全 文 ：三叶青提取物抗乙肝病毒活性的研究
杨雄志1＊ ,巫军2
(1浙江医药高等专科学校中药系 ,浙江 宁波　315200;2宁波拜奥生物研究所 ,浙江 宁波　315201)
摘要:目的　研究三叶青 4 个提取部位对乙肝病毒的抑制作用。方法　运用 MTT法检测样品药物导致 50%细胞死亡的
数值浓度为 CC50;用 ELISA 方法检测样品药物达到抑制 HbsAg、HbeAg分泌 , 以及运用荧光定量 PCR法检测样品药物抑制
病毒 DNA 复制量的50%时的浓度数值为 IC50 。结果　三叶青 4个提取部位对乙肝病毒分泌的 HbsAg、HbeAg 均有抑制作
用。结论　三叶青乙酸乙酯部位对乙肝病毒具有较强活性 , 能明显降低 HBV 的 DNA复制水平 , 可进一步从中提取分离
具有更强生物活性的物质 ,为新药开发提供物质基础。
关键词:三叶青;HepG2.2.15细胞;抗乙肝病毒
中图号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5005(2009)04-0294-03
　　三叶青(Radix Tetrastigmae)为葡萄科植物三
叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的
干燥块根 ,分布于我国浙江 、江西 、福建及云南等
省区 ,具有清热解毒 ,祛风化痰 ,活血止痛的功能 ,
主要用于治疗高热惊厥 、腹痛 、肺炎 、哮喘及跌打
损伤等症[ 1] 。在民间就有用三叶青治疗肝炎的经
验 ,但尚未见相关的系统研究报道 。
1　材料
三叶青干品 ,购于宁波医药股份有限公司 ,经
浙江中医药大学来平凡教授鉴定为三叶青(Radix
Tetrastigmae)。标本现存放于浙江医药高等专科
学校中药系(No ZYRT-2006-01)。
HepG2.2.15细胞 ,由中科院上海药物研究所
药理室提供;HbsAg 和 HbeAg 检测用试剂盒购自
河南华美生物工程公司;其余试剂均购自上海化
学试剂厂 。
供试品:三叶青总提物 ,石油醚部位 ,乙酸乙
酯部位 ,二氯甲烷部位 ,正丁醇部位;阳性对照品:
阿德福韦(天津药物研究院药物研究院药业有限
公司生产)。
2　方法
2.1　药物对细胞毒性实验[ 2-3]
根据细胞生长速率 ,将处于对数生长期的
HepG2.2.15细胞 ,调整细胞数至 2×104/mL ,以 90
μL/孔接种于 96孔板中 ,贴壁生长 24 h再加药 10
μL/孔 ,至终浓度为 2.5 , 5.0 ,7.5 ,10 ,12.5 μg/mL ,
每个浓度 10 个复孔 ,空白对照组除未加药液外 ,
其余条件完全一致 ,定期更换培养液及同浓度的
样品药物 ,于 d 8收集培养上清待测 。向 96孔板
中的细胞加 150 μL/孔的 MTT 溶液反应过夜 ,次
日在酶标仪570 nm波长下测定OD570值 。以OD570
间接反应存活细胞数量 ,据此可推算导致半数细
胞死亡量所需的浓度(CC50)。各组试验均重复 3
次 ,试验数据用 SPSS13.0统计分析 。以阿德福韦
为阳性对照组 。
2.2　处理细胞的收集
将HepG2.2.15细胞接种于培养瓶中 ,次日加
入样品药物 ,经定期更换培养液及同浓度的样品
药物 ,于 d 8收集细胞待测 。
2.3　培养上清中 HbsAg 和 GbeAg 含量的检测方
法(ELISA法)
运用 HbsAg 和 HbeAg 检测用试剂盒(华美生
物工程公司 ,河南洛阳)进行检测。向包被好的条
纹板中加入样品 ,并加入等量的酶标结合物 ,37℃
反应 1 h后洗板 ,重复 5次。加入显色液 A和 B ,
15 min后终止反应 ,测定 OD450/OD630 ,并根据 OD
收稿日期:2009-03-02;修稿日期:2009-03-28
基金项目:浙江省宁波市科研攻关基金资助项目(2005C100006)
作者简介:杨雄志(1955-),男 ,浙江医药高等专科学校教授。 ＊通讯作者:0574-88223063
—294— 南京中医药大学学报 2009 年 7月第 25 卷第 4 期JOURNAL OF NANJING TCMUNIVERSITY Vol.25 No.4 July.2009
DOI :10.14148/j.issn.1672-0482.2009.04.021
值计算出样品对 HBV抗原的半数抑制率(IC50)。
2.4　细胞内HBV核心颗粒中 DNA检测
溶液 A:1 mL(10 mmol/L)Tris(pH7.5)/1
mmol/L EDTA/50 mmol/L NaCl/8%蔗糖/0.25%
