全 文 ：品溶液 ,按色谱条件进行测定 ,计算游离没食子酸回
收率为 98. 24 。
2. 9　提取方法的选择
比较甲醇 、50 甲醇提取溶剂种类 ,发现 50
甲醇提取的没食子酸含量最高;比较了超声提取 、回
流提取和冷浸过夜等提取方法 ,发现冷浸过夜提取
的没食子酸含量最高 ,且重现性好。
2. 10　水解方法的选择
比较了水解时间 , 2、4、6、8、10 h,时间太短 ,提
取率低 ,时间太长 ,没食子酸易被破坏 ,故选择 6 h;
比较水解温度 60、70、80、90、100 ℃,温度高 ,水解效
果好 ,温度过高 ,溶剂易蒸干 ,没食子酸易被破坏和
损失 ,故选择 90 ℃;比较 pH 2、4、6,发现 pH 4时 ,
重现性较好 。
2. 11　样品测定
分别按上述处理方法和色谱方法 ,测定不同采
集日期的元宝枫叶中游离和水解没食子酸的含量 ,
结果见表 1。
表 1　 游离和水解没食子酸的含量测定
采集日期(月) 游离没食子酸含量( ) 水解没食子酸含量( )
4 0. 316 5. 412
5 0. 146 3. 122
6 0. 165 2. 614
7 0. 110 1. 351
8 0. 108 3. 000
9 0. 141 2. 883
10 0. 055 1. 461
11 0. 045 1. 456
3　讨论
3. 1　元宝枫叶中游离的没食子酸含量为 0. 045 。
通过冷浸的方法提取元宝枫叶游离没食子酸 ,方法
简单。用 HPLC分离分析元宝枫叶游离没食子酸的
含量 ,重现性好。
3. 2　元宝枫叶中水解的没食子酸含量较高 , 为
1. 456 。水解没食子酸的提取受水解时间 、温度 、
pH等很多因素影响 ,在提取率和提取稳定性方面尚
需摸索。
3. 3　游离没食子酸含量较少 ,水解没食子酸含量
大 ,且不同季节含量不同 ,其中 4月份的游离没食子
酸含量和水解没食子酸含量均较高 , 11月份的落叶
中游离没食子酸含量和水解没食子酸含量均较低 。
3. 4　研究发现 [ 9] , 酰基与抑制 FAS有关 ,元宝枫
叶中含有该类物质 ,与水解没食子酸含量高和随季
节变化有很大关系 。通过探讨元宝枫叶没食子酸含
量 ,对开发天然产物资源有重要意义。
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RP-HPLC测定枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸的含量
杜丰玉 1, 2 , 　陈　钧 1 , 　宣　寒 1 , 　任晓峰1 , 　郭海燕 1
(1. 江苏大学药学院 ,江苏 镇江 212013;2. 莱阳农学院植物保护学院 ,山东 青岛 266000)
收稿日期:2005-11-16
作者简介:杜丰玉(1981～ ),男 ,硕士生 ,研究方向:中药新药开发和药物分析 ,电话:13775375855　E-m ail:du fengyu@ sohu. com.
