全 文 ：收稿日期:2010-01-01; 修订日期:2010-06-11
基金项目:广东省自然科学基金(No.5011588;No.04011397)
作者简介:朱 宁(1979-),男(汉族),广东湛江人 ,现为广东医学院生物
化学与分子生物学研究所在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事天然药物
抗肿瘤研究工作.
＊通讯作者简介:黄迪南(1962-), 男(汉族),湖南双峰人 , 现任广东医学
院教授 ,学士学位 ,主要从事肿瘤相关基因的分子生物学研究工作.
鸡矢藤挥发油体外抗乙型肝炎病毒作用研究
朱 宁 ,黄迪南＊ ,侯 敢 ,葛庆华
(广东医学院生物化学与分子生物学研究所 ,广东 湛江 524023)
摘要:目的 对鸡矢藤挥发油抗 HBV作用进行体外抗病毒实验研究。方法 采用水蒸气蒸馏法提取鸡矢藤挥发油 , 以
HepG2.2.15细胞为实验对象 ,检测鸡矢藤挥发油对 HepG2.2.15肝癌细胞株的细胞毒性。并在最大无毒浓度下观察鸡
矢藤挥发油对 HepG2.2.15细胞表达 HBsAg, HBeAg的影响。结果 鸡矢藤挥发油在 31 ～ 2 000 mg/L的浓度范围内 , 对
HepG2.2.15细胞有明显抑制作用 , TC50为 1 550 mg/L, TC0为 500mg/L。在最大无毒浓度下 , 鸡矢藤挥发油对 HBsAg最
大抑制率为 72.49%,治疗指数为 6.74, 对 HBeAg最大抑制率为 23.64%。结论 鸡矢藤挥发油对 HepG2.2.15细胞 HB-
sAg, HBeAg分泌有较好抑制作用。
关键词:鸡矢藤; 乙型肝炎病毒; HepG2.2.15细胞株; 挥发油; 乙肝表面抗原; 乙肝 e抗原
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.014
中图分类号:R284.2 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2010)11-2754-02
鸡矢藤是茜草科(Rubiaceae)鸡矢藤属(Paederia)多年生蔓
性草质藤本植物鸡矢藤 Paederscandens(Lour.)Merri.的全株 ,
其味甘酸 , 平和 , 是一种常用中草药 [ 1] , 广泛分布于中国 、日本 、
韩国 、越南 、泰国 、菲律宾 、印度等 , 以及美国西海岸。传统中药经
验表明其在黄疸 、肝炎 、肝脾肿大等治疗方面具有一定的作
用 [ 2, 3] , 其作为一种有效的抗乙肝辅助性草药 , 在中药中配伍很
广;同时其嫩茎叶又是广东;海南一带居民喜欢吃的美味野
菜 [ 4] , 具有很高的食用安全性。本实验中对鸡矢藤挥发油抗
HBV作用进行了体外抗病毒的实验研究 , 以期为鸡矢藤的进一
步开发提供理论依据 。
1 材料
1.1 鸡矢藤药粉 鸡矢藤地上部分采集于广东湛江市郊 , 经广东
医学院生化教研室黄迪南教授鉴定 , 为鸡矢藤 Paederiascandens
(Lour.)Merr。阴干 , 中药粉碎机粉碎并过 60目筛 , 备用。
1.2 HepG2.2.15细胞株 购于北京大学附属医院病毒研究所。
1.3 试剂 高糖 DMEM(Gibco公司), 新生胎牛血清(Gibco公
司), G418(Gibco公司), MTT(Sigma公司), 青霉素 、链霉素(碧
云天公司), 胰酶消化液(碧云天公司);HBsAg检测试剂盒
(ELISA法),上海科华生物工程有限公司产品;HBeAg检测试剂
盒(ELISA法),上海科华生物工程有限公司产品。
2 方法
2.1 鸡矢藤挥发油的提取 用水蒸气法提取鸡矢藤的挥发油。
精密称取鸡矢藤药粉 100 g,加 1 500 ml三蒸水于 2 000 ml烧瓶
中 , 50℃水浴浸泡 8h。接挥发油测定器 ,电热套加热。微沸开始
计时 12h回流。冷却后 , 收集测定管中水层并用 1∶1(V∶V)乙