Nonidet(诺乃洗涤剂)P-40 ,裂解液。
溶液 B:Dnase I(50 g/mL)和 Rnase A(20 g/
mL),提取液。
溶液 C:26%聚乙二醇/1.4 mmol/L NaCl/25
mmol/L EDTA ,沉淀液。
溶液D:10 mmol/L Tris(pH7.5)/6mmol/L Mg-
Cl2 ,悬液 。
采用的方法为:用药处理 8 d的细胞 ,胰酶消
化 ,从细胞中提取核心颗粒中的 DNA;消化下来
的细胞用溶液A 裂解 ,4℃离心 3 min ,取上清 ,调
成6 mmol/L MgCl2浓度 ,加入溶液B ,37℃30min ,
加入 330μL 溶液 C沉淀可离心颗粒 ,4℃ 30 min
后 ,离心 4 min ,沉淀重悬于 100 μL 溶液 D ,加入
DNase I 37℃消化 15 min ,所获得的样品进行实时
荧光定量 PCR , 以 HepG2.2.15 细胞总 DNA 中
GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内标 ,检测
HBV核心颗粒中DNA水平的改变。
试验引物为:5 -GGTATCGTGGAAGGACTCAT-
GAC-3 。
2.5　计算
根据OD值计算出供试品对 HbsAg 和 HbeAg
生长的抑制率 ,按以下公式计算
　抑制率(%)=(阳性对照 OD值-供试品OD 值)空白对照组 OD值 ×100%。
供试品对 HBV抗原 DNA 复制的半数抑制率
(IC50)用 Logit法计算 。
3　实验结果
供试品对受试 HepG2.2.15细胞生长均具有
一定抑制作用 ,其中乙酸乙酯部位对其 3项指标
显示较强活性 , IC50值为 1.3 ～ 48.6 mg/L。数据见
表 1。
表 1　三叶青各部位对HepG2.2.15 细胞HBV 的抑制作用( x±s ,mg/ L)
样品 CC50 IC50
HbsAg HbeAg DNA复制
三叶青总提物 447.0±110.0 62.5±6.5 128.0±45.0＊ 141.0±38.0
石油醚部位 >1 000 264.8±26.7 820.5±128.3 438.7±98.2
乙酸乙酯部位 385.0±56.0 32.6±3.3＊＊ 48.6±3.8＊＊ 1.3±0.1＊＊
二氯甲烷部位 >1 000 173.5±24.2 418.0±70.6 836.5±158.6
正丁醇部位 610.0±180.0 76.4±2.8 67.1±31.0 46.1±21.9
阳性对照组 182.0±21.0 3.6±0.5＊＊ 213.2±18.3 1.0±0.7＊
空白对照组 739.0±178.0 358.3±63.0 >1 000 56.8±10.2
　　　注:CC50为样品对 HepG2.2.15细胞生长的 50%致死浓度;IC50为样品对 DNA 拷贝的抑制达 50%时的浓度。与空白对照组比 ,
＊P<0.05 , ＊＊P<0.01。
4　讨论
(1)HepG.2.2.15细胞模型是 Sells等人[ 4]在
1987年将克隆的 2个头尾相连的 HBVDNA 全基
因及抗 G4l8质粒直接导入受体细胞———人肝癌
细胞株 HepG2 细胞构建而成。该细胞不仅支持
HBV DNA的复制 ,且支持 Dane 样颗粒的包装与
分泌[ 5] 。目前 ,该细胞模型已被国内外学者公认
且广泛用于抗 HBV药物筛选和评价等研究[ 6] ,现
已成为申报抗 HBV新药必须做的体外实验模型 。
(2)本实验采用了快速 、准确的实时 FQ-PCR
技术[ 7] ,检测三叶青提取各部位含药血清对HepG
2.2.15细胞上清中 HBVDNA 含量的变化。FQ-
PCR在常规 PCR的基础上 ,添加了一条与待扩增
的靶序列互补并且标记了 2个荧光基团标记的一
段TaqMan探针 ,探针只与模板特异性地结合 。该
方法精确 、灵敏 、重复性好 、污染少 ,是目前国际公
认的核酸分子定量定性检测标准方法 ,广泛用于
药物疗效考核和病原体检测等领域 。
(3)本实验结果表明 ,三叶青提取各部位含药
血清在作用 HepG2.2.15细胞 192 h 后 ,发现三叶
青乙酸乙酯提取部位可使细胞上清液中 HBV
DNA的拷贝数降低(P<0.01),对HBV DNA具有
显著的抑制作用 ,即在病毒复制水平抑制了 HBV
的合成 。且随着药物浓度和作用时间的增加 ,其
抑制作用逐渐增强 ,呈现一个明显的量效和时效
反应关系 。这说明该药可抑制 HepG2.2.15细胞
上清液中HBV DNA的复制 ,提示三叶青在体外具
