全 文 ：第 1 9卷
1 9 94年
第 6期
1 2月
湖 南 医 科 大 学 学 报
BU L L I E T NO F U A H N NMI D EC L AU I RV N ESI Y T
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.
1 9 N o
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.
1 9 94
山苍子油乳剂的抗菌机制研究①
临床微主物学免疫学教研室
傲 生 物 学 教 研 室
李沛涛 周 坚 查国章 成 雯
夏忠第 杨军祥
提要 应 用电镜和 同位素掺入试验 , 研 究山 苍子 油 乳剂 杭金黄色 蔺萄球 菌 、 绿脓杆 菌和 白 色
芯 珠 菌的机 制 。 结 果表明 : 药物 作用 后 , 三 种 菌的 细 胞壁 、 细 胞膜均受到 不 同程度 的损 害 , 胞 浆
门 容物漏 出 ; 三 种 菌的 D N A , R N A , 蛋 白质 , 细 菌的肤 聚糖和 白色念珠 菌麦角 固醉的合成均 受到
明 显抑制 。 提 示 山 苍子 油 乳 剂是 作用 于 细 菌胞 壁的肤 聚糖 和真菌胞壁的甘 露聚糖 、 几 丁质及胞膜
的麦角固醉
关键词 山 苍子油 ` ; 金黄 色葡萄球 菌 ; 绿 脓杆 菌 ; 白色念珠菌 ; 超微结 构 ;
同位素 ; 药物作用 ; 药理学
山苍子油系从樟科木姜子属植物山苍子
,
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,`乃e b a ( L o u r S . ) P e r S 〕 果实中提取
的挥发油 , 无毒 , 具芳香气味 。 它不但被用
于化工和食品 , 且具有广泛的医疗作用 。 70
年代以来 , 学者们的研究表明 , 山苍子油具
有广谱抗菌作用 , 能有效地预防烧伤创面感
染 〔`了 , 但其抗菌机制尚未见 国内外报道 。 为
此 , 作者选择常见的金黄色葡萄球菌 (简称
金葡菌 ) 、 绿脓杆菌及白色念珠菌作为靶菌 ,
通过超微结构的改变和 同位素前体掺入试
验 , 研究山苍子油的抗菌机制 , 旨在为其进
一步的药用开发提供理论依据 。
材料与方法
1
.
1 菌株 和试 剂 金葡菌 ( 26 1 12 一 2 ) 、 绿脓杆菌
〔1 02 1 1) 由北京中国菌种保藏中心提供 ; 白色念珠菌
( ID 1 6 U )山中国医学科学院真菌保存中心 (南京 )提
供 。 山苍子 油 乳剂由湖南省轻工 业 研究所 提 供 。
M u e l le r H in r o n 培养基购 自杭州生物试剂厂一 。 同位
素标记前体 〔3 H 〕 一 T d R , 〔名H 〕 一 U R , 〔 3 H 〕 一亮氨酚 、
〔 3 H 〕 一葡糖胺和 〔’℃〕 一醋酸钠 , 均由中国科学院上
海及北京核技术开发公 司提供 。
1
.
2 药物敏感性 试脸 2 山苍子油乳剂对金 葡菌
及绿脓杆菌最小抑菌浓度 (M IC ) 测定用琼脂稀释
法 , 重复 6 次 。 对白色念珠菌的 M CI 测定 , 用液体
稀释法 , 重复 5 次 。
1
.
3 透 射 电镜 ( T EM ) 标 本 的制 作及 观 察比 4〕
( l) 金葡菌 : 应 用 M CI 的药物作用 于对数生长期细
菌 ( O D “ 。 一 1 ) , 分别于作用前及 37 C 作用后 h6 和
1 8 h 取标本 。 ( 2) 绿脓杆菌 : 处理同上 , 分别于作用
前及作用 后 1 5m in , 3 o m in , 4 5 m in , l h , 3h , 6h 和
1 8 h 取标本 。 ( 3 ) 白色念珠菌 : 对数生长期菌 ( O D 6。 。
~ 0
.
