菜;凝集素;凝血活性
中图分类号:R931.77;R937.71 文献标识码:A 文章编号:1006-0103(2002)06-0406-03
外源凝集素具有凝集细胞或沉降复合糖质的非
免疫起源的蛋白质或糖蛋白 ,凝集血细胞 、肿瘤细胞
并刺激淋巴细胞有丝分裂和沉降复合糖质等多种生
物活性[ 1] 。现已被广泛地应用于生物化学 、免疫学 、
组织化学 、临床诊断和疾病的治疗等[ 2 ,3] 。
琼枝麒麟菜(Eucheuma galetinae)属红藻 ,是麒
麟菜的一种 ,现主要被用于提取卡拉胶(一种重要的
食品工业用原料)。现从该海藻中分离得到一种凝
集素(lectin),并对其基本性质进行了研究 。
1 实验部分
1.1 材料和试剂
琼枝麒麟菜(海南省琼海市麒麟菜养殖基地),
正常人 A 、B 、O和 AB型血(本实验室的研究人员志
愿提供)。所用血球均在用前离心洗涤 3 次 , 配成
2%压积血球悬液 ,4℃冰箱放置备用 。Sephadex G-
75(Pharmacia);低分子量标准蛋白(上海丽珠东风
生物技术有限公司);其余试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 琼枝麒麟菜凝集素的提取分离和纯化 琼
枝麒麟菜原料经冷冻后 ,用粉碎机粉碎成粉末状 ,加
入0.01 mol·L-1 , pH 7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)浸
提 ,4℃冰箱内间歇搅拌提取 24 h , 4℃,离心 20 min
(10000 r·min-1),分离得粗提液。向粗提液中加入
固体(NH4)2SO4 达 40%的饱和度 ,搅拌溶解后置冰
箱内放置 12 h ,4℃,离心 20 min(10000 r·min-1),分
离出上清液 , 继续向上清液中加入固体(NH4)2SO4
至 90%饱和度 ,搅拌溶解后冰箱内放置 12 h ,同前
条件离心 ,其沉淀透析除盐 ,冷冻干燥得琼枝麒麟菜
凝集素粗品(EGL)。
称取 EGL 200 mg 溶于 10 ml生理盐水中 ,经
Sephadex G-75 葡聚糖凝胶柱(60 cm),以 pH 7.4的
0.05 mol·L-1 PBS 洗脱 ,使用 Bio -Rad Econo System
仪器 ,调节流速 0.5 ml·min-1 ,紫外检测器吸收波长
为 280 nm ,灵敏度 0.5 AUFS ,按吸收峰方式收集(有
吸收峰时仪器自动收集),每管 6 ml ,收集产物平行
检测凝血活性 ,合并有凝血活性的各管 ,用蒸馏水充
分透析后 ,冷冻干燥得 EGL纯品 。
1.2.2 纯度测定 按 Laemmli[ 4]的蛋白质 SDS -
PAGE 方法 ,采用不连续系统 ,以甘氨酸-Tris缓冲
液为电极缓冲液 ,在20mA电流 、130V电压条件下 ,
电泳 4 h ,考马斯亮兰 R250染色 ,醋酸-甲醇-水(6∶
3∶1)脱色处理后 ,对凝胶拍照记录。同时以低分子
量标准蛋白质作对照 ,测定样品的分子量 。
1.2.3 凝集活性的测定 采用“V”型血凝板倍比稀
释法[ 5] ,即在“V”型 96孔微量血清稀释板上 ,在第 2
～ 12孔中分别加入 25 μl 0.14 mol·L-1NaCl液。第 1
孔再加入50μl样品(浓度为0.5 mg·ml-1 ,0.9%的生
理盐水配制),然后取出 25 μl 对 2 ～ 12孔进行倍比
稀释 , 最后每孔加入人 O 型血球悬液 25 μl , 振荡
1 min后 ,室温放置 2 h ,观察结果。
1.2.4 血型专一性实验 按凝集活性测定方法进
行 ,在 EGL样品倍比稀释后 ,分别加入 25 μl A 、B 、O
和 AB型血球悬液进行实验 。
1.2.5 糖抑制实验 按凝集活性测定方法进行 ,在
EGL 样品倍比稀释后 ,分别加入 25 μl 80 mmol·L-1糖
华西药学杂志
W C J · P S 2002 , 17(6):406～ 408
DOI :10.13375/j.cnki.wcjps.2002.06.002
溶液(均用 0.9%的生理盐水配制),振摇混匀后室
温放置 30 min ,再向各孔加入 25 μl人血红细胞 ,测
定各种糖对凝血活性的抑制作用。
1.2.6 EGL 的热稳定性 取 0.5 mg·ml-1的 EGL 溶
液0.1 ml置于带盖的试管中 ,分别于每个试管中加
入 EGL溶液 0.1 ml ,在恒温水浴中分别在不同的温
度(20 ～ 90℃,每隔 10℃处理一个样品)下保温处理
10 min后 ,立即用自来水流水冷却至室温 ,随后在
“V”型血凝板上测定凝血活性。
1.2.7 EGL的酸碱稳定性 取 0.5 mg·ml-1的 EGL
溶液 0.1 ml置于试管中 ,分别在柠檬酸-氢氧化钠
-盐酸缓冲液(pH 2 ～ 3), 0.2 mol·L-1Na2HPO4 -
NaH2PO4缓冲液(pH 4 ～ 8), 0.1 mol·L-1 Na2CO3 -
NaHCO3 缓冲液(pH 9)的梯度酸碱环境处理 12 h ,然
后调 pH 7.2 ,在“V”型血凝板上测定凝集活性 。
2 结果
2.1 EGL 的纯化
经(NH4)2SO4 分 级盐 析的 EGL 粗 品 , 用
Sephadex G-75凝胶过滤层析进一步纯化后 ,获得 3
个蛋白质吸收峰(图 1),经凝血活性检测 ,仅第 3峰
有凝血活性 ,此峰收集产物 ,经蒸馏水透析除盐 ,冷
冻干燥后得 EGL样品。
图 1 EGL粗品 Sephadex-75 凝胶柱的洗脱曲线
Fig1 The elution curve of EGL crude on Sephadex-75 gel filtration
2.2 EGL纯化产品的纯度
EGL纯化样品经 SDS-PAGE鉴定呈单一色带 ,
说明获得 EGL 的纯品。与蛋白质分子量标准对照
可知 ,EGL 的分子量为 29 KD(图 2)。
图2 EGL样品的 SDS-PAGE结果
Fig 2 Polyacrylamide gel electrophoresis of EGL
2.3 EGL的凝集活性
EGL可凝集人O型血细胞 ,凝血滴度为 25 ,发生
凝血反应的最低 EGL浓度为15μg·ml-1 。
2.4 EGL的血型专一性
