全 文 ：220 2013, Vol.34, No.01 食品科学 ※生物工程
酶解山核桃蛋白制备降血压肽的工艺
包怡红，于阳阳，赵若诗
(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要：采用碱性蛋白酶对山核桃蛋白进行水解，以水解度和水解物的ACE抑制率为考察指标，考察酶解pH值、
酶解温度、酶解时间、加酶量4个因素的影响，并在此基础上通过响应面组合优化试验，确定得到ACE抑制率最佳
的条件为酶解pH8.2、酶解温度56℃、酶解时间4h、加酶量5880U/g(以底物计)，此时水解度为29.03%，水解物的
ACE抑制率可达到72.48%。
关键词：山核桃蛋白；降血压肽；水解度；ACE抑制率；响应面
Enzymatic Preparation of Antihypertensive Peptides from Juglans mandshurica Maxim Protein
BAO Yi-hong，YU Yang-yang，ZHAO Ruo-shi
(College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)
Abstract：In this study, Juglans mandshurica Maxim protein, prepared in our laboratory using alkaline extraction and
acid precipitation, was hydrolyzed with alcalase to prepare antihypertensive peptides. Operating parameters such as pH,
temperature, hydrolysis time and enzyme dosage were optimized using response surface analysis based on degree of
hydrolysis and ACE inhibitory rate. The optimum hydrolysis conditions for maximum ACE inhibitory rate (72.48%) were
found to be hydrolysis at 56 ℃ and pH 8.2 for 4 h with an enzyme/substrate ratio of 5880 U/g. Under these conditions, the
degree of hydrolysis was 29.03%.
Key words：Juglans mandshurica Maxim protein；antihypertensive peptide；degree of hydrolysis；ACE inhibitory
activity；response surface methodology
中图分类号：TS201.1；TS218 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)01-0220-05
收稿日期：2011-11-06
基金项目：东北林业大学中央高校基金项目(DL09CA14)
作者简介：包怡红(1970—)，女，教授，博士，研究方向为天然产物生物转化、功能性食品。E-mail：baoyihong@163.com
高血压是最常见的慢性心血管疾病之一，可造成
大脑、心血管、肾脏的损害，是导致脑卒中、心力衰
竭和冠心病等疾病的重要因素。高血压的主要治疗方
法之一是通过降低人体内血管紧张素转换酶(angiotensin
converting enzyme，ACE)的活性，从而可防止由于ACE
活性高导致的心肌收缩加强、血管平滑肌收缩、血压升
高 [1-2]。虽然市场上治疗高血压的药物已经较为多样成
熟，但是由于这些药物在代谢过程中可能会产生毒副作
用，所以，近年来国内外科学家从天然食物中研制出降
压肽——利用酶制剂在温和条件下水解蛋白质，而获得
的一类可以降低高血压人群体内ACE活性的多肽。研究
人员已经利用酶法、微生物发酵法、基因工程法等方法
从牛乳蛋白、大豆、谷物、玉米、胶原蛋白、大蒜、酒
糟、米糠、油菜籽、藻类、鱼贝类、海蜇等食物源中研
制出了降血压肽[3-8]。
目前未见对水解山核桃蛋白制备降血压肽的报道，
本实验利用碱性蛋白酶水解实验室自制山核桃蛋白，通
过单因素和响应面试验组合确定制备山核桃降血压肽的
最佳酶解条件，为山核桃降血压肽的理论研究和进一步
的产品开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
山核桃蛋白为采用碱提酸沉法自制。
甘氨酸、茚三酮、果糖、N a 2H P O 4·1 0 H 2O、
KH2PO、乙醇、NaCl、硼砂、硼酸、NaOH均为国产分析
纯；血管紧张素转化酶(0.25UN)、马尿酰-组氨酰-亮氨酸