2) 处理同上 , 分别于作用前及 2 8 C 作用后 h3
和 s h 取标本 。 所有标本先用 2 . 5 %戊二醛预固定制
成琼脂块 , 尔后经饿酸 后固定 , 脱水 , 切片 , 染色 。
l洪 )4 一 。 7一。4 收稿 ! 国家自然科学基金资助项 目
4 7 1
置 H 60 OA 一 2透射电镜下观察 。
1
.
4 扫描 电锐 S( EM )标本 的制作及观察川 金葡
菌和绿脓杆菌均以 M CI 的药物作用 , 于作用前和作
用后 3 h , h6 , 12 h , 18 h 取标本 ; 白色念珠菌于作用
前及作用后 h3 , h5 取标本 , 用 2 . 5% 戊二醛预固定 ,
饿酸后固定 , 滴膜 , 脱水 , 喷金 。 置 SJ M 一 30 扫描
电镜下观察 。
1
.
5 同位素前体掺 入 试验 〔 6 、 , , 以 〔 3 H 〕 一 T d R ,
〔3 H 〕 一U R , 〔, H 〕 一亮氨酸 , 〔 , H 〕葡糖胺 (各标记前
体的终末浓度为 0 . 5井 iC /m l) 进行同位素掺入试验 ,
以 1 / 4M IC , M I C , 4M I C 药物作用 于对数生长期的
金葡菌 , 以 l / ZM I C , M I C , ZM IC 药物作用于对数
生长期的绿脓杆菌 , 分别测定各菌 D N A , R N A , 蛋
白质和肤聚糖的生物合成 。
取对数生长期的液体培养物 5 . 4m l , 加入 3拜iC
的同位素标记前体和 0 . 6m l 不同浓度的药物 , 同时
作生理盐 水对 照 , 置 37 ’C 振荡 培养 ; 于 作用后
2 5m i n
, 取 0 . s m l 样 本 加入 s m l 2 0 %三 氯 醋 酸
( T C A ) 中 , 作用 3 o m i n ; 样本通过 Wh a t m a n 玻璃纤
维滤纸过滤 ; 滤纸分别用 l o m l s % T C A 及 l o m l D W
各洗 3 次 ; 3 7 C 烘干后 , 置 s m l 闪烁液中于 B e e h m a n
15 3 8 0 1 液闪计数器中检测 , 测定 C PM 值 。
白色念珠菌则以 l4[ C 〕 一醋酸钠取代 〔3 H 〕 一葡
糖胺以观察其麦角固醉的生物合成 〔的 。 所用药物浓
度与绿脓杆菌者相同 。 样本置 28 、 C振荡培养 3 o m in 。
其他操作同上 。
将试验组与对照组的平均 C P M 比较 , 计数掺
入抑制率 。
2 结 果
2
.
1 药物敏感性 浏定 山苍子油乳剂 M CI 如下 :
金葡菌 1 : 1 6 0山 绿脓杆菌 1 : 20 ; 白色念珠菌 1 :
1 2 8 0
。
2
.
2 透射电镜观察 金葡菌 :药物作用 h6 后 , 胞壁
逐渐变疏松 , 胞膜不可见 , 最终胞壁 、 胞膜崩溃 , 胞
浆内容物随之漏出呈残渣状 (图 I A 、 IB ) 。 绿脓杆
菌 : 药物作用 3 h 后 , 菌体显著膨胀 (图 ZA 、 ZB ) ;
核质及核糖体移向周边 ,胞壁内层完全消失 ,仅残留
不全的外膜包裹胞浆内容物 。 随时间延长 ( 1 8 h ) , 内
容物外溢 , 菌体形同驱壳 (图 ZC ) 。 白色念珠菌 : 药
物作用 s h 后 , 胞壁疏松破裂 , 胞膜丧失 , 最后仅剩
下无包裹的菌块 , 但无残渣形成 (图 3A 、 3 B ) 。
2
.
3 扫描 电镜观 寨 药物作用后 , 可见三种菌体有
如下主要变化 : 金葡菌外形 毛糙 , 菌体间显著粘连 ;
绿脓杆菌菌体膨胀 ; 白色念珠菌则互相融合 (图 4 一
6 )
。
2
.
