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蓬莪术多糖体外抗氧化活性研究



全 文 :Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2015年第6期
蓬莪术多糖体外抗氧化活性研究
苟学梅1,王 茜1,高 刚1,周永红2,杨瑞武1,*
(1.四川农业大学生命科学学院,四川雅安 625014;
2.四川农业大学小麦研究所,四川温江 611130)
摘 要:以多年生草本药用植物蓬莪术根茎为原材料,热水浸提法提取多糖,测定蓬莪术多糖的总糖含量、糖醛酸含
量和蛋白质含量,并对蓬莪术多糖结构进行红外光谱分析。通过体外抗氧化实验研究蓬莪术多糖对自由基的清除能
力以及总还原能力。结果表明,蓬莪术多糖的总糖质量分数为56.13%,糖醛酸质量分数为8.65%,蛋白质质量分数为
4.53%。体外抗氧化活性研究结果表明对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子有明显清除作用和较强的还原能力,
其清除自由基的IC50值分别为0.29、0.44、0.36mg/mL。
关键词:蓬莪术,多糖,抗氧化
Antioxidant activities of polysaccharides from rhizomes of the herb
Curcuma phaeocaulis in vitro
GOU Xue-mei1,WANG Qian1,GAO Gang1,ZHOU Yong-hong2,YANG Rui-wu1,*
(1.College of life Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;
2.Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Wenjiang 611130,China)
Abstract:Water-soluble polysaccharides were obtained from rhizomes on roots of the herb Curcuma phaeocaulis
Valeton. In addition,the total contents of carbohydrate,uronic acid and protein of C. phaeocaulis polysaccharide
were measured by chemical methods,and the structural characteristic of CPP was detected by FT-IR spectra.
Furthermore,the antioxidant activities of CPP were evaluated on the basis of DPPH,hydroxyl radical,superoxide
anion radicals scavenging ability and reducing power in vitro. The results showed that the contents of
carbohydrate,uronic acid and protein were 56.13% ,8.65% and 4.53% ,respectively. The results showed that
the CPP possessing remarkable free radical scavenging activity and a good reducing power in vitro antioxidant
assay. The IC50 values of scavenging free radicals were 0.29,0.44,0.36mg/mL,respectively.
Key words:Curcuma phaeocaulis Valeton;polysaccharides;antioxidant activity
中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文 章 编 号:1002-0306(2015)06-0122-05
doi:10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.019
收稿日期:2014-07-03
作者简介:苟学梅(1990-),女,硕士研究生,研究方向:植物化学与成分分析。
* 通讯作者:杨瑞武(1969-),男,博士,教授,主要从事植物系统与进化方面的研究。
