全 文 ：龙牙楤木叶总皂苷抗肿瘤作用机理研究
吴勃岩 1,韩玉英 2,梁 颖 1,王 晶 3
( 11 黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040; 21首都医科大学, 北京 100069;
31 黑龙江省中医研究院,黑龙江 哈尔滨 150036)
摘 要: 目的:探讨龙牙楤木叶总皂苷抗肿瘤作用机理。方法:采用 ELISA法检测 S - 180小鼠 IL -2、TNF -A含量;
免疫组化法检测肿瘤组织中 rasP21蛋白和突变型 P53蛋白含量。结果:龙牙楤木叶总皂苷明显增高 S - 180小鼠 IL -2、
TNF -A含量 (P < 0105) ;对 ra sP21和 P53蛋白表达明显减少 (P < 01 05)。结论:龙牙楤木叶总皂苷能诱生荷瘤小鼠 IL
- 2、TNF -A含量,抑制 ras癌基因蛋白 P21和 突变型 P53蛋白的过度表达,而达到抗肿瘤的作用。
关键词: 龙牙楤木叶总皂苷; IL -2; TNF -A; rasP21蛋白; P53蛋白
中图分类号: R979. 1 文献标识码: A 文章编号: 1000 -1719( 2010) 01 - 0175 - 02
TheM echan ism of Ac tion Research of TSAS Resist Tum or ofM ice
WU Bo-yan1, HAN Yu-y ing2, L IANG Y ing1, WANG J ing3
(11Heilongjiang University o f Chinese Med icine, Harb in 150040, H eilong jiang, China;
21Capita l o f University Med ica l Sciences, Beijing 100069, China; 31Heilong jiang Academy o f TCM , Harb in 150036, H eilong jiang, China )
Abstrac t: Ob jective: To discuss the e ffec t o f to ta l saponin o fA ra lia e lata Seem leaf( TSAS) on an ti-cance r.M ethod s: D e term ine
the amounts o f serum IL -2 o fm ice by ELISA, tum or ce ll apopto sis by FCM and rasP21 pro tein in tumo r tissue. Resu lts: TSAS can
cause the num be r o f serum IL -2 increa se obv iously, canct a lter the tum or ce ll cyc le distinc tly. Apop to sis ra te he igh ten clearly the
number of rasP21 pro tein reduce ev iden tly. Conclus ion: TSAS can increase serum IL - 2, induce the tum o r cell to apoptosis and
urge ras cance r gene reversion to re sist tum o r.
K ey words: TSAS; IL - 2; ce ll apoptosis; rasP21 p ro te in; P53 pro tein
收稿日期: 2009 - 04 - 29
基金项目:黑龙江省教育厅资助科研项目 ( 10511163)
作者简介:吴勃岩 ( 1958 - ) ,女,黑龙江哈尔滨人,教授, 硕士研究生导
师,硕士,主要从事中草药的抗肿瘤研究工作。
龙牙楤木系五加科楤木属植物, 主要分布在我国
东北地区,其根皮入药具补气安神,强精滋肾, 祛风活
血之功效。龙牙楤木叶总皂苷是从龙牙楤木叶中提取
的一种化学成分,经药理研究发现龙牙楤木叶总皂苷
成分具有较强的抑瘤作用, 并且能提高荷瘤小鼠巨噬
细胞的吞噬能力,使荷瘤小鼠血清组织蛋白表达恢复
正常 [ 1- 2 ]。本实验采用 ELISA法对 S - 180小鼠 IL -
2、TNF -A含量检测; 采用免疫组织化学方法检测荷
瘤小鼠肿瘤组织中 rasP21蛋白含量和突变型 P53蛋
白含量。目的是从 IL -2、TNF -A含量与 ras癌基因、
p53基因之间的关系中探讨龙牙楤木叶总皂苷抗肿瘤
的作用机理。
1 材 料
