全 文 ：文章编号:1002-8110(2004)01-0081-02
收稿日期:2003-07-16
作者简介:黄淑霞(1977-), 女 ,山东人 ,在读硕士。
机械破壁和盐法结合从啤酒酵母中提取 RNA
黄淑霞 ,史红梅 ,尹卓容
(山东轻工业学院 ,济南 250100)
摘 要:机械破壁法和盐法结合 , 在酵母浓度为 10%, 高压均质破壁循环两次 , 盐浓度 5%, 95℃下加热 3h ,
RNA 平均净得率>3%;将上清液回收利用 ,回用到第三次时 , RNA净得率达 3.67%。
关键词:啤酒酵母;RNA;盐法;高压均质
中图分类号:TS262.5;TS261.11 文献标识码:A
1 材料与方法
1.1 供试材料
啤酒酵母:济南趵突泉啤酒厂提供
主要试剂与仪器:
食盐 ,盐酸 , 氨水 ,乙醇 , 钼酸铵 ,过氯酸 , 三氯乙酸 ,硫酸
TDL-5 离心机 , 751 分光光度计 , 电热恒温干燥箱 , 501
型超级恒温器 ,
1.2 实验方法
1.2.1 原料预处理
啤酒厂酵母泥※冷水稀释※200 目铜丝网过筛※脱苦
※水洗 2～ 3次※板框压滤※冷藏
1.2.2 工艺流程
上清液※等电沉淀 RN
预处理后酵母※均质破壁※加盐保温※冷却※
离心分离※乙醇洗涤※干燥※RNA干品
脱核酸酵母
1.2.3 RNA含量及纯度测试方法:紫外吸收法[ 3]
1.2.3.1 上清液中 RNA 含量的测定:※调 pH7※稀释 500
倍※测OD值
RNA含量(g/100mL)=A260
22
×500×100
1000
在溶液 pH7 , 比色杯厚度 1cm , 1μg/mL RNA 溶液在
260nm 下的 OD值是 0.022。
1.2.3.2 RNA 纯度的测定
精确称取 0.5g 粗核酸粉※研磨※加 10mL水※5%氨水
调 pH7※定容至 50mL取两支 10mL离心管 ,按表 1 操作。
表 1
编号 样品 水 沉淀剂
甲管 2mL 2mL
乙管 2mL 2mL
冰箱冷置 30min※离心分离※取 0.5mL定容至 50mL※测OD值
样品实际浓度= 0.5
50mL
4
2
50
0.5
=50ug/ mL
RNA%=甲OD260±-乙OD260
0.022×50 ×100%
甲液 OD260为总核酸 , 核苷酸的值 , 乙液 OD260为核苷酸
小分子的值 , 两者之差即为核酸大分子的值。
纯 RNA溶液的 A260/A280比值为 2.0 ,样品中若含有蛋白
质 , 则A260/ A280比值要下降。
1.2.4 破壁循环次数
在 40Mpa下高压均质 , 根据循环时间可以计算出循环次
数 ,
1.2.5 加热时间的影响
均质破壁(40MPa, 2 个循环)后 , 加 10%NaCl , 95℃下保
温 ,不同时间取酵母液 , 离心 , 测定上清液中 RNA 含量及纯
度。
1.2.6 上清液的回用
由于等电后的清液中仍含有一定量的 RNA , 所以采用回
收利用上清液的方法 , 可节省用水和盐量的消耗 ,降低对环
境的污染。在酵母浓度为 10%,加热温度为 95℃, 盐浓度为
5%, 加热时间为 3h 的条件下 ,进行上清液回用实验.