4 同位素前体捧入试验 分别用各菌的 3 个 不
同浓度的药物作用 25 ~ 30 m i n . 后 , 可见 三种菌的
T d R
,
u R
, 亮氨酸和葡糖胺 /醋酸钠的掺入抑制率均
明显增高 (见附表 ) , 反映了三种菌的 D N A , R N A ,
蛋白质 , 金葡菌和绿脓杆菌的肤聚糖和 白色念珠菌
麦角固醉的生物合成均受到不同程度的抑制 , 且其
抑制率与药物浓度成正相关 。 比较三种菌的 M CI
组 , 以金葡菌所受的抑制最强 , 其次为绿脓杆菌 , 白
色念珠菌居第三 , 但其麦角固醇的合成被显著抑制 。
掺入抑制率 - 对照组 C PM 一药物组 C PM对照组 C P M X 1 0 0 %
附表 山苍子油乳剂对金葡菌 、 绿脓杆菌 、 白色念珠菌
四种同位素标记前体的掺入抑制率
菌 种 药物浓度 作用时间
( m i n )
掺入抑制率 ( % )
T d R U R 亮氨酸 葡萄胺 /醋酸钠
56834271劝ù匕11左`亡Jl合OC八ù J注`QéJ任QUQUCO众八hg]亡刁尸匀八乙RùQ自nù匕目O凸ō舀月吮内bǎ袄O口匕叹U, I山4ù刁ū了J任nj八J月叹UnjOCO口O自一吕O口nj匕LJ弓子月住任亡n氏J工匕己JS亡Jn0,自Q口9曰O自曰夕gJdC乃金葡菌 l / 4M IC
M IC
绿脓杆菌
4M IC
l / ZM IC
M IC
ZM IC
白色念珠菌 l / ZM I C
M IC
ZM I C
4 7 2 湖南 医科大学学报 1 9 9 4 ; 19 ( 6 )
置 H 60 OA 一 2 透射电镜下观察 。
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4 扫描 电锐 (S E M ) 标本 的制作及观察川 金葡
菌和绿脓杆菌均以 M IC 的药物作用 , 于作用前和作
用后 3 h , h6 , 12 h , 18 h 取标本 ; 白色念珠菌于作用
前及作用后 h3 , h5 取标本 , 用 2 . 5% 戊二醛预固定 ,
饿酸后固定 , 滴膜 , 脱水 , 喷金 。 置 SJ M 一 30 扫描
电镜下观察 。
1
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5 同位素前体掺 入 试验 〔 6 、 , , 以 〔 3 H 〕 一 T d R ,
〔3 H 〕 一U R , 〔, H 〕 一亮氨酸 , 〔 , H 〕葡糖胺 (各标记前
体的终末浓度为 0 . 5井 iC /m l) 进行同位素掺入试验 ,
以 1 / 4M IC , M I C , 4M I C 药物作用 于对数生长期的
金葡菌 , 以 l / ZM I C , M I C , ZM IC 药物作用于对数
生长期的绿脓杆菌 , 分别测定各菌 D N A , R N A , 蛋
白质和肤聚糖的生物合成 。
取对数生长期的液体培养物 5 . 4m l , 加入 3拜iC
的同位素标记前体和 0 . 6m l 不同浓度的药物 , 同时
作生理盐 水对 照 , 置 37 ’C 振荡 培养 ; 于 作用后
2 5m i n
, 取 0 . s m l 样 本 加入 s m l 2 0 %三 氯 醋 酸
( T C A ) 中 , 作用 3 o m i n ; 样本通过 Wh a t m a n 玻璃纤
维滤纸过滤 ; 滤纸分别用 l o m l s % T C A 及 l o m l D W
各洗 3 次 ; 3 7 C 烘干后 , 置 s m l 闪烁液中于 B e e h m a n
15 3 8 0 1 液闪计数器中检测 , 测定 C PM 值 。
白色念珠菌则以 l4[ C 〕 一醋酸钠取代 〔3 H 〕 一葡
糖胺以观察其麦角固醉的生物合成 〔的 。 所用药物浓
度与绿脓杆菌者相同 。 样本置 28 、 C振荡培养 3 o m in 。
其他操作同上 。
将试验组与对照组的平均 C P M 比较 , 计数掺
入抑制率 。
2 结 果
2
.