11 1 动物 昆明种小鼠, 体重 ( 20 ? 2) g,黑龙江中医
药大学实验动物中心提供。
11 2 瘤株 小鼠肉瘤 S180瘤株由黑龙江省肿瘤研究
所提供。
11 3 药物与试剂 龙牙楤木叶总皂苷由黑龙江中医
药大学药学院提取并提供; IL - 2试剂盒、TNF -A试
剂盒购于上海森雄公司; rasP21、P53单抗购于北京中
山生物公司。
2 方 法
21 1 荷瘤 S180小鼠肿瘤模型的制备 于无菌条件下
取传代 7天生长良好的小鼠腹水用生理盐水 1B3稀
释,以 012mL /只接种于小鼠右前腋下待其长为实体
瘤。
21 2 动物分组 将接种 S180肿瘤细胞的小鼠随机分
为 4组:龙牙楤木叶总皂苷组,模型组,环磷酰胺组, 联
合用药组。以未接种瘤株的昆明小鼠为正常对照组。
21 3 给药情况 于接种瘤细胞第 2天首次给药,龙牙
楤木叶总皂苷组按 100mg /kg灌胃给药, 环磷酰胺组
30mg /kg腹腔注射, 联合用药组龙牙楤木叶总皂苷灌
胃给药第 3天时,环磷酰胺 30mg /kg腹腔注射,模型组
和正常对照组以生理盐水 012mL /只灌胃。连续给药
8天,每日 1次, 于第 8日晚禁食 12h后取血、取瘤组
织。
21 4 小鼠血清 IL - 2 TNF -A含量测定 摘眼球取
血,分离血清,用酶联免疫检测法,按 ELISA试剂盒说
明书操作步骤进行。每孔加入 100LL标准品或待测
样品,每个样品重复两孔, 加入终止液后。在酶标仪上
分别检测 450nm和 492nm波长处吸光值 ( OD) , 根据
OD值画出标准曲线, 并据标准曲线计算各样品 IL -
2、TNF -A的含量。
21 5 荷瘤小鼠肿瘤组织中的 rasP21蛋白含量 突变型
P53蛋白含量检测 处死小鼠剥离瘤组织, 免疫组化
SP法常规制片, 将 P21和 P53抗体按 1B100配制。结
果判定应用多媒体病理图文分析系统 MPAS - 500对
免疫组化结果进行分析, P21和 P53蛋白阳性细胞的
胞浆呈棕黄色。
21 6 统计学处理 结果以 (€x ? s )表示, 使用 SPSS
#175# 辽宁中医杂志 2010年第 37卷第 1期 DOI：10.13192/j.ljtcm.2010.01.180.wuby.073
101 0统计软件进行统计学处理, 组间差异采用方差分
析,两两比较 IL -2、TNF -A、rasP21、突变型 P53蛋白
含量用 t检验。
3 结 果
31 1 龙牙楤木叶总皂苷对荷瘤鼠 IL - 2含量的影响
实验结果显示, 龙牙楤木叶总皂苷组 IL - 2含量与
正常对照组相比无明显差异 (P > 0105 ); 与模型组相
比明显提高 ( P < 01 05) ;环磷酰胺组 IL - 2含量与正
常组相比明显减少 ( P < 01 05) ;联合用药组 IL - 2含
量与正常对照组相比无明显差异 (P > 01 05)。结果见
表 1。
表 1 龙牙楤木叶总皂苷对荷瘤鼠 IL - 2含量的影响 (€x ? s)
组别 n IL - 2( pg /m L)
正常对照组 8 215. 63 ? 18. 17
模型组 8 127. 35 ? 18. 49
龙牙楤木叶总皂苷组 8 198. 64 ? 22. 31* * *
环磷酰胺组 8 131. 83 ? 21. 22* *
联合用药组 8 193. 59 ? 17. 46*
注: * P > 0105, * * P < 0105。
31 2 龙牙楤木叶总皂苷对荷瘤鼠 TNF -A含量的影
响 龙牙楤木叶总皂苷组和环磷酰胺组 TNF -A的含
量与模型组相比有显著性差异 (P < 0105 ); 正常对照
组与模型组相比无显著性差异 (P > 0105)。结果见表
2。
表 2 龙牙楤木叶总皂苷对荷瘤鼠 TNF -A含量的影响 (€x ? s)
组别 n TNF -A( pg /m L)
正常对照组 8 127. 0 ? 38. 2*
模型组 8 139. 2 ? 47. 07
龙牙楤木叶总皂苷组 8 178. 7 ? 51. 0* *
环磷酰胺组 8 229. 2 ? 52. 2* *
注: * P > 0105, * * P < 0105。
31 3 龙牙楤木叶总皂苷对 rasP21蛋白 突变型 P53蛋
白表达的影响 结果显示, 龙牙楤木叶总皂苷组 ras
癌基因 P21蛋白表达与模型组相比明显减少 ( P <
01 05); 环磷酰胺组与模型组相比明显减少 ( P <
01 05);龙牙楤木叶总皂苷组与环磷酰胺组相比无明
显差异 ( P > 0105)。结果见表 3。
表 3 龙牙楤木叶总皂苷对 rasP21 P53蛋白表达的影响 (€x ? s)
组别 n P21(阳性单位 ) P53 (阳性单位 )
