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二氧化碳超临界萃取山苍子油及其抗氧化效能测定



全 文 :收稿日期:2012-02-20
基金项目:福建省科技厅项目(JA08076);2010年福建农林大学省部级科技创新平台开放基金项目
作者简介:李 芳(1963-),女,福建福安人,教授,博士,硕士生导师,主要从事生物农药研究.
第27卷第2期 徐 州 工 程 学 院 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2012年6月
Vol.27No.2 Journal of Xuzhou Institute of Technology (Natural Sciences Edition) Jun.2012
二氧化碳超临界萃取山苍子油及其抗氧化效能测定
李 芳,吴健斌,徐会有
(福建农林大学 植物保护学院,福州 350002)
  摘要:应用二氧化碳超临界萃取法提取山苍子油,以正交设计法考察萃取温度、压力、流量、时
间对提取效率的影响,与此同时,以DPPH法测定山苍子油的抗氧化活性,并首次研究了夹带剂使
用与不同提取时段对山苍子油提取率及其抗氧化效能的影响.结果表明:在50℃、25MPa压力和
40L/h流量时,油得率可高达36.7%;单位时间内山苍子油得率随着时间推延呈锐减趋势,第1时
段(0~20min)占总出油量的80.86%~97.11%;但从抗氧化效能看,第2时段(20~40min)得到
的山苍子油透明度高,抗氧化效果也明显优于前者;在超临界萃取过程中加入夹带剂可以显著提高
山苍子油得率及山苍子油的抗氧化活性,以乙酸乙酯为夹带剂,萃取率最高可达45.88%;以甲醇
为夹带剂时,山苍子油的抗氧化活性达到最佳值,DPPH法测得IC50仅为0.30g/L,而对照组IC50
为7.63g/L.
关键词:山苍子;CO2 超临界萃取;抗氧化活性测定;夹带剂
中图分类号:S573+.8 文献标识码:A 文章编号:1674-358X(2012)02-0016-05
目前,食品工业中通用的人工合成抗氧化添加剂(BHA,BHT)在安全性方面普遍受到质疑,美国、欧共
体等已禁止使用合成抗氧化剂,许多国家也对其添加量加以限制,因此,从中草药中提取广谱、高效、安全的
天然食品抗氧化剂日益受到重视并成为当今食品、医药研究的热点[1].
山苍子(Litsea cubeba)系樟科木姜子属落叶小乔木,为我国重要的林副特产之一.山苍子叶、花及果皮
广泛用于食品、医药、农药、化妆品以及其它日用品.从果实提炼得到的山苍子油是化工、轻工、环保等行业生
产的重要原料之一,也是一种优良的食品抗氧化剂[2-3].近十年来,超临界流体萃取(SFE),尤其是CO2 超临
界萃取技术受到越来越多的关注[4-10].然而,天然抗氧化产物往往是极性物质,而超临界CO2(SC-CO2)流体
对溶质选择性较弱,对强极性物质的提取能力较低.多项研究表明:极性夹带剂可以显著提升SC-CO2溶剂
系统的极性,大大提高萃取组分在SC-CO2 中的溶解度,在操作压力不变的情况下,就可使萃取组分的释放
度明显提升[11].利用SC-CO2 萃取法提取山苍子油已有研究[12-13],但夹带剂以及萃取时段对提取率以及抗
氧化活性的影响未见报道.本实验以SC-CO2 萃取法提取山苍子油,采用正交设计法研究萃取温度(40,50,
60℃);压力(20,25,30MPa);流量(20,30,40L/h)对萃取率及其抗氧化效能的影响,并设置了分时段萃取
(10,20,30,40min)以及夹带剂 (甲醇、乙酸乙酯)实验.
1 材料与方法
1.1 材料
山苍子干果购于福建福安,由福建农林大学生命科学学院植物组副教授何可僧鉴定.
主要试剂:DPPH (1,1-diphenyl-2picryhydrazy1)购自美国Sigma公司;乙醇、甲醇、乙酸乙酯等分析纯
有机溶剂皆购自上海国药集团.
主要仪器设备:HA120-50-01型超临界萃取装置(南通华安超临界萃取有限公司);R-205旋转蒸发器
(上海申胜生物技术有限公司);FS2 180万能粉碎机 (江苏黎明制药机械有限公司),WJ 7200型可见光分光
光度计 (尤尼柯上海仪器有限公司).