1 药物敏感性 浏定 山苍子油乳剂 M CI 如下 :
金葡菌 1 : 1 6 0山 绿脓杆菌 1 : 20 ; 白色念珠菌 1 :
1 2 8 0
。
2
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2 透射电镜观察 金葡菌 :药物作用 h6 后 , 胞壁
逐渐变疏松 , 胞膜不可见 , 最终胞壁 、 胞膜崩溃 , 胞
浆内容物随之漏出呈残渣状 (图 I A 、 IB ) 。 绿脓杆
菌 : 药物作用 3 h 后 , 菌体显著膨胀 (图 ZA 、 ZB ) ;
核质及核糖体移向周边 ,胞壁内层完全消失 ,仅残留
不全的外膜包裹胞浆内容物 。 随时间延长 ( 1 8 h ) , 内
容物外溢 , 菌体形同驱壳 (图 ZC ) 。 白色念珠菌 : 药
物作用 s h 后 , 胞壁疏松破裂 , 胞膜丧失 , 最后仅剩
下无包裹的菌块 , 但无残渣形成 (图 3A 、 3 B ) 。
2
.
3 扫描 电镜观 寨 药物作用后 , 可见三种菌体有
如下主要变化 : 金葡菌外形 毛糙 , 菌体间显著粘连 ;
绿脓杆菌菌体膨胀 ; 白色念珠菌则互相融合 (图 4 一
6 )
。
2
.
4 同位素前体捧入试验 分别用各菌的 3 个 不
同浓度的药物作用 25 ~ 30 m i n . 后 , 可见 三种菌的
T d R
,
u R
, 亮氨酸和葡糖胺 /醋酸钠的掺入抑制率均
明显增高 (见附表 ) , 反映了三种菌的 D N A , R N A ,
蛋白质 , 金葡菌和绿脓杆菌的肤聚糖和 白色念珠菌
麦角固醉的生物合成均受到不同程度的抑制 , 且其
抑制率与药物浓度成正相关 。 比较三种菌的 M CI
组 , 以金葡菌所受的抑制最强 , 其次为绿脓杆菌 , 白
色念珠菌居第三 , 但其麦角固醇的合成被显著抑制 。
掺入抑制率 - 对照组 C PM 一药物组 C PM对照组 C P M X 1 0 0 %
附表 山苍子油乳剂对金葡菌 、 绿脓杆菌 、 白色念珠菌
四种同位素标记前体的掺入抑制率
菌 种 药物浓度 作用时间
( m i n )
掺入抑制率 ( % )
T d R U R 亮氨酸 葡萄胺 /醋酸钠
56834271劝ù匕11左`亡Jl合OC八ù J注`QéJ任QUQUCO众八hg]亡刁尸匀八乙RùQ自nù匕目O凸ō舀月吮内bǎ袄O口匕叹U, I山4ù刁ū了J任nj八J月叹UnjOCO口O自一吕O口nj匕LJ弓子月住任亡n氏J工匕己JS亡Jn0,自Q口9曰O自曰夕gJdC乃金葡菌 l / 4M IC
M IC
绿脓杆菌
4M IC
l / ZM IC
M IC
ZM IC
白色念珠菌 l / ZM I C
M IC
ZM I C
4 7 2 湖南 医科大学学报 1 9 9 4 ; 19 ( 6 )
药物的影响 。 白色念珠菌的细胞壁至少含有
5层 , 其中甘露糖含量最多 , 贯穿全壁 , 最内
层主要含几丁质和葡聚糖 。 几丁质又是由几
丁质酶利用尿啼咤二磷酸盐 、 N 一乙酸葡糖胺
作为基质而合成的〔` “〕 。 细菌和真菌细胞膜的
主要功能是物质转运与营养 , 呼吸及生物合
成作用 。 真菌细胞膜的化学组成有别于细菌
者除了磷脂双层外 , 还含有麦角固醇〔 `’ 〕 。
山苍子油含 26 种以上的化学活性物质 ,
其杀菌的有效成份主要 为柠檬醛 〔` 2〕 。 醛基是
亲水基 , 易被细菌表面的亲水基吸附而穿入
胞壁 . 破坏肤聚糖结构 , 故金葡菌细胞壁遭
受的破坏远较绿脓杆菌严重 。 细胞膜内渗透
压达 5一 25 个大气压 , 由于胞壁崩溃 , 胞膜
的通透性增强 , 外部低渗的水份进入胞浆 ,因
而胞膜破坏胞内容物大量漏出 , 导致 D N A 、
R N A
、 蛋 白质大量散失 。 此外 , 醛类还可与
菌体蛋 白质官 能基团一 S H , 一 N H : , 一 C H
及一 C O O H 等发生化学作用 , 使其 失活 〔的 。
绿脓杆菌的外膜对药物耐受性较强 , 肤聚糖
虽被破坏 , 菌体因水分进入而膨胀 , 但在 同
样条件下大部分细菌仍能维持基本外形 。 念
珠菌几丁质有稳定细胞壁的功能 ,一旦丧失 ,
胞壁即出现皱折 、 萎缩 、 凹陷 , 在胞壁毗邻
处相互融合〔 , 2〕 。 此外 , 从麦角固醇的明显降
低来看 , 念珠菌的细胞膜也受到严重损害 ,不
但胞浆内容物漏出 , 结合于胞膜的各种酶 的
活性亦遭破坏 。 这也是金葡菌和绿脓杆菌大
分子合成降低的原因之一 。 除醋酸钠外 , 念
珠菌其他三种标记前体掺入抑制率相对较
低 , 可能系因真菌的新陈代谢较之细菌要缓
慢得多的缘故 。
参 考 文 献
马恩庆 , 谢利华 . 戴贻亮 , 等 . 抗每毒剂 H D 乳剂防治
烧伤创面 感染 的研 究 . 湖南 医学 院学 报 , 19 86 ; l]
( 4 )
:
3 73 一 3 76
兰鸿泰 . 细菌对抗菌药物的敏感试验 . 见 : 张颖悟 主