(N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL) 美国Sigma公司；
碱性蛋白酶Alcalase(食品级) 丹麦诺维信公司。
1.2 仪器与设备
电热恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司医疗设备
厂；TU-1800PC紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪
器有限责任公司；PB-10标准型酸度计 上海精密仪器
※生物工程 食品科学 2013, Vol.34, No.01 221
仪表有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器 常州国华电气有
限公司；旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 山核桃蛋白的酶解
将自制山核桃蛋白冻干样品配制为2%的蛋白溶液，
分别在加酶量(以底物计)3000、4000、5000、6000、
7000U/g，酶解温度为30、40、50、60、70℃，酶解时间
为1、2、3、4、5、6h，酶解pH值为7、8、9、10、11、12
的不同条件下进行酶解[9-11]。酶解过程中用磁力搅拌器进
行搅拌，同时滴加0.1mol/L NaOH维持相应pH值条件。酶
解后以100℃沸水浴灭酶15min。将酶解液离心4000r/min，
10min，取上清液进行水解度和ACE抑制率测定。
1.3.2 山核桃蛋白酶解制备降血压肽的响应面组合试验
在酶解单因素试验的基础上，以酶解pH值、酶解温
度、酶解时间、加酶量为影响因素，以ACE抑制率作为
考察指标，进行优化试验，采用Box-Behnken和SAS9.0
进行试验设计和结果分析，得出制备降血压肽的最佳工
艺。试验设计见表1。
表 1 响应面试验因素和水平表
Table 1 Coded values and corresponding actual values of the
optimization parameters used in response surface analysis
因素 编码水平―1 0 1
A酶解pH 7 8 9
B酶解温度/℃ 50 55 60
C酶解时间/h 3.5 4.0 4.5
D加酶量/(U/g) 4000 5000 6000
1.3.3 水解度的测定
采用茚三酮方法[12-13]测定山核桃蛋白水解度。取水解
蛋白液0.50mL定容至50mL，取0.40mL稀释液于试管中并
加入1.60mL蒸馏水、1.00mL显色剂，混匀后置沸水浴中
加热15min，同时作空白实验。以后操作同标准曲线。利
用标准曲线计算水解蛋白液中—NH2的含量(μmol/mL)。
∈㾷ᑺ/% = h
AhA0
AᘏA0
(1)
式中：A h为不同时间水解液中的总游离—NH 2含
量/(μmol/mL)；A0为原料蛋白中固有的游离—NH2含量/
(μmol/mL)；A总为原料蛋白强酸水解后的总游离—NH2含
量/(μmol/mL)。
1.3.4 原料蛋白完全水解液的制备
准确称取0.10g原料山核桃蛋白粉于水解管中，加
入6mol/L的盐酸20mL，于100℃回流反应24h，水解反
应后，旋转蒸发除去盐酸，干涸后用蒸馏水溶解，并定
容至100mL。同样采用茚三酮方法测定完全水解中总游
离—NH2 数。
1.3.5 水解液ACE抑制率的测定
在Cushman[14]、Chiang[15]等所用的方法的基础上从
对ACE抑制率测定方法进行改进。方法如下：将HHL溶
解在0.1mol/L、pH8.3的硼酸缓冲液(含有0.3mol/L NaCl)
中配成0.005mol/L的HHL溶液，取100μL该溶液于5mL
的离心管中，反应管中加入40μL酶解物，在37℃恒温水
浴 3～5min，再加入10μL ACE酶液启动反应，恒温反应
60min。对照管中先入40μL硼酸缓冲液代替酶解物，反应
结束后均加入 150μL 1mol/L盐酸终止反应。然后在反应
管中加入40μL硼酸缓冲液，对照管中加入40μL酶解物。
空白组为在反应前先加入150μL 1mol/L HCl以终止反应
外，其余操作与反应管完全相同。最后加入1.0mL乙酸乙
酯，振荡混合，4000r/min离心10min后，取出750μL酯层
移入试管中，在100℃的烘箱中烘干(约30min)，再加入
3mL的去离子水溶解的马尿酸，漩涡混合30s，在228nm
波长处测定吸光度(A)。
h100AbAc
AbAaACEᡥࠊ⥛/% =
式中：Ab是ACE与HHL完全反应后生成物吸光度；
Aa是ACE与抑制剂(酶解物)反应被抑制，又与HHL同时反
应后生成物吸光度；Ac是ACE失活后，再加抑制剂，是
ACE与HHL反应的空白吸光度。
2 结果与分析
2.1 酶解单因素试验
2.1.1 酶解pH值对水解度和ACE抑制率的影响
0
10