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DOI:10.15873/j.cnki.jxit.2012.02.013
高纯度CO2 气体由福州中铭工业气体有限公司提供.
1.2 方法
1.2.1 正交实验设计
本实验选定萃取压力、温度、CO2流量为因素,根据正交实验法设计形成L9(33)正交实验表,见表1.
表1 因素及水平选择表
实验号 温度/℃ 压力/MPa  CO2流量/(L/h)
1  40  20  20
2  40  25  30
3  40  30  40
4  50  20  30
5  50  25  40
6  50  30  20
7  60  20  40
8  60  25  30
9  60  30  20
1.2.2 SC-CO2 萃取
先用万能粉碎机将山苍子果实粉碎,过20目筛.将50g过筛后的山苍子粉末投入萃取釜中,按照超临
界萃取装置标准操作规程,按表1参数设置分别进行循环萃取,并保持恒温恒压.60min后,从分离釜I出料
口出料,得棕黄色的油状萃取物,计算总萃取率.
时段设置:在50°C,25MPa,40L/h萃取条件下,对分离罐中的提取物进行分时段收集,即每隔10min
收集1次.总共为4次.实验重复3次,取平均值.
夹带剂:实验分为甲醇组、乙酸乙酯组和无夹带剂对照组,根据夹带剂使用的标准操作规程,每次取100
mL夹带剂于携带剂罐中,开启泵Ⅱ使得净化后夹带剂进入萃取流程.萃取温度设置为50℃,调节萃取压力
为25MPa,流量为40L/h,60min后收集油与溶剂混合物,利用旋转蒸发仪器在常温下进行精油与夹带剂
的分离.
1.2.3 抗氧化活性测定
DPPH抗氧化效能测定:精确称取0.015g DPPH粉末,用250mL无水乙醇溶解为储备液存于4℃冰
箱中.临用前稀释成质量浓度0.012g/L.用移液枪取100μL山苍子油 (约0.08g)并加入4.9mL乙醇稀
释成初始质量浓度16g/L,接着以折半稀释法形成4个质量浓度:8,4,2,1g/L.取1mL山苍子油稀释液于
试管中,分别加入2mL DPPH乙醇溶液,振荡摇匀,于室温下避光静置反应30min,测定溶液在517nm处
的吸光值为Ai;于此同时,分别在1mL以上稀释液中加入2mL乙醇,于室温下避光静置30min,测定吸光
值为Aj;2mL DPPH溶液与1mL乙醇混合静置30min,测得的吸光值为Ac.
DPPH 自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%.每个样品重复测3次,取平均值.应用 Microsoft
Excel拟合回归方程,当R2>0.9时得出方程,取Y 值为50,得出IC50,即达到50%自由基清除率的山苍子
油质量浓度,IC50值越小表明抗氧化能力越强.
2 结果与分析
2.1 不同萃取条件组合下山苍子油的得率
根据极差分析法,由表2可知R1、R2、R3 分别为相应水平(即温度、压力和流量)所得的萃取率总和,而
r1、r2、r3则分别代表R1、R2、R3 的平均值,K 为极差.从油得率的角度考察萃取因子设置,温度因子是r2>r3
>r1,50℃最佳,压力因子是r3>r1>r2,30MPa最佳,流量因子是r3>r2>r1,40L/h最佳.因此,达到最
佳萃取率36.7% 的条件是:50℃、30MPa与40L/h.与此同时,萃取压力、温度、CO2 流量三因素的极差分
别为6.5、1.6和4.6,表明以上三因素中,CO2 流量>萃取温度>萃取压力,即CO2 流量对萃取率的影响最
为显著.