基金项目:国家自然科学基金(31270243)。
近年来对药用植物的研究发现,其含有丰富的
多糖类物质,是中医和中药应用的重要物质成分。
研究表明,药用植物多糖具有免疫调节[1-2]、抗肿瘤[3]、
抗病毒 [4]、抗辐射 [5]及降血糖 [6]等方面有众多药理功
能,且无毒副作用,有“生物反应调节剂(biological
response modifier,BRM)”[7]之称。因此从药用植物中
提取具有生物活性的多糖类物质,具有重要意义和
较好的研究前景。
蓬莪术(Curcuma phaeocaulis Valeton)是2010年
版《中华人民共和国药典》收载的3种基原莪术中的
一种,是姜科姜黄属的多年生草本植物,为川产道地
药材[8]。中医认为蓬莪术有破淤、行气、消积和止痛的
功效[9];还有抗癌、抗早孕、抗凝血、抗氧化和保肝等
活性[10]。蓬莪术的主要有效部位为根茎,其主要活性
成分是挥发油和多糖。蓬莪术挥发油具有抗肿瘤、抗
炎、抗凝血等作用[11],已广泛应用于临床。目前有关
蓬莪术的研究主要集中在莪术油的药效物质基础和
临床应用开发上。然而关于蓬莪术多糖的物理化学
性质以及清除自由基活性方面的研究尚未见报道。
因此,本实验从蓬莪术根茎中提取多糖,考察其理化
性质和体外抗氧化活性,为蓬莪术资源的综合利用
提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
供试材料 采集于四川双流,由四川农业大学
生命科学学院杨瑞武教授鉴定为蓬莪术(Curcuma
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研究与探讨
2015年第6期
Vol . 36 , No . 06 , 2015
phaeocaulis Valeton),洗净于50℃烘干至恒重,粉碎
过60目筛,干燥保存备用;抗坏血酸(VC) 成都科龙
化工试剂有限公司;1,1 -二苯基 -2 -苦味基肼
(DPPH) 美国Sigma公司;重蒸酚 国药集团化学
试剂有限公司;浓硫酸、无水乙醇、石油醚(60~90℃)、
葡萄糖等所用其他试剂 均为分析纯;本实验用水
均为自制双蒸水。
FW80型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有
限公司;DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海
一恒科技有限公司;HWSY11-K型电热恒温水浴锅
北京市长风仪器仪表有限公司;RB-52AA型真空旋
转蒸发仪 上海亚荣生化有限公司;H-1650型离心
机 长沙湘仪仪器有限公司;DZ-2BC型真空干燥
箱 天津泰斯特仪器有限公司;UV-3200PC型紫外
分光扫描仪 上海美谱达仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 多糖的提取及纯化 准确称取100g的蓬莪术
粉末分别经石油醚和无水乙醇索氏提取5h至无色,
烘干得预处理粉末。准确称取50g预处理粉末,在预
实验的基础上按料液比1∶30加入水,在90℃提取4h,
重复提取两次合并滤液,旋转蒸发浓缩至400mL后
加入95%乙醇至乙醇最终浓度为80%(v/v),于4℃下
醇沉24h,离心,沉淀即为蓬莪术粗多糖。将粗多糖溶
于50mL双蒸水中,采用Sevage法(氯仿∶正丁醇=4∶1,
v/v)[12]除去糖液中的蛋白,重复多次,然后流水透析
24h,蒸馏水透析48h,浓缩透析袋内糖液,冷冻干燥,
得蓬莪术多糖(CPP)。
1.2.2 化学组成
1.2.2.1 CPP总糖含量的测定 CPP的糖含量采用苯
酚硫酸法[13]测定,以干燥葡萄糖为标准品。
标准曲线的建立:准确配制0.40mg/mL葡萄糖标
准溶液以及6%的苯酚溶液。分别精密吸取葡萄糖标
准溶液1.0~10.0mL至10.0mL容量瓶中加水定容。精
密移取各梯度浓度溶液2.0mL于20mL具塞试管中,
依次加入1mL 6%的苯酚溶液和5mL浓硫酸,振荡混
匀,沸水浴30min。冷却至室温后在490nm处测定吸
光值。以吸光值为纵坐标,对应的葡萄糖浓度(mg/mL)
为横坐标制作标准曲线。以超纯水替代标准品溶液
作为空白对照,每组实验平行3次。标准曲线方程为:
y=0.0129x-0.0073,R2=0.9998。
样品的测定:配制样品溶液,按照制作标准曲线
的操作进行样品的测定,每组实验平行3次,求取平
均值,通过样品溶液的吸收值,根据标准曲线回归方
程求出样品中葡萄糖的含量,按照下式计算各样品
中总糖含量:
样品中总糖含量(%)= cdv
m×1000
×100 式(1)
式中,c为样品测定液中葡萄糖的质量浓度