醚萃取 3次。测定器用乙醚洗涤两次并收集 , 油层另外收集。乙
醚萃取液加入无水硫酸钠干燥过夜 ,过滤。挥掉乙醚后所得物合
并油层得鸡矢藤挥发油。
2.2 HepG2.2.15细胞分泌 HBsAg、HBeAg规律试验 将 HepG
2.2.15细胞按照 1×105 /ml接种于 24孔板上 , 设置 6个平行孔 ,
每孔加含有 G418的培养基 1ml,另设置 6个平行孔 , 每孔加不含
有 G418的培养基 1 ml。每天换一次培养液并收集上清储存于
-20℃, 共 6 d。 用 ELISA法检测 HepG2.2.15 细胞 HBsAg、
HBeAg的分泌量 , 以 P/N值 >2.1为阳性。同法重复试验并检测
共 3次。
2.3 MTT法检测鸡矢藤挥发油对 HepG2.2.15细胞毒性试验
以高糖 DMEM、青霉素 、链霉素 、15%胎牛血清 、G418浓度为 380
mg/L的条件培养 HepG2.2.15细胞并传代。用含有 1%DMSO(V
∶V)的培养基 10 ml溶解 50 mg鸡矢藤挥发油 , 配制成浓度为
5g/L的储备液 , 4℃下保存。 用时取出用培养基稀释成 2 000,
1 000, 500, 250, 125, 62, 31, 15 mg/L等 8个浓度梯度。将处于对
数生长期的 HepG2.2.15细胞以 1×105 /ml接种于 96孔板 ,细胞
贴壁后更换含有不同浓度挥发油的培养基 100 μl。并设置只用
含 1%DMSO培养基培养的对照孔 , 含 1%DMSO培养基而无细胞
的空白孔 ,每组均设定 6个平行孔。继续分别培养 24, 48, 72 h
后吸尽培养液 ,每孔更换为含有 0.5 g/L的 MTT培养液 100 μl,
37℃下培养 4h后吸尽培养液 , 每孔加入 100 μlDMSO, 孵育 20
min,充分振荡溶解结晶紫。然后在 490 nm波长与 570 nm参考
波长下测定各孔的 OD值 , 根据各孔 OD值求出挥发油对 HepG
2.2.15细胞的抑制率 , 并通过 Reed-Muench法求出鸡矢藤挥发
油的(半数中毒浓度)TC
50
。并通过 CPE法镜检下确定鸡矢藤挥
发油对 HepG2.2.15细胞的(最大无毒浓度)TC0。
细胞抑制百分率(%)=1-给药组 OD-空白组 OD对照组 OD-空白组 OD×100%
(n=6)
Reed-Muench公式:TC50 =Antilog(B+50-BA-B×C)
(A=log>50%抑制的药物浓度 , B=log<50%抑制的药物
浓度 , C=log稀释倍数)
CPE细胞病变法 ,是以正常细胞无自然蜕变 , 不引起细胞病
变的药物最低浓度作为细胞的最大无毒浓度(TC0)。见表 1。
表 1 CPE细胞病变程度对照
表示方法 镜检观察 频度
-～ ± 无明显病变 0度
±～ + 0 ～ 25%细胞病变 1度
+～ ++ 25% ～ 50%细胞病变 2度
++～ +++ 50% ～ 70%细胞病变 3度
+++以上 70%以上细胞病变 4度
2.4 鸡矢藤挥发油对 HepG2.2.15细胞 HBsAg、HBeAg分泌的
影响 根据对 HepG2.2.15细胞毒性试验的结果 , 以挥发油最大
无毒浓度作为上限 ,选择最大无毒浓度倍比稀释成 6个浓度梯度
为:500, 250, 125, 62, 31, 15mg/L。将 HepG2.2.15细胞接种于 96
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孔板 , 每孔 100 μl, 1天后更换含有不同浓度的培养液 ,每个浓度
设置 6个平行孔。 48 h后 ,收集上清液于 -20℃保存 , 用 HBsAg、
HBeAg试剂盒检测不同浓度药物对 HBsAg、HBeAg的抑制率。
试验按照同样的方法重复 3次。
HBsAg、HBeAg抑制率(%)=(空白 P/N-药物 P/N)/(空
白 P/N)×100%