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李 芳,等:二氧化碳超临界萃取山苍子油及其抗氧化效能测定
表2 正交实验结果
序号 温度/℃ 压力/MPa  CO2流量/(L/h)
油质量/g
20min  40min
总质量/g 萃取率/%
1  40  20  20  14.99  0.70  15.69  31.4
2  40  25  30  13.77  0.41  14.18  28.4
3  40  30  40  15.71  2.55  18.26  36.5
4  50  20  30  14.15  3.35  17.50  35.0
5  50  25  40  16.58  1.79  18.37  36.7
6  50  30  20  13.86  0.66  14.52  29.0
7  60  20  40  14.61  2.45  17.06  34.1
8  60  25  30  14.97  1.62  16.59  33.2
9  60  30  20  17.15  1.16  18.31  36.6
R1 96.3  100.5  93.6
R2 115.7  97.1  100.0
R3 103.9  102.1  107.3
r1 32.1  33.5  31.2
r2 38.6  32.4  33.3
r3 34.6  34.0  35.8
K  6.5  1.6  4.6
2.2 萃取条件与提取时间对山苍子油提取率与抗氧化活性的影响
DPPH是一种稳定的以氮为中心的自由基,其乙醇溶液呈紫色.当DPPH溶液中加入自由基清除剂
时,其孤电子被配对,导致溶液紫色变浅或褪色,517nm处的吸光度随之显著下降,其下降程度与自由基
清除程度在一定范围内呈线性关系[14].故该法可以用来表征某种物质对自由基的清除率.清除率越大表
明该物质清除自由基的能力越强.而IC50越小,则说明该物质清除自由基的能力越强.
由表3可知不同萃取条件与不同萃取时段的山苍子油得率与抗氧化活性:第1阶段(0~20min)得率可
达27.54%~34.30%,占总出油量的80.86%~97.11%;从山苍子抗氧化效能看,则第2阶段优于第1阶
段;第1阶段油呈棕褐色,比较浑浊,而后阶段得到的山苍子油色泽比较清亮.第3号实验组合(40℃,30
MPa,40L/h)第2提取时段得到的山苍子油抗氧化能力最高,其IC50仅为3.44g/L.
表4为不同提取时段山苍子油得率与抗氧化活性.0~20min得油率占总油量的90.78%,20~40min
油得率仅占总量9.22%,但30min、40min时收集到得山苍子油抗氧化效能明显高于前10min和20min,
此结果与表3结论相互验证.
表3 不同萃取条件与萃取时段对山苍子油的抗氧化活性的影响
实验号 参数组合 时间/min 得率/%
剂量与自由基清除率
回归方程
IC50/
(g/L)
R2
1  40℃
20MPa
20L/h
20  29.98  y=4.646 9x+14.036  7.74  0.971 1
40  1.40  y=5.023 6x+18.107  6.35  0.938 2
2  40℃
25MPa
30L/h
20  27.54  y=3.432 3x+31.353  5.43  0.950 7
40  0.82  y=3.703 3x+31.353  5.03  0.950 7
3  40℃
30MPa
40L/h
20  31.42  y=3.472 9x+28.537  6.18  0.973 8
40  5.10  y=3.831 6x+37.073  3.37  0.941 4
·81·
徐州工程学院学报(自然科学版)                                2012年第2期
续表
实验号 参数组合 时间/min 得率/%
剂量与自由基清除率
回归方程
IC50/
(g/L)
R2
4  50℃
20MPa
30L/h
20  28.30  y=3.609 7x+28.245  6.03  0.940 9
40  6.70  y=4.004 2x+30.534  4.86  0.989 6
5  50℃
25MPa
40L/h
20  33.16  y=4.180 5x+14.017  8.61  0.979 6
40  3.58  y=4.567 9x+27.467  4.93  0.931 3
6  50℃
30MPa
20L/h
20  27.72  y=4.371 4x+11.678  8.77  0.977 3
40  1.32  y=4.154 2x+16.356  8.10  0.972 8
7  60℃
20MPa
40L/h
20  29.22  y=4.201 2x+14.51  8.45  0.974 1
40  4.90  y=3.703 8x+25.088  6.73  0.959 8
8  60℃
25MPa
20L/h
20  29.94  y=4.769 9x+18.238  6.66  0.954 8
40  3.24  y=4.574 5x+27.504  4.92  0.919 3
9  60℃
30MPa
30L/h
20  34.30  y=4.686x+15.826  7.30  0.949 5
40  2.32  y=4.445 3x+21.747  6.36  0.943 5
表4 不同提取时段所得山苍子抗氧化活性(50℃,25MPa,40L/h)
时间/min 得率/% 回归方程 R2  IC50/(g/L)
10  25.56  y=3.806 8x+12.472  0.965 8  9.86
20  7.62  y=4.562 4x+22.611  0.925 0  6.00
30  2.24  y=4.301 1x+29  0.962 5  4.88
40  1.13  y=4.626 8x+27.556  0.969 4  4.85
2.3 夹带剂应用对山苍子油提取率与抗氧化活性的影响
夹带剂对山苍子油得率及其抗氧化效能的影响见表5,显然,在萃取条件(50℃,25MPa,40L/h)不变
的前提下,以甲醇与乙酸乙酯为夹带剂,不仅可以提高山苍子油的得率而且可以显著提升山苍子油的抗氧化
效能;以乙酸乙酯为夹带剂,萃取率最高为45.88%;以甲醇为夹带剂时,山苍子油的抗氧化活性达到最大
值:IC50仅为0.30g/L,而对照组的IC50为7.63g/L,抗氧化活性提高25倍之多.根据相似相溶原理,可以推
断山苍子抗氧化活性组分主要是极性物质.