关键词:枇杷叶;熊果酸;齐墩果酸;含量测定;高效液相色谱法
摘要:目的:为控制和评价枇杷叶及其中药制剂的质量 ,建立 RP-HPLC法测定枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸含量的方法。
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中 成 药
Chine se T raditiona l PatentM ed icine
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方法:采用反相高效液相色谱法 , 在不同品牌碳十八柱上以不同流动相系统检测同一枇杷叶样品中熊果酸 、齐墩果酸。
结果:最佳色谱条件为:采用 L ichro sphe rC18(250 mm ×4. 6 mm , 5 μm)色谱柱 , 甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90∶10∶0. 03∶
0. 06)为流动相 , 流速 0. 8 mL /m in,检测波长 215 nm , 熊果酸 、齐墩果酸能达到基线分离(RS >1. 65),两者在 0. 4μg～ 4. 0
μg范围内呈良好的线形关系。结论:本方法简便 、准确 、重现性好 , 可为建立枇杷叶及其中药制剂的质量标准提供参考。
中图分类号:R944. 2+7　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2006)12-1790-03
　　枇杷叶系蔷薇科 Rosaceae枇杷属植物枇杷 E ri-
obotrya japon ica(Thunb. )Lind.l的干燥叶 ,主产于广
东 、江苏 、福建 、江西等地 ,有清肺止咳 、降逆止呕之
功效[ 1] ,收载于历版中国药典供中医临床使用 。近
期对其化学成分的研究表明 ,其主要成分为三萜酸
和倍半萜及其苷类 ,药理活性的报道主要集中在三
萜酸的抗炎 、降血糖和抗病毒活性方面 ,其中熊果酸
(urso licacid, UA)、齐墩果酸 (o leanolic acid, OA)含
量明显占优势[ 2, 3] 。中国药典 2005年版收载的多
种中药中往往 UA和 OA共存 ,因为两者为一对同
分异构五环三萜酸 (图 1),药典采用的薄层扫描法
测定的实际为两者的总含量。近年越来越多的文献
报道采用高效液相色谱法 ,但不同文献选用的色谱
柱 、流动相 、检测波长不同 。本研究比较了同一枇杷
叶样品用 3种典型的流动相系统在 4种不同品牌碳
十八色谱柱上对 UA、OA分离的效果 ,建立了反相
高效液相色谱法同时测定枇杷叶中两者含量的方
法 ,并对各主要产地 、来源的枇杷叶中 UA、OA的含
量进行了测定 ,为建立枇杷叶及其中药制剂的质量
标准提供参考。
图 1　熊果酸 、齐墩果酸结构式
1　仪器与材料
日本 Jasco PU-980型高效液相色谱仪 , UV-100-
Ⅵ 紫外检测器 , Jasco Ckchrom 数据处理软件;色谱
柱:(1)HypersilODS2(5 μm , 4. 0mm ×250 mm ,大
连依立特 ,柱号:E1614610,批号:5 /120 /7111):(2)
S inochrom ODS-AP(5 μm , 4. 0mm ×250mm ,大连依
立特 , 柱号:E1618859, 批号:11001):(3) K romsil
C18(5 μm , 4. 0 mm ×250 mm ,江苏汉邦 , P ro. No:
4C18254F, Ser. No:0407110);(4) Lichro sphe rC18(5
μm , 4. 0 mm ×250 mm , 江 苏汉 邦 , Pro. No:
7C18254F, Ser. No:05083006)。
熊果酸对照品 (批号 110742-200415)、齐墩果
酸对照品 (批号 110709-200304)购自中国药品生物
制品检定所;枇杷叶药材采自江苏 、广东 、福建 、江
西 、海南等地 ,经江苏大学生药学研究所欧阳臻副教