(mg/mL);d为测定液的稀释倍数;v为测定液的总体
积(mL);m为称取的样品质量(g)。
1.2.2.2 糖醛酸含量测定 糖醛酸含量采用硫酸咔
唑法[14]测定,以半乳糖醛酸作为标准品。
标准曲线的建立:准确配制浓度为1.0mg/mL的
半乳糖醛酸标准溶液。分别吸取0.02~0.1mL的半乳
糖醛酸标准溶液置于试管中,补水至1mL。然后缓慢
加入6mL硫酸-硼砂溶液,混合均匀后沸水浴5min。
冷水浴冷却至室温后分别加入0.2mL 0.1%的咔唑无
水乙醇溶液,沸水浴10min后取出,冷却至室温后在
530nm波长下测定吸光值,以吸光值为纵坐标,对应
的半乳糖醛酸浓度(mg/mL)为横坐标制作标准曲线。
以超纯水替代标准品溶液作为空白对照,每组实验
平行3次。标准曲线方程为:y=9.6514x+0.0011,R2=
0.9987。
样品的测定:配制样品溶液,按照制作标准曲线
的操作进行样品的测定,每组实验平行3次,求取平
均值,通过样品溶液的吸收值,根据标准曲线回归方
程求出样品中糖醛酸的含量,按照下式计算样品中
糖醛酸的含量:
样品中糖醛酸含量(%)= cdv
m×1000
×100 式(2)
式中,c为供试液中糖醛酸质量浓度(mg/mL);d
为测定液的稀释倍数;v为测定液的总体积(mL);m
为供试样品的质量(mg)。
1.2.2.3 蛋白质含量测定 蛋白质含量采用王文平
的方法[15]测定,以牛血清白蛋白为标准品。
标准曲线的建立:准确配制浓度为100μg/mL牛
血清白蛋白标准液,分别精密移取0.2~1.0mL牛血清
白蛋白标准溶液于10mL具塞试管中,各管补水至
1mL,然后分别加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂,常温
下静置15min,待颜色稳定后,在595nm处测定吸光
值。以吸光值为纵坐标,对应的可溶性蛋白质含量
(μg)为横坐标制作标准曲线。以超纯水替代标准品
溶液作为空白对照,每组实验平行3次。标准曲线方
程为:y=0.0045x-0.0058,R2=0.9983。
样品的测定:配制样品溶液,按照制作标准曲线
的操作进行样品的测定,每组实验平行3次,求取平
均值,通过样品溶液的吸收值,根据标准曲线回归方
程求出样品中可溶性蛋白质的含量,按照下式计算
样品中可溶性蛋白质的含量:
样品中可溶性蛋白质含量(%)= md
M×1000
×100
式(3)
式中,m为供试液中可溶性蛋白质含量(μg);d
为测定液的稀释倍数;M为供试样品的质量(mg)。
1.2.3 红外光谱分析 准确称取CPP 1~2mg,与干燥
KBr碾碎混匀,压成1.0mm薄片,采用傅里叶转换红
外光谱(FT-IR)进行红外光谱检测,波长扫描范围
4000~500cm-1。
1.2.4 抗氧化活性测定
1.2.4.1 DPPH自由基清除活性的测定 参照参考文
献[16]中的方法:取2mL不同质量浓度的CPP和VC样
品溶液与2mL 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液混匀,静置
30min,517nm处测定吸光度。DPPH自由基清除能力
通过以下公式计算:
DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100
式(4)
式中,Ai为DPPH与样液反应后的吸光度,Aj为样
品空白的吸光度,Ac为未加样的DPPH吸光度,每一
123
Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2015年第6期
样品平行测三次,取其平均值。
1.2.4.2 羟基自由基清除活性的测定 采用参考文
献 [17]中的方法,取2mmol/L FeSO4溶液3mL,加入
1mmol/L H2O2溶液3mL,再加入6mmol/L水杨酸溶液
3mL,立即摇匀,37℃水浴下加热15min后取出,然后
加入1.0mL不同质量浓度的样品液,继续水浴加热
15min,冷却至室温在520nm下测定吸光度,VC作为对
照。羟基自由基清除能力通过以下公式计算:
羟基自由基清除率(%)=(Ai-Aj)/(Ac-Aj)×100
式(5)
式中,Ai为·OH与样液反应后的吸光度,Aj为样
品空白的吸光度,Ac为未加H2O2的吸光度,每一样品
平行测三次,取其平均值。
1.2.4.3 超氧阴离子自由基清除活性的测定 参考
文献[18]中的方法:用0.05mol/L、pH=7.4的PBS缓冲液
为溶剂配制3.3×10-6mol/L核黄素,0.01mol/L蛋氨酸,
4.6×10-5mol/L氯化硝基四氮唑兰(NBT),分别取上述