有直接抗 HBV作用 。三叶青乙酸乙酯提取部位
究竟作用于病毒复制过程的哪一环节有待进一步
研究证实 。
—295—杨雄志 , 等:三叶青提取物抗乙肝病毒活性的研究　第 4期
参考文献:
[ 1]江苏新医学院.中药大词典(下册)[ M] .上海:上海科
学技术出版社 , 1996.2123.
[ 2] 张士军 , 林军 , 焦杨 , 等.复方六月雪含药血清对
HepG2.2.15细胞 HBV DNA的抑制作用[ J] .中药材 , 2006 ,
29(12):1338-1339.
[ 3] 左建平 ,赵维民 , 王桂凤 ,等.新型抗乙肝病毒抑制剂及
其应用[ P] .中国专利:200610026391.X , 2006-12-20.
[ 4] Sells MA , Chen ML, Acs G.Production of hepatitis B virus-
particles in Hep G2 cells transfected with Cloned hepatitis B virus
DNA[ J] .Proc Natl Acad Sci , 1987 , 84(4):1005-1009.
[ 5] Sells MA , Zolent AZ , Shvartsman M , et al.Replicative inter-
mediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infec-
tious virions[ J] .J Virol , 1988 , 62(8):2836-2844.
[ 6] Lampertico P ,Malter JS , Gerber MA.Development and appli-
cation of an in vitro model for screening anti-hepatitis B virus
therapeutics[ J] .Hepatology , 1991 , 13(3):422.
[ 7] Brechtbuehl K ,Whalley SA , Dusheiko GM , et al.A rapid real
-time quantitative polymerasrchain reaction for hepatitis B virus
[ J] .J Virol Methods , 2001 , 93(1-2):105-113.
(编辑:李伟东)
A Study of Anti-HBV Activity of Extract of Radix Tetrastigmae
YANG Xiong-zhi1 , WUJun2
(1Department of Chinese Medicine , Zhejiang Medical College , Ningbo , Zhejiang , 315200 , China;2Ningbo Biomedical Research Institute ,
Ningbo , Zhejiang , 315201 , China)
ABSTRACT:To study the effect of four fractions extracted from Radix Tetrastigmae on HBV.METHOD:The level of HBsAg and
HBeAg secreted from HepG2.2.15 cells and the copies of DNAwhich were treated with four samples were detected.RESULT　The four
fractions from Radix Tetrastigmae showed inhibition activity on HBV.CONCLUSION　The ethyl acetate part of Radix Tetrastigmae can
significantly restrain the secretion of HBsAg and HbeAg from HepG2.2.15 cells , which can be further researched as new anti-HBV
drugs.
KEY WORDS:Radix Tetrastigmae;HepG2.2.15 cells;anti-HBV
·征订·
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—296— 南京中医药大学学报 2009年 7 月第 25卷第 4 期