授鉴定为 E riobotrya japonica(Thunb. )Lind.l的干燥
叶。
2　方法和结果
2. 1　色谱条件的选择
齐墩果酸甲醇液 λm ax =207 nm、熊果酸甲醇液
λmax =206 nm(图 2)。在此检测波长下 ,流动相中甲
醇的紫外吸收干扰较大 ,基线不稳 。故选择 215 nm
为检测波长 ,可同时检测两者含量 ,且具有较高的灵
敏度 。
图 2　熊果酸甲醇液紫外全波长扫描图
　　依据文献 [ 4, 5, 6] ,采用分离 UA、OA的典型流动
相系统:①甲醇-水-冰醋酸-三乙胺 (90∶10∶0. 03∶
0. 06);②甲醇-水-磷酸(90∶10∶0. 05);③乙腈-甲醇-
水-磷酸 (80∶10∶10∶0. 05);流速:0. 8 mL /m in;柱
温:室温;检测波长:215 nm。
取同一对照品溶液 ,按以上色谱条件分别进样 ,
得到在四根色谱柱上 3种典型流动相系统的色谱结
果 ,记录熊果酸峰的保留时间 ( tR),计算熊果酸峰与
相邻齐墩果酸峰的分离度(RS)。结果见图 3, 4(注:
为清晰表示 ,图中同一流动相的相邻点之间以虚线
连接 )。
　　结果表明 , LichrospherC18色谱柱在 3种流动相
系统下对 UA、OA峰的分离度都显著高于其他三根
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色谱柱 , UA峰的理论塔板数 N >12 000,峰形对称 ,
保留时间(tR <25m in)也适中。 HypersilODS2柱 N
<8 000,对 UA、OA的分离效果最差 ,不适合分离这
对同分异构体 。根据色谱柱生产厂家的资料 , 4种
柱的主要区别在于碳含量 , Hypersil ODS2柱碳含量
11 ,明显低于其他 3根色谱柱 , Lichro sphe r C18柱
碳含量 18 ,理论塔板数最高 ,提示分离 UA、OA时
选择碳含量较高 、柱效较高的碳十八柱合适 。本文
选择 LichrospherC18柱符合上述要求 。
图 3　在不同色谱柱与流动相系统下熊果酸的保留时间
图 4　在不同色谱柱与流动相系统下熊果酸
与齐墩果酸的分离度
　　在 4根色谱柱上 ,流动相系统 2对 UA、OA的分
离度高于流动相系统 3,虽然后者保留时间短 ,但差
别不大 ,考虑经济 、操作等因素 ,选择基于甲醇-水的
流动相系统 。流动相系统 1的添加剂为冰醋酸-三
乙胺 ,在 4根色谱柱上对 UA、OA的分离度高于以
磷酸为添加剂的流动相系统 2,保留时间短 ,故选择
甲醇-水-冰醋酸-三乙胺流动相系统。加入少量冰醋
酸可以创造弱酸性环境 ,利于两种酸的分离 ,加入少
量三乙胺作为扫尾剂有利于改善峰形 ,提高分离
度 [ 7] 。
综合上述试验结果 ,确定色谱条件为:色谱柱:
Lichrospher C18(250 mm ×4. 6 mm , 5 μm);流动相:
甲醇-水-冰醋酸-三乙胺 (90∶10∶0. 03∶0. 06);流
速:0. 8mL /m in;柱温:室温;检测波长:215 nm。在
此色谱条件下 ,熊果酸与齐墩果酸能达到基线分离
(RS >1. 65), 理论塔板数以熊果酸峰计不低于
12 000。
2. 2　提取条件的选择
试验比较了甲醇 、95 乙醇 、乙醚 、氯仿 4种提
取溶剂 ,乙醚 、氯仿提取液的杂质较少 ,但提取率低 ,
甲醇与 95 乙醇提取率相当 ,而甲醇提取液色谱图
杂质峰少 ,对熊果酸与齐墩果酸测定无干扰 ,基线较
平稳 ,分离度高 。枇杷叶甲醇提取液色谱图上齐墩
果酸峰前有一明显干扰测定的色谱峰 , 经石油醚
(30 ～ 60 °C)脱脂处理后该色谱峰消失 。选择好甲
醇作溶剂后 ,对比超声 、索氏 、加热回流 3种提取方
法 ,结果超声 40m in×2次的提取率与索氏 6 h的提
取率相当 ,显著高于回流提取 ,为便于操作 ,选择超
声提取。试验同时对提取时间 (20, 30, 40, 50 m in)
(图 5)和次数 (1, 2, 3次)(图 6)进行了考察 ,也表
明超声提取 40 m in×2次可以将 UA 、OA基本提取
完全 。
图 5　不同提取时间提取率的比较