EGL 可凝集人 A 、B 、O 和 AB 4 种血型的血细
胞 ,无血型专一性 。
2.5 EGL的热稳定性
EGL 的凝集活性在 20 ～ 50℃间保持不变 ,在
60℃时下降了一个滴度 ,当温度上升至 90℃时 ,其
凝血活性基本丧失(图 3)。
图 3 凝集活力-温度曲线
Fig 3 Hemagglutinating activity temperature curve
2.6 EGL的酸碱稳定性
EGL 的凝集活性对酸碱有较好的稳定性 ,在 pH
2和 pH 9的酸碱处理下均有凝集活性(图 4)。
2.7 糖类对 EGL凝血活性的抑制作用
所试验的 10种单 、双糖中 ,除了麦芽糖有微弱
的抑制作用外 ,其余的糖对 EGL 的凝集活性均无抑
制作用 。
3 讨论
琼枝麒麟菜在我国资源丰富 ,海南省琼海市已
有麒麟菜人工养殖基地。文中用低温提取 、分级盐
析沉淀 、凝胶过滤层析得到麒麟菜凝集素的纯品。
该凝集素具有较好的热稳定性及酸碱稳定性 ,可凝
集人 A 、B 、O 和 AB 4种血型的血细胞 ,对肿瘤细胞
有某种抑制生长作用(另文发表)。刺激淋巴细胞有
丝分裂及沉降复合糖质等多种生物活性的研究有待
进行。
图 4 凝集活力-pH 值曲线
Fig 4 Hemagglutinating activity-pH curve
凝集素广泛地分布于各种生物体中 ,从陆上生
物来看 , 豆科植物是凝集素的主要来源 , 约占
407第 6期 黄丽波 , 等。红藻琼枝麒麟菜中凝集素的提取 、纯化及其性质研究
37.2%,其它植物的凝集素分布于 11个科中 ,另外
还有少数来源于真菌 ,动物或人的凝集素。对海藻
中存在的凝集素研究很少 ,尤其是对中国不同海域
的相同或不同海藻的研究很缺乏 。随着研究的深
入 ,对源自海藻的凝集素特性和对人体的生理 、病理
生理作用必将日渐清楚。
参 考 文 献
1 堀贯治.海藻凝集素[ J] .化学と生物 ,1994 , 32(9):586
2 高莹 ,瞿礼嘉 , 陈章良.植物凝集素的分子生物学研究[ J] .生物
技术通报 , 2000 ,5:18
3 Roger CB, Hans JH , Pierre YA.A novel assay for the detection of ab-
normally glycosylated forms of IgG[ J] .Med Sci Res , 1992 , 20:83
4 屠红 .聚丙烯酰胺凝胶电泳和电印迹[M] .见:夏其昌.蛋白
质化学研究技术与进展.北京:科学出版社 , 1997.99
5 孙册,朱政.凝集素[M] .北京:科学出版社 , 1986
收稿日期:2002-05
PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF LECTIN
FROM RED ALGA EUCHEUMA GELATINAE
HUANG Li-bo1 , SHEN Wei-zai2 , LI Yao-lan1 , CEN Yin-zhou1 , XU Shao-yu1
1.Department of Chemistry , Life Science and Technology College , Jinan University , Guangzhou 510632 , China
2.Department of Anatomy , Medical College , Jinan University , Guangzhou 510632 , China
Abstract:OBJECTIVE To isolate and purify the lectin from
red algae Eucheuma gelatinae , and to investigate its bioactivities.
METHODS We extracted the lectin with PBS buffer at low tem-
perature and then partial precipitated it with 40% - 90%
(NH4)2SO4.The lectin was purified by Sephadex G-75 gel filtra-
tion and its molecular weight was determined by SDS-PAGE.We
studied the human blood type specificity to the lectin and the inhibi-
tion effect of monosaccharides and disaccharides to its hemaggluti-
nating activity.We also studied its stability when treated with heat ,
acid or alkali.RESULTS The lectin , designated as gel , with
molecular weight of 29 000 on SDS-PAGE.Hemagglutinating test
revealed that EGL can hemagglutinate A , B , O , and AB four differ-
ent types of human erythrocyte.The hemagglutinating activity is sta-
ble over a wide pH range and at a relatively high temperature.
CONCLUSION There exists lectin with hemagglutinating activity
in red alga Eucheuma galetinae.
Key words:Eucheuma gelatinae;Lectin;Hemagglutinating activity
CLC number:R931.77 , R937.71 Document code:A Article ID:1006-0103(2002)06-0406-03
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408 华 西 药 学 杂 志 第 17卷