溶液各2.0mL,加入各浓度CPP和VC溶液1.0mL,混匀
光照30min后,在560nm下测定吸光度。超氧阴离子自
由基清除能力通过以下公式计算:
超氧阴离子自由基清除率(%)=(1-Ai/Aj)×100
式(6)
式中,Ai为样液反应后的吸光度,Aj为样品空白
的吸光度,每一样品平行测三次,取其平均值。
1.2.4.4 还原力的测定 采用铁氰化钾法参照参考
文献[19]。以VC为对照,将CPP和VC配制成不同质量浓
度的样品溶液,分别取样品溶液2.5mL加入到2.5mL
PBS(0.2mol/L,pH6.6)中,再加入1.0mL铁氰化钾(1%,
w/v),混匀后50℃水浴20min。冷却至室温加入2.5mL
三氯乙酸(10%,w/v),3000r/min离心10min。分别取
2.0mL上清液加入2.0mL超纯水,再加入0.5mL三氯化
铁(0.1%,w/v),室温放置10min后,700nm处测定光吸
收值。吸光值越高表明样品的还原力越强。
2 结果与分析
2.1 CPP的化学组成
苯酚硫酸法测得CPP总糖质量分数为56.13%,
硫酸咔唑法测得其中糖醛酸质量分数为8.65%,王文
平法测得其蛋白质的质量分数为4.53%。说明蓬莪术
多糖是含有少量蛋白的酸性糖。
2.2 CPP的红外光谱
红外光谱是研究多糖官能团的有效手段,如图1
所示,红外光谱检测结果表明:CPP在3380~3400cm-1
处有O-H伸缩振动的吸收峰,2929~2933cm-1处有C-H
伸缩振动的吸收峰,这两组峰是糖类的特征吸收峰。
1616cm-1附近的吸收峰为C=O非对称伸缩振动峰,
1417cm-1附近的吸收峰为C=O对称伸缩振动峰。
1100~1000cm-1处的吸收峰是由C-O-C伸缩振动产生,
在890cm-1左右出现吸收峰β-糖苷键的特征吸收峰。
2.3 CPP的抗氧化活性
2.3.1 CPP对DPPH自由基的清除作用 DPPH自由
基是一种比较稳定的自由基,广泛应用于测定纯抗
氧化剂或植物提取物的体外抗氧化活性。由图2可以
看出,在低浓度范围内,CPP对DPPH自由基的清除率
与质量浓度呈现较好的量效关系,但随着CPP质量浓
度的增加,清除率趋于平缓,质量浓度大于0.75mg/mL
后,CPP的清除率基本稳定在82.33%,清除DPPH自由
基50%时的CPP质量浓度即IC50为0.29mg/mL。较低的
IC50值表示CPP较高的DPPH自由基清除能力。
2.3.2 CPP对·OH的清除作用 羟基自由基是已知
的最活泼的活性氧自由基,也是毒性最大的氧自由
基,清除羟基自由基的能力是评价抗氧化物质的重
要指标。由图3可知CPP有很强的清除羟基自由基的
作用,随着质量浓度的增加,CPP的清除能力依次增
加。在低浓度范围内,CPP对·OH的清除率与质量
浓度呈现较好的量效关系。在相同质量浓度下,小于
0.5mg/mL时,CPP清除·OH的能力大于VC,但大于
0.5mg/mL后,对照品VC的清除能力迅速上升,在
1.0mg/mL后,VC对羟基自由基的清除率接近100%,而
CPP对清除羟基自由基有明显的浓度效应关系,当质
图1 CPP的红外光谱图
Fig.1 Infrared spectra of CPP
波长(cm-1)
4000 3000 2000 1000
3396
2929
1616
1417
1078
1047
891
图3 CPP和VC对羟基自由基的清除能力
Fig.3 Hydroxyl radical scavenging abilities of CPP and VC
浓度(mg/mL)
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25
100
80
60
40
20
0




%)
CPP
VC
图2 CPP和VC对DPPH自由基的清除能力
Fig.2 DPPH radical scavenging abilities of CPP and VC
浓度(mg/mL)
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25
100
80
60
40
20
0




%)
CPP
VC
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Vol . 36 , No . 06 , 2015
量浓度达到1.0mg/mL时,CPP对·OH的清除率达到最
大值86.13%,其IC50值为0.44mg/mL。
2.3.3 CPP对·O2-的清除作用 ·O2-即是阴离子,又
是自由基,性质活泼,具有很强的氧化性和还原性,
既是氧化剂,又是还原剂,过量生成可致组织损伤。
图4表明,CPP对超氧阴离子有一定的清除作用,在低