20
30
40
50
60
70
7 8 9 10 11 12 13
pH
∈㾷ᑺ
ACEᡥࠊ⥛
A
C
Eᡥ
ࠊ
⥛
/%
∈
㾷
ᑺ
/%
图 1 pH值对水解度和ACE抑制率的影响
Fig.1 Effect of pH on degree of hydrolysis and ACE inhibitory rate
在酶解时间3h、加酶量5000U/g、酶解温度50℃的条
件下，考察酶解pH值对水解度和ACE抑制率的影响。结
果如图1所示。当酶解pH值增加至8时，山核桃蛋白溶液
的水解度为25.78%，酶解物的ACE抑制率为61.14%，均
达到最大值，随着pH值的增加，水解度和ACE抑制率均
减小，说明较高pH值环境可能导致碱性蛋白酶的失活，
不适于水解。pH值的变化导致的水解度和ACE抑制率的
变化较为明显。
2.1.2 酶解温度对水解度和ACE抑制率的影响
在酶解pH8、酶解时间3h、加酶量5000U/g的条件
222 2013, Vol.34, No.01 食品科学 ※生物工程
下，考察酶解温度对水解度和ACE抑制率的影响，结果
如图2所示。当酶解温度由30℃逐渐增加时，山核桃蛋
白溶液的水解度和酶解物的ACE抑制率也随之增加，温
度40～60℃时，水解度变化不很明显，在50℃时水解度
最大为25.38%；而对于酶解物ACE抑制率来说，温度在
40～60℃范围变化时，ACE抑制率变化明显，当温度为
50℃时，酶解物ACE抑制率达到最大为59.88%。综合考
虑水解度和酶解物ACE抑制率2个因素，50℃酶解效果
较好。
0
10
20
30
40
50
60
70
30 40 50 60 70 80
䝊㾷⏽ᑺ/ć
∈㾷ᑺ
ACEᡥࠊ⥛
∈
㾷
ᑺ
/%
A
C
Eᡥ
ࠊ
⥛
/%
图 2 酶解温度对水解度和ACE抑制率的影响
Fig.2 Effect of temperature on degree of hydrolysis and ACE
inhibitory rate
2.1.3 酶解时间对水解度和ACE抑制率的影响
0
10
20
30
40
50
60
70
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5
䝊㾷ᯊ䯈/h
∈㾷ᑺ
ACEᡥࠊ⥛
∈
㾷
ᑺ
/%
A
C
Eᡥ
ࠊ
⥛
/%
图 3 酶解时间对水解度和ACE抑制率的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis and ACE
inhibitory rate
在酶解pH8、酶解温度50℃、加酶量5000U/g的条件
下，考察酶解时间对水解度和ACE抑制率的影响。结果
如图3所示。酶解时间从1h逐渐增加时，山核桃蛋白溶液
的水解度和酶解物的ACE抑制率也随之增加。当时间增
加至4h后，水解度增加不明显，在4.5h水解度达到最大为
27.61%；而酶解4h时，酶解物的ACE抑制率可达62.38%，
随着酶解时间的延长，ACE抑制率有降低趋势。
2.1.4 加酶量对水解度和ACE抑制率的影响
在酶解pH8、酶解温度50℃、酶解时间4h条件下，考
察加酶量对水解度和ACE抑制率的影响。结果如图4所示。
当加酶量逐渐增加时，山核桃蛋白溶液的水解度和酶解
物的ACE抑制率均随之增加，当增加至5000U/g时，水解
度的增加不再明显，此时为26.25%，酶解物的ACE抑制
率也达到最大为60.34%。
0
10
20
30
40
50
60
70
1000 3000 5000 7000 9000
ࡴ䝊䞣/(U/g)
∈㾷ᑺ
ACEᡥࠊ⥛
∈
㾷
ᑺ
/%
A
C
Eᡥ
ࠊ
⥛
/%
图 4 加酶量对水解度和ACE抑制率的影响
Fig.4 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis and ACE
inhibitory rate
2.2 山核桃蛋白酶解制备降血压肽工艺的优化
2.2.1 模型建立与方差分析
根据单因素的试验结果，采用四因素三水平对蛋白
质水解度和酶解物的ACE抑制率进行响应面优化，按照
表1进行试验。结果见表2。
表 2 响应面试验设计方案及分析结果
Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
试验号 A B C D 水解度/% ACE抑制率/%
1 －1 －1 0 0 16.3684 43.12
2 1 －1 0 0 22.0182 63.83
3 －1 0 －1 0 17.0082 47.67
4 1 0 －1 0 23.1398 66.42
5 － 0 0 －1 18.2035 50.89
6 1 0 0 －1 24.1856 70.02
7 －1 0 0 1 20.0216 58.42
8 1 0 0 1 26.9305 70.47
9 －1 0 1 0 19.0003 54.25
10 1 0 1 0 25.6769 71.03