图 6　不同提取次数提取率的比较
　　综合上述试验结果 ,样品溶液制备方法为:精密
称取本品粉末 (过 10目筛 )0. 50 g,置 100mL具塞
锥形瓶中 ,用石油醚 (30 ～ 60 °C)浸泡 2次 ,每次 15
mL,倾去石油醚 ,烘干 ,加甲醇 25 mL冷浸 15 m in,
超声提取 2次 , 40 m in /次 ,合并滤液 ,转移至 50 mL
量瓶中并定容至刻度。取适量于 0. 45 μm微孔滤
膜过滤后备用 。
2. 3　对照品溶液的制备
精密称取熊果酸对照品 2. 0 mg、齐墩果酸对照
品 2. 0 mg置于 10mL量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至
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刻度 ,摇匀 ,配成熊果酸 、齐墩果酸分别为 0. 2 mg /
mL的溶液 。
2. 4　线性关系
精密吸取对照品溶液 0. 1, 0. 2, 0. 3, 0, 4 , 0. 5,
1. 0mL,分别置 1 mL量瓶中 ,甲醇定容 ,摇匀 。进
样 20μL,按上述色谱条件测定峰面积积分值 ,以峰
面积值 (×105)为纵坐标 ,对照品进样量 (μg)为横
坐标 ,经线性回归处理 ,其回归方程为熊果酸:Y =
7. 761 8X - 0. 915 1(r=0. 999 6, n=6),齐墩果酸:Y
=6. 706X - 0. 7012(r=0. 999 6, n =6),两者线性范
围均为 0. 4 ～ 4. 0 μg。
2. 5　方法学考察
精密吸取对照品溶液 20 μL,重复进样 5次 ,按
上述色谱条件测定峰面积积分值 , RSD =0. 9 。精
密称取 0. 50 g样品粉末 5份 ,按上述样品溶液制备
方法和色谱条件测定峰面积积分值 , RSD =1. 1 ,
取同一对照品溶液 ,在 0 , 1, 2, 4, 8, 24 , 48h分别进样
20 μL,测定熊果酸与齐墩果酸的含量 , RSD 分别为
1. 6 和 1. 4 。以上表明本方法具有良好的精密
度 、重复性与稳定性。
精密称取 0. 10 g已测知熊果酸 、齐墩果酸含量
的样品粉末 5份 ,各精密加入对照品溶液适量 ,按上
述样品溶液制备方法和色谱条件测定峰面积积分
值 ,计算回收率。结果平均回收率:熊果酸100. 3 ,
RSD为 1. 5 ;齐墩果酸 100. 8 , RSD为 1. 8 。加
样回收率符合要求。
2. 6　样品含量测定
收集不同产地或从药店购买的枇杷叶 。分别称
取 0. 5 g,精密称定 ,按上述样品溶液制备方法和色
谱条件测定峰面积积分值 ,含量测定结果见表 1,对
照品溶液与枇杷叶样品典型色谱图见图 7, 8。
图 7　对照品的高效液相色谱图
1. 熊果酸　2. 齐墩果酸
3　结论
本文优化建立了分析中药枇杷叶中UA、OA含
图 8　枇杷叶药材的高效液相色谱图
1. 熊果酸　2. 齐墩果酸
表 1　 枇杷叶样品及其熊果酸 、齐墩果酸
含量测量结果
编号 产地或来源 UA含量(mg /g) OA含量(m g /g)
1 广东 6. 26 2. 15
2 广东 8. 74 2. 81
3 海南 7. 57 2. 47
4 福建莆田 7. 77 2. 67
5 福建福州(秋季采收) 6. 30 2. 17
6 江苏镇江(秋季采收) 6. 79 2. 25
7 山东淄博 8. 6 2. 24
8 山东济南 10. 16 3. 24
9 江西 10. 11 2. 58
10 江苏镇江采芝林 9. 15 2. 61
量的样品制备方法与 HPLC色谱条件 ,比较了 10批
各主要产地和来源的枇杷叶中 UA、OA的含量 ,最
低为广东产枇杷叶样品 , UA含量为 6. 26 mg /g, OA
含量为 2. 15 mg /g,最高为山东济南产枇杷叶样品 ,
UA含量为 10. 16 mg /g, OA含量为 3. 24 mg /g。本
研究为建立枇杷叶及其中药制剂的质量标准提供了
参考方法 。
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