编 , 临床微生物学 , 大连 : 大连出版社 . 19 9 0 : 6 48 一
6 5 3
洪涛 , 周静仪 , 洪明理 . 超薄切 片技术 . 见 : 洪涛主编
. 生物医学超 微结 构与电子显微镜技术 . 北京 : 科学出
版社 , 1 9 8 0 : 1 2 5一 1 2 7
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A g e n t s C h e m o t h
,
19 92 ; 36 ( 8 )
:
17 7 9一 1 7 8 1
涂滋 · 消毒剂的杀菌机理 · 见 : 黄翠芬主编 · 医学细
菌分子生物学进展 , 北京 : 科学 出版社 , 19 8 4 : 5 一 63
C a l d e r o n e R A
,
B r a u n P C
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e r e n e e a n d r e e e P t o r r e
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G e r m a n y
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r l i n H e l d b e r g
:
S p r
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一
v e r l a g 1 9 9 1 ; 6 1一 63
李开泉 , 唐陶 . 山苍子精油抗真菌有效成分的研究 .
中国医院药学杂志 , 19 5 6 ; 6 ( 1 1 ) : 3一 6
4 7吸 湖南医科大学学报 19 9 4 ; 1 9 ( 6)
A R E S E A R C H O N A N T I B A C T E R I A L M E C H A N I S M
O F L I T S E A C U B E B A O I L E M U L S I O N
L i P e i t a o Z h o u J i a n Z h a G u o z h a n C h e n g W
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肠户“ r t , e , t of C l i n , c a l M i c r o bi o l o舒 , H u n a 。 材亡d ` e a l U , ` v er s : yt
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u n x i a n g
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T h e u l t r a s t r u e t u r a l a l t e r a t i o n u n d e r e l e e t r o n m i e r o s e o p e
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i s o t o p e l a b e l l e d P r e e u s o r w e r e u s e d t o s t u d y t h e a n t ib a e t e r i a l m e e h a n i s m o f L i t s e a
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o c o c c u s a u r e u s , P s e u d o m o n a : a e
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n d i d a a l b i c a ,` 、 . T h e r e -
s u l t s e x h i b i t e d t h a t t h e e e l l w a l l a n d e e l l m e m b r a n e o f t h e s e m i e r o b e s w e r e d a m a g e d 一n v a r i
o u s d e g r e e s
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t h e b i o s y n t h e s is o f D N A
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山苍子油乳剂的伉菌机制研究 李沛涛等 4 7 5