11 －1 1 0 0 20.3831 56.26
12 1 1 0 0 28.9930 67.98
13 0 －1 －1 0 19.6670 53.77
14 0 －1 0 －1 20.0055 58.86
15 0 －1 0 1 23.0442 65.97
16 0 －1 1 0 21.0620 61.83
17 0 0 －1 －1 21.5474 59.13
18 0 0 －1 1 25.0663 69.87
19 0 0 0 0 29.0748 70.57
20 0 0 0 0 27.9090 71.31
21 0 0 0 0 28.5844 71.53
22 0 0 0 0 28.9835 72.58
23 0 0 0 0 28.0296 72.91
24 0 0 1 －1 24.0210 70.73
25 0 0 1 1 29.0567 68.61
26 0 1 －1 0 22.0862 64.11
27 0 1 0 －1 23.9224 67.28
28 0 1 0 1 26.4860 72.03
29 0 1 1 0 29.0068 67.67
※生物工程 食品科学 2013, Vol.34, No.01 223
表 3 回归分析结果
Table 3 Results of regression analysis
变异
来源
自由
度
平方和 方差 F Prob＞F
水解度 ACE抑制率 水解度 ACE抑制率 水解度 ACE抑制率 水解度 ACE抑制率
一次项 4 250.7522 1032.0393 0.5702 0.5543 81.70 86.46 ＜0.0001** ＜0.0001**
二次项 4 168.7792 650.71731 0.3828 0.3495 54.99 43.16 ＜0.0001** ＜0.0001**
交叉项 6 9.5142 126.4552 0.0216 0.0679 2.07 5.59 0.1234 0.0038**
总和 14 429.0455 1809.2117 0.9756 0.9717 39.94 34.29 ＜0.0001** ＜0.0001**
注：**.极显著差异 (P＜ 0.01)；*.显著差异 (P＜ 0.05)。下同。
表 4 ACE抑制率的试验结果方差分析表
Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model for ACE
inhibitory rate
变异来源 平方和 自由度 均方 F Prob＞F 显著性
模型 1809.21 14 129.23 34.29 ＜0.0001 **
A 705.33 1 705.33 187.15 ＜0.0001 **
B 203.78 1 203.78 54.07 ＜0.0001 **
C 75.25 1 75.25 19.97 0.0005 **
D 47.68 1 47.68 12.65 0.0032 **
AB 18.02 1 18.02 4.78 0.0462 *
AC 0.97 1 0.97 0.26 0.6198
AD 47.06 1 47.06 12.49 0.0033 **
BC 3.06 1 3.06 0.81 0.3826
BD 1.39 1 1.39 0.37 0.5530
CD 55.95 1 55.95 14.85 0.0018 **
A2 524.82 1 524.82 139.25 ＜0.0001 **
B2 195.95 1 195.95 51.99 ＜0.0001 **
C2 85.18 1 85.18 22.60 0.0003 **
D2 5.61 1 5.61 1.49 0.2426
残差 52.76 14 3.77
失拟 49.10 10 4.91 5.36 0.0600
纯误差 3.66 4 0.92
总和 1861.98 28
根据以上结果进行回归分析见表3，由表分析可知
试验选用的模型对于水解度和ACE抑制率具有高度的显
著性(P＜0.0001)。从表4可知，在以ACE抑制率为响应值
的模型中，A、B、C、D、AB、AD、CD、A2、B2、C2这
些因素对ACE抑制率的影响显著，即酶解pH值、酶解温
度、酶解时间、加酶量、酶解pH值和酶解温度的交互作
用、pH值和加酶量的交互作用、酶解时间和加酶量的交
互作用这些都对水解物的ACE抑制率有显著的影响。
2.2.2 响应面分析与优化
利用SAS9.0软件进行处理分析得到回归方程如下：
以水解度为响应值，得方程为：
Y=－695.792282 + 65.816293A +10.781166B +
45.63432C +0.014908D－4.388031A2 +0.098005AB－
0.119953B2 + 0.2725AC+0.55256BC－9.847373C2 + 0.000232AD－
0.000023755BD+0.000758CD－0.000001693D2(R2=0.9756)
由方程预测得到最佳水解度的条件为pH8.422、酶解