2 结果与讨论
2.1 破壁次数对 RNA 溶出率的影响
图 1 破壁次数对结果的影响
高压均质机是利用高压使细胞悬浮液通过针型阀 ,由于
突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂 , 内容物如蛋白 , 核
酸溶解出来 , 形成颗粒小 ,较均一的溶液。
由图 1 可知 ,破壁 2 ～ 4 次测得 RNA 含量大体相等 , 说
明酵母液破壁完全 , 内容物已完全溶出。A260/ A280值在第二
次破壁时接近 2.0 , 破壁次数增加 ,比值稍微增加 , 可能是其
它在 260nm 下有紫外吸收的物质的影响导致纯度降低 ,故选
择破壁次数为两次。
2.2 加热时间对 RNA 溶出率的影响
第 31卷 第 1期
2 0 0 4 年 1 月
酿 酒
LIQUORMAKING
Vol.31 , No.1
Jan., 2004
图 2 加热时间对结果的影响
均质机将细胞破碎后 ,利用盐法的高温 、使杂蛋白变性 ,
盐使核酸与蛋白分离 , 这样可以缩短盐法的破壁时间 , 另外
机械破壁可以连续操作 , 适用于大规模生产。由图 2 可知 ,
加热 3h 后 , 上清液中 RNA 含量几乎不变;3h 时 A260/A280接
近 2 ,时间增加 , 比例下降 , 所以确定加热 3h为最佳条件。
2.3 正交优化法确定最佳工艺条件
综合上述影响因素 , 以时间 、温度 、盐浓度三因素三水
平 , 做正交实验[ 4]
水平 A时间(h)
B
温度(℃)
C
盐浓度(%)
1 1 60 5
2 2 80 7.5
3 3 95 10
由正交实验可知 , RNA 净得率的影响因素由大到小是盐
浓度>时间>温度 , 最优方案是:时间 3h ,温度 950 C , 盐浓度
5%。
2.4 上清液的回用
当上清液回用时 , 可提高 RNA 得率 , 回用次数继续增
加 , RNA纯度将下降。因此 , 一般可循环利用三次。
2.5 几种提取方法的优缺点比较
表 1 RNA提取方法比较
工 艺 结 果 优 缺 点
氨法 酵母浓度 10% 得率>3%, 时间短 ,温度低 ,氨需量少
60℃破壁 50 纯度>80% 对酵母有选择性 ,氨对
min分步调等电 人体有刺激作用
除蛋白
机械破壁法 酵母浓度 10% 得率>3%, 时间短 ,适用于工业化生产
静置离心 纯度<60% 纯度低
盐法 酵母浓度 10% 得率>2%, 时间长 ,温度高 ,适用性强
盐 10%, 90～ 95℃ 纯度>70% 污染严重
抽提 4h
结合法 酵母浓度 10% 得率>3%, 时间较盐法短 ,温度
均质破壁循环两次 纯度>85%, 高 , RNA得率较高 ,
加盐 5%, 90-95℃ 适用性强 ,可应用于工
抽提 3h 业化生产
3 结论
3.1 利用盐法和机械破壁法结合从啤酒酵母细胞中提取
RNA , 加热时间缩短为 3h , 净得率保持在 3%以上。
3.2 等电后的上清液中仍含有一定量的 RNA 和盐 , 回用上
清液 ,既提高了 RNA的净得率 , 又节约了用水和用盐量 ,减少
了环境污染。
3.3 脱核酸酵母里含有一定量的葡聚糖和甘露糖蛋白 , 可
进一步提取利用。
[ 参考文献]
[ 1] 马文峰等.盐法提取啤酒废酵母中 RNA 的生产技术[ J] .酿酒 ,
1999(1):63.
[ 2] 毛 宁 ,等.利用啤酒酵母提取 RNA的氨法工艺研究Ⅱ[ J] .药物
生物技术 , 2000 ,(1):35-37.
[ 3] 魏述众.生物化学[M] .中国轻工业出版社.
[ 4] 陈魁.应用概率统计[M] .清华大学出版社.
Extracting RNA from Spent Brewer s Yeast by the Combination of High Pressure
Homogenization and Saline
ABSTRACT:The combination of saline and high pressure homogenization for extracting RNA from spent brewer s yeast was studied.The op-
timal condition was obtained by orthogonal experiment.The concentration of the yeast was 10%, and salt was 5%, and the cell wall was bro-
ken with high pressure homogenization twice.The broken yeast was heated for 3h at 950C.When the supernatant was recycled at the third
times , the yield of RNA is up to 3.67%.
KEY WORDS:spent brewer s yeast;RNA ;high pressure homogenization ;saline ;extract
·82· 酿 酒 2004