(P/N:)
治疗指数 TI=TC50 /IC50(TI>2,属于有效低毒效果;1
2.5 统计学处理 用 SPSS11.5软件包进行统计学处理 , 数据以
x±s表示 ,进行方差分析和 t检验 , P<0.05被认为有显著差异。
3 结果
3.1 鸡矢藤挥发油提取 经过水蒸气法得到半固体状有特殊气
味的褐黄色鸡矢藤挥发油 0.23g, 得率为 0.23%。
3.2 HepG2.2.15细胞分泌 HBsAg、HBeAg规律 结果显示 , 经过
380 mg/LG418筛选过的 HepG2.2.15细胞培养 1 d后即开始分泌
HBsAg、HBeAg,通过试剂盒检测 ,不含 G418组 1 ～ 6d的 HBsAg分
泌水平均处于阳性。 5 d后基本上达到高峰水平, 含有 G418组 1
～ 2d内 HBsAg分泌为阴性 , 但接近阳性。 2 d后呈阳性, 且分泌
量随着培养时间的延长而增加。 HBeAg分泌量无论是含有 G418
组还是不含 G418组 ,均表现为高表达。结果见表 1。
表 1 不同天数 HepG2.2.15细胞对 HBsAg、HBeAg的分泌量( x±s)
时间
t/d
无 G418组
HBsAg(P/N) HBeAg(P/N)
有 G418组
HBsAg(P/N) HBeAg(P/N)
1 2.59±0.07 11.51±0.07 1.97±0.05 12.59±0.02
2 2.52±0.09 32.95±0.20 2.05±0.03 33.95±0.08
3 2.58±0.05 47.83±0.30 2.37±0.03 58.24±0.25
4 2.71±0.05 60.87±0.25 2.97±0.06 69.64±0.18
5 3.14±0.05 67.03±0.35 3.45±0.05 75.25±0.27
6 3.62±0.06 75.56±0.26 4.25±0.08 76.74±0.32
n=6
3.3 鸡矢藤挥发油细胞毒性实验 结果显示 , 鸡矢藤挥发油对
HepG2.2.15细胞在较高浓度 500 mg/L以上时有毒性抑制作用 ,
而在 15～ 500mg/L浓度内 ,细胞镜检查下无明显病变 , 表现出一
定的安全性。根据 CPE检测鸡矢藤挥发油的最大无毒浓度 TC0
为 500 mg/L。根据 Reed-Muench公式计算出鸡矢藤挥发油对
HepG2.2.15细胞半数致死浓度 TC50为 1 550 mg/L。结果见表 2
及图 1。
表 2 鸡矢藤挥发油对 HepG2.2.15细胞的毒性( x±s)
挥发油浓度
C/mg· L-1
不同时间的抑制率(%)
24h 48h 72 h 均数 CPE
15 1.04±0.04 2.88±0.12 3.35±0.15 2.42 -
31 4.43±0.21 6.39±0.32 8.79±0.42 6.54 -
62 6.53±0.33 8.05±0.36 10.72±0.51 8.43 -
125 10.32±0.46 12.33±0.51 15.62±0.71 12.76 -
250 13.22±0.61 16.73±0.82 19.44±0.92 16.46 -
500 18.66±0.89 22.69±1.14 30.89±1.45 24.08 ±
1 000 25.31±1.22 32.51±1.56 46.89±2.15 34.91 +
2 000 48.04±2.17 55.97±2.65 62.48±2.48 55.49 ++
3.4 鸡矢藤挥发油对 HepG2.2.15细胞 HBsAg、HBeAg分泌的
抑制 结果见表 3所示 ,鸡矢藤挥发油在最大无毒浓度范围内对
HBsAg的分泌有较好的抑制作用 , 并呈现一定的剂量依赖关系。
在最大无毒浓度下 , HBsAg抑制率达到了 72.49%, HBeAg的抑
制率达到了 23.64%, HBsAg的抑制高于 HBeAg的抑制(见
图 2), 经 Reed-Muench公式计算 , HBsAg抑制的半数有效浓度