温度57.653℃、酶解时间4.264h、加酶量5530.169U/g，此
条件得到的最佳水解度为30.652%。以ACE抑制率为响应
值，得方程为：
Y=－2175.32875+196.024167A + 30.393667B +
185.498333C + 0.0751433D－8.995A2 － 0.4245AB－
0.21985B2 －0.985AC－0.355BC－14.495C2－0.00343AD－
0.000118BD－0.00748CD－0.00000093D2(R2=0.9717)
由方程分析预测得到最佳A C E抑制率的条件为
pH8.227、酶解温度56.482℃、酶解时间3.919h、加
酶量5882.808U/g，此条件得到的最佳ACE抑制率为
73.939%。根据分析结果和实际条件确定得到ACE抑制
率最佳的条件为pH8.2、酶解温度56℃、酶解时间4h、加
酶量5880U/g，经验证得到该条件水解物的ACE抑制率为
72.48%，与预测值接近，此时水解度为29.03%。
通过上述ACE抑制率模型的二次多项回归方程所作
的响应曲面图及其等高线图见图5～7，分别是pH值与
酶解温度(AB)、pH值与加酶量(AD)、酶解温度与加酶
量(BD)交互作用对水解物ACE抑制率的影响。响应曲面
坡度相对陡峭，表明响应值对于处理条件的改变非常敏
感。等高线的形状反映出交互作用的强弱大小，圆形表
示两因素交互作用不显著，而椭圆形则与之相反[16]。根
据图可知这几个因素的交互作用对水解物ACE抑制率的
影响是显著的，与表4结果一致。
74.00
66.25
58.50
50.75
43.00
1.00
0.50
0.00
ˉ0.50
ˉ1.00ˉ1.00
ˉ0.50
0.00
0.50
1.00
A
C
Eᡥ
ࠊ
⥛
/%
B 䝊㾷⏽ᑺ A 䝊
㾷p
H
ˉ1.00
ˉ1.00
ˉ0.50
0.00
0.50
1.00
ˉ0.50 0.00 0.50 1.00
A 䝊㾷pH
B
䝊
㾷
⏽
ᑺ
ACEᡥࠊ⥛/%
5
58.6366
63.7225
63.8084
53.5506
48.4647
图 5 酶解pH值与酶解温度交互影响水解物ACE抑制率的
响应曲面图和等高线图
Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of hydrolysis
pH and temperature on ACE inhibitory rate
74.00
67.50
61.00
54.50
48.00
1.00
0.50
0.00
ˉ0.50
ˉ1.00ˉ1.00
ˉ0.50
0.00
0.50
1.00
A
C
Eᡥ
ࠊ
⥛
/%
D ࡴ䝊䞣 A 酶
解p
H
224 2013, Vol.34, No.01 食品科学 ※生物工程
ˉ1.00
ˉ1.00
ˉ0.50
0.00
0.50
1.00
ˉ0.50 0.00 0.50 1.00
A 䝊㾷pH
D
ࡴ
䝊
䞣
ACEᡥࠊ⥛/%
561.147465.2749 69.4024
57.02
52.8925
图 6 酶解pH值与加酶量交互影响水解物ACE抑制率的
响应曲面图和等高线图
Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of
hydrolysis pH and enzyme dosage on ACE inhibitory rate
73.00
69.25
65.50
61.75
58.00
1.00
0.50
0.00
ˉ0.50
ˉ1.00ˉ1.00
ˉ0.50
0.00
0.50
1.00
A
C
Eᡥ
ࠊ
⥛
/%
D ࡴ䝊䞣
B 䝊
㾷⏽
ᑺ
ˉ1.00
ˉ1.00
ˉ0.50
0.00
0.50
1.00
0.50 0.00 0.50 1.00
B 䝊㾷⏽ᑺ
D
ࡴ
䝊
䞣
ACEᡥࠊ⥛/%
570.6208
63.6416
65.968
68.2944
70.6208
61.3152
图 7 酶解温度与加酶量交互影响水解物ACE抑制率的响应
曲面图和等高线图
Fig.7 Response surface and contour plots showing the effects of
hydrolysis temperature and enzyme dosage on ACE inhibitory rate
3 结 论
通过单因素试验考察酶解pH值、酶解温度、酶解时
间、加酶量4个因素，并在此基础上利用响应面试验优化
酶解制备山核桃降血压肽的工艺。确定得到ACE抑制率
最佳的条件为pH8.2、酶解温度56℃、酶解时间4h、加酶
量5880U/g，此时水解度为29.03%，水解物的ACE抑制率
为72.48%。本实验为山核桃降血压肽的酶法制备提供理
论依据，并为其进一步开发利用奠定基础。
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