龙牙楤木叶总皂苷组 10 39. 82 ? 1. 54* * * 40. 26 ? 1. 79* * *
模型组 10 43. 06 ? 4. 00 42. 92 ? 4. 00
环磷酰胺组 10 39. 56 ? 2. 88* * 39. 06 ? 2. 88* *
注: * P > 0105, * * P < 0105。
4 讨 论
肿瘤免疫主要由细胞免疫来实现, 机体的细胞免
疫功能主要由 T淋巴细胞负责,免疫功能的强弱很大
程度上由 T细胞功能来体现。 IL - 2含量的变化, 是
反映 T细胞功能的重要指标。 IL - 2主要由活化 T细
胞产生,具有多种与免疫功能强化有关的生物学活性,
可以刺激机体的细胞毒性 T淋巴细胞 ( CTL)和 NK细
胞产生干扰素,这种内源性的干扰素可以使得单核 -
巨噬细胞发生活化, 产生肿瘤坏死因子 A( TNF -A ),
活化的 T细胞、NK细胞也能产生 TNF -A而导致肿瘤
细胞凋亡。 IL - 2和 TNF -A是机体免疫系统中的重
要的抗肿瘤细胞因子,在肿瘤的生物治疗中受到广泛
的重视。细胞凋亡是多细胞生物体内由基因控制的细
胞主动死亡过程,参与调控机体发育,维持内环境稳定
以及许多病理过程, 特别是与肿瘤的发生发展和转归
有密切的关系,对细胞凋亡的研究已成为当今生物学
领域的热点之一。
IL - 2参与 T细胞的激活, IL - 2可以活化自然杀
伤细胞 ( NK) ,在 NK细胞整个发育过程中 IL - 2及干
扰素 ( IFN )是必不可少的调节 NK细胞增殖活化和分
化的因子,只有生理水平的 IL - 2和 IFN, NK细胞才
能得以保持自然杀伤活性。在具有杀瘤能力的细胞
中, NK、CTL、肿瘤浸润的淋巴细胞 ( T IL) 、淋巴因子激
活的杀伤细胞 ( LAK )在活化及强化其生物学效应上
均需 IL - 2参与, IL -2并能促进 B细胞分化、增殖和
合成抗体,是机体免疫应答的关键因子。所以从免疫
调节的角度看, IL -2、TNF -A在防治肿瘤上具有广阔
的应用前景。
结果显示:龙牙楤木叶总皂苷能显著提高荷瘤小
鼠机体 IL -2水平, IL -2可以促进 T细胞增殖, 活化
NK细胞,诱生 TNF -A, 诱导 CTL细胞, 激活 LAK细
胞和 TIL细胞, 而 LAK细胞被证明能诱导肿瘤细胞的
凋亡,发挥强有力的抗肿瘤作用。
P21蛋白是 ras癌基因家族的编码产物, ras癌基
因参与细胞生长和分化的调控, 参与多种肿瘤的形成
与发展。已经在膀胱癌、乳腺症、结肠癌、肾癌、肝癌、
肺癌、胰腺癌、胃 癌、及造血系统肿瘤中, 均检测出了
ras癌基因的蛋白产物 P21的过度表达 [3 - 4]。
抑癌基因 P53有野生型和突变型两种形式, 正常
细胞中含野生型 p53基因极其 P53蛋白,在 DNA损伤
修复中有重要作用。P53蛋白是 DNA损伤后进行应
答和修复的分子物质,能维持细胞的正常生长、抑制恶
性增殖、诱导细胞凋亡。而突变型 P53基因具有致癌
作用,其表达产物在人类大多数肿瘤中都过量表达。
突变型 P53蛋白表达增高与 DNA修复能力的下降有
明显的相关性 [5 ]。
采用免疫组化法结果显示, 龙牙楤木叶总皂苷组
小鼠肉瘤 S180组织中的 rasP21含量与模型组相比明
显减少 ( P < 01 05)。提示: 龙牙楤木叶总皂苷明显降
低 rasP21蛋白的表达, 其作用机制可能是直接或间接
的抑制 ras癌基因 P21蛋白、P53蛋白的过度表达, 而
达到抗肿瘤的作用,其机理还有待于更进一步的研究。
参考文献
[ 1 ] 吴勃岩,韩玉英,王艳杰, 等.龙牙楤木叶总皂苷对 H epA小肿瘤
组织蛋白的表达及 , 5 吞噬功能的影响 [ J ]. 哈尔滨医科大学学
报, 2002( 4 ): 45 - 46.
[ 2 ] 吴勃岩,韩玉英,刘淑兰, 等.龙牙楤木叶总皂苷对 H epA小鼠血
清蛋白的影响 [ J ].中医药学报, 2002( 4 ) : 62,
[ 3 ] 缪延杰,王泽.癌基因 ras产物 P21表达与膀胱癌生物学行为之间
的关系 [ J ].临床泌尿外科杂志, 1990, 5( 2 ) : 156 - 158.
[ 4 ] 冯震博,何如昆,吕自力,等. P21和增殖细胞核抗原在肝硬化组
织中的表达及其与肝细胞不典型增生的关系 [ J ].中华肝脏病杂
志, 2000( 6 ): 343.
[ 5 ] 陆爱平,李吉友. DNA损伤修复能力、P53蛋白及增殖细胞核抗原
在大肠癌发生过程中的变化 [ J ].中国肿瘤临床, 1997, 2 ( 12 ):
926 - 927.
#176# 辽宁中医杂志 2010年第 37卷第 1期