IC50为 230 mg/L。鸡矢藤挥发油对 HBsAg的治疗指数为 6.74。
图 1 鸡矢藤挥发油对 HepG2.2.15细胞的抑制曲线
表 3 鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞
分泌HBsAg、HBeAg的抑制率( x±s)
挥发油浓度
C/mg· L-1 HBsAg(%) HBeAg(%)
15 12.15±0.52 4.96±0.15
31 21.28±0.84 8.57±0.39
62 33.12±1.34 12.53±0.53
125 43.84±1.92 14.66±0.63
250 54.38±2.33 18.92±0.85
500 72.49±2.98 23.64±1.02
图 2 鸡矢藤挥发油对HepG2.2.15细胞分泌 HBsAg、HBeAg的抑制曲线
4 讨论
HepG2.2.15细胞是转染了 HBVDNA的 HepG2细胞 , 它能
够长期稳定地在培养液上清中分泌 HBsAg、HBeAg和 HBV颗
粒 [ 5] 。近年来 , 国内外学者多利用此细胞株进行体外抗乙肝病
毒药物的筛选 ,并对其实际意义进行研究。从实验结果来看 , 该
细胞株培养一天以后便可以检测到 HBeAg、HBsAg的分泌 , 与报
道一致 [ 6] , 细胞分泌 HBeAg的浓度较 HBsAg高。往往需要培养
2 d左右 HBsAg浓度才能达到一个较好的筛选浓度 , 根据有无添
加 G418的实验证明 , G418对 HepG2.2.15细胞增殖有一定的抑
制作用 ,是 HepG2.2.15细胞株增殖缓慢原因之一 。而经过 G418
阳性筛选过的细胞株在药物筛选实验中即使不添加 G418培养
一样高效率分泌 HBeAg、HBsAg,并且生长速率要高于含有 G418
培养组 ,因此作为一次性使用时的药物筛选细胞 , 添加无 G418
培养基培养效果更好 ,缩短了细胞培养的时间。
挥发油作为一种脂溶性物质 ,往往需要添加助溶剂来分散在
培养液中 ,曾见报道用 5%吐温 80作为助溶剂 [ 7] , 但经过本课题
组的验证 , 0.05% ～ 1%的吐温 80均对 HepG2.2.15细胞有强烈
的毒性作用 ,而 1%的 DMSO对细胞无明显影响。因此采用 1%
DMSO作为鸡矢藤挥发油的助溶剂。
鸡矢藤挥发油中含有硫成分 [ 8 ～ 10] , 是其特殊气味的主要来
源。而从相对含量来看 ,鸡矢藤挥发油的主要成分为乙酸异戊酯
(20.21%)、乙酸苯甲酯 (8.04%)、十五碳酸乙酯(6.79%)、软
脂酸(6.78%)、癸酸异戊酯(5.72%);另外还有樟脑 、乙酸龙脑
酯 、丁香酚等有药理作用的成分 [ 11] 。实验结果表明 , 鸡矢藤挥发
油对于 HepG2.2.15细胞的毒性较低 ,通过 CPE法镜检确定最大
无毒浓度为 500 mg/L。在此浓度范围以内 , 鸡矢藤挥发油对
HepG2.2.15细胞的 HBsAg、HBeAg分泌具有较好的抑制作用 , 并
有良好的量效关系。 HBsAg的抑制率远高于 HBeAg的抑制率可
能与 HepG2.2.15细胞高分泌 HBeAg, 较低分泌 HBsAg量有关。
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由于利用细胞株进行药物的体外筛选存在着一定的局限性 , 因
此 , 对于上述的实验结果 ,有待进一步进行体内的实验加以验证。
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收稿日期:2009-11-16; 修订日期:2010-06-22
基金项目:江西省自然科学基金(No.2008GZY0115);
江西省教育厅项目(No.GJJ09544)
作者简介:刘丽丽(1985-),女(汉族),江西九江人 ,现为江西中医学院药
学院在读硕士研究生 ,主要从事中药复方配伍药代动力学研究工作.