浓度范围内,CPP对超氧阴离子清除作用一直随浓度
增加而增大。在1.0mg/mL时达到最大(83.33%),而后
清除率不变,IC50值为0.36mg/mL,表明CPP具有较强
的·O2-清除活性。
2.3.4 CPP的总还原能力 抗氧化物质的抗氧化活
性与其还原力存在着直接的联系,还原力越强,抗氧
化性越强。由图5可知,在小于1.0mg/mL的质量浓度
内,CPP的还原力随着浓度的增加而增加;当浓度为
1.0mg/mL时,吸光度为0.95;当浓度为1.25mg/mL时,
吸光度为1.01。对于分光光度法而言,当吸光度高于
1.0时,测量结果的相对误差较大,故不再进一步增
加CPP质量浓度。在已测量的质量浓度内,CPP的还
原力不及VC,但与浓度呈正相关。
3 结论
已有许多研究表明从药用植物中提取的多糖具
有很好的抗氧化活性。从杜仲中提取的多糖具有很
强的DPPH自由基的清除能力和较强的还原能力,在
相同浓度下清除能力高于维生素C[20]。从鱼腥草中提
取的多糖具有较好的DPPH自由基,羟基自由基和超
氧阴离子自由基的清除活性[21]。通过本文实验结果
可以发现,从药用植物蓬莪术中提取的多糖是含有
少量蛋白的酸性糖,具有糖类典型的红外吸收峰,含
有β糖苷键。体外抗氧化实验表明,CPP对DPPH自由
基、·OH和·O2-都具有一定清除能力以及较强的还原
能力,随着质量浓度的提高,清除效果越明显,清除
DPPH、·OH、·O2-自由基的 IC50值分别为0.29、0.44、
0.36mg/mL。蓬莪术多糖具有明显的抗氧化能力,可
以开发成为高效、低毒的天然抗氧化剂应用于食品
及保健领域,而有关蓬莪术多糖的结构鉴定及抗氧
化活性机理有待进一步研究。
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图4 CPP和VC对超氧阴离子自由基的清除能力
Fig.4 Superoxide anion radical scavenging abilities of CPP
and VC
浓度(mg/mL)
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25
100
80
60
40
20
0




%)
CPP
VC
图5 CPP和VC的还原力
Fig.5 Reducing power of CPP and VC
浓度(mg/mL)
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0.0
A 7
00
nm
CPP
VC
(下转第130页)
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图6 玉米粉粒度对馒头感官评分的影响
Fig.6 Effect of corn particle size on steamed bread
sensory quality
40 60 80 100
100
90
80
70
60




玉米粉粒度(目)
b
c
a
b
明显。玉米粉粒度越小,玉米颗粒可与面团中的淀粉-
蛋白质基质结合,使结构更紧密造成馒头坚实度增大,
而且玉米粉中不含面筋蛋白,对面团的面筋网络结
构产生了一定的稀释作用,面筋网络结构无法很好
地扩展,面团持气性差,馒头心内部过于致密,气室
不均匀甚至无气孔,而使其硬度增大,比容减小[17]。
由图6可知,随着玉米粉粒度的减小,混合粉馒
头的感官评分先增大后减小,80目的感官评分最高。
添加40、60目玉米粉的馒头内部气孔结构较好,但口
感粗糙,小麦粉的白色和玉米粉的黄色分布不均匀,
添加100目玉米粉的馒头口感相对细腻,色泽均匀,
但硬度大,内部气孔小。而且100目的混合粉馒头已
识别不出玉米粉颗粒,易使消费者怀疑是否添加玉
米粉。添加80目玉米粉的馒头不仅色泽、外观上有玉
米粉的特征,而且口感也较好。
3 结论
利用标准筛制备出不同粒度梯度的玉米粉,除
了色泽变化显著(p<0.05),其水分、粗蛋白含量相差
不大。粒度越小,玉米粉持水力越大,越易糊化,糊化
温度由40目的95.15℃下降到100目的80.75℃,这说明
可以通过调节玉米粉的粒度来控制糊化过程。随着
玉米粉粒度的减小,混合粉的吸水率缓慢增大,面团
形成时间、面团稳定时间逐渐减小,弱化度增大。添
加粒度较小玉米粉的馒头色泽均匀度,表皮光滑度,
口感细腻度要优于添加较大粒度的,但其硬度较大,
比容较小,40目的比容为2.46g/mL,而100目的比容下
降到2.15g/mL。综合考虑得出,适于制作馒头的玉米
粉粒度为80目。
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