表5 夹带剂对提取率与抗氧化活性的影响
夹带剂 油质量/g 得率/% 回归方程 R2  IC50/(g/L)
甲醇 20.57  41.14  y=9.561 3x+47.169  0.954 1  0.30
乙酸乙酯 22.94  45.88  y=4.949 3x+45.38  0.937 1  0.93
无 18.41  36.82  y=4.090 7x+18.766  0.954 5  7.63
3 结语
利用CO2 超临界萃取技术可以高效提取山苍子油,较高的萃取温度、流量与压力有利于提高萃取率;通
常萃取时间设置为60~80min,分时段实验表明:40min后油量很少,不便收集,故认为萃取时间可以设置
为40min.
本研究首次探讨了不同提取时段与夹带剂使用对山苍子油提取率及其抗氧化活性的影响.证明应用高
极性的夹带剂如甲醇、乙酸乙酯有助于提高油的得率及其抗氧化效能.从油的物理感官角度看,第2提取阶
段所得油的清透程度明显高于第1阶段,而采用夹带剂后得到的山苍子油色泽也明显清亮,相比之下,色泽
清亮的山苍子油具备较高的抗氧化活性.从油得率的角度看,山苍子油易萃取,20min就可以达到33.18%
·91·
李 芳,等:二氧化碳超临界萃取山苍子油及其抗氧化效能测定
的高提取率,不必使用夹带剂.但从抗氧化效能角度分析,则必须适当延长提取时间并使用高极性的夹带剂.
不过,高极性有机溶剂夹带剂的使用对山苍子油的食用安全性可能会带来不利影响,因此,在CO2 超临界萃
取山苍子油过程中,如何兼顾油提取率、抗氧化活性与食用安全性需进一步深入研究.
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Supercritical Carbon Dioxide Extraction of Oil fromLitsea Cubeba and
the Antioxidant Activity Test of the Oil
LI Fang,WU Jian-bin,XU Hui-you
(Colege of Plant Protection,Fujian Agricultural and Forestry University,Fuzhou 350002,China)
  Abstract:Extraction of volatile oils from the dry fruits of Litsea cubeba with supercritical carbon
dioxide was studied.The influence of temperature,pressure,CO2flow rate and time on the efficiency of
extraction was examined by orthogonal experiment.Meantime,the antioxidant activity of Litsea cubeba oil
was measured by the DPPH test,and it was studied for the first time how the application of co-solvent and
the extraction time can affect the rate of extraction and the oil's antioxidant activity.The results show that
the optimal extracting conditions are determined as pressure 25MPa,temperature 50℃,CO2flow rate 40
L/h,with largest extraction rate of volatile oils as 36.7%.The extraction time can make big difference on
the total yield and antioxidant activity:the first 20min of extraction time can get the 80.86%-97.11%of
total yield,while the oil extracted by next 20min show higher transparency and antioxidant activity than
that from the first 20min.It is proved that adding the co-solvent can improve extract's total yield and
antioxidant activity.The extraction rates can reach 45.88%when acetic ether used as co-solvent.The best
antioxidant activity can be achieved when methyl alcohol is used as co-solvent,with the IC50 measured by
DPPH method as low as 0.30g/L,compared with 7.63g/L of CK.
Key words:Litsea cubeba;supercritical carbon dioxide extraction;antioxidant activity test;co-solvent
(编辑 武 峰)
·02·
徐州工程学院学报(自然科学版)                                2012年第2期