＊通讯作者简介:陈丽华(1972-), 女(汉族),江西崇仁人 , 现为江西中医
学院现代中药制剂教育部重点实验室副教授 ,博士学位 , 主要从事中药新
剂型与新技术及药代动力学研究工作.
中药生物碱类化合物药动学研究现状与思考
刘丽丽1 ,刘小寒 2 ,陈丽华1＊ ,朱卫丰 1 ,许可敏3 ,衣文娇 1 ,赵 益 1
(1.现代中药制剂教育部重点实验室·江西中医学院 ,江西 南昌 330004;
2.江西省九江市武宁县妇幼保健院 332300;
3.江苏省无锡市纽迪希亚制药有限公司 214101)
摘要:对近年来国内外关于中药生物碱类化合物药动学研究的文献进行检索 、整理分析和归纳总结 , 介绍其在体内的测
定方法 、及生物碱单体 、有效部位及复方的药动学研究情况 , 同时指出了今后生物碱类化合物药动学研究中需要关注的
问题。
关键词:生物碱; 分析方法; 药动学
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.015
中图分类号:R2-03 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2010)11-2756-03
AdvancesinStudiesonPharmacokineticsofAlkaloidsofChineseMateriaMedica
LIULi-li1 , LIUXiao-han2 , CHENLi-hua1＊ , ZHUWei-feng1 , XUKe-min3 , YIWen-jiao1 , ZHAOYi1
(JiangxiColegeofTraditionalChineseMedicine, KeyLaboratoryofModernPreparationofTraditionalChinese
Medicine, MinistryofEducation, Nanchang, 330004, China)
Abstract:Toretrieve, analyzeandsummarizetheliteraturesonthepharmacokineticstudyofalkaloidcompoundsathomeanda-
broadinrecentyearsandtointroducetheanalyticalmethodinvivo, theprocessesofthepharmacokineticsofactivealkaloids, ex-
tractandprescription.Atthesametimetheproblemwhichneedstopayatentiontoforthefuturepharmacokineticstudiesoralka-
loidcompoundswaspointedout.
Keywords:Alkaloid; Analyticalmethod; Pharmacokinetic
生物碱广泛存在于植物界中 , 如麻黄 、贝母 、黄连 、乌头等都
主要含有生物碱成分 , 在临床上已有很多应用。生物碱结构多
样 , 实验证明其具有广泛的生理和药理活性 , 包括抗菌消炎 、止咳
平喘 , 抗疟 、抗心律失常 、抗癌等 , 因此对该类化合物的研究已成
为国内外医药界研究的热门课题。近年来 ,随着灵敏度高 、特异
性强检测技术的发展 ,生物碱类化合物的药动学过程得到进一步
的揭示 , 为生物碱类药物的筛选和临床应用提供了数据。现将近
年来生物碱类化合物药动学研究进展综述如下。
1 生物样品分析方法
在生物碱类化合物的药动学研究中 ,要对生物样品中生物碱
及其代谢产物进行定量分析。 首先应该重视生物分析方法的确
证 , 符合生物分析方法确证的指导原则 [ 1] 。目前最普遍的方法
是高效液相色谱法 , 由于生物样品(包括血浆 、尿 、唾液等)含有
大量的内源性物质 ,必须对样品进行适当预处理。
1.1 生物样品前处理方法 生物样品测定前须进行样品预处理 ,
预处理是进行分析测定过程的重要环节。通过预处理可以达到
以下目的:①多数生物样品必须经过均匀化处理后才能测定;②
排除内源性杂质和代谢物的干扰;③浓缩被测组份以满足仪器检
测灵敏度的要求;④对呈结合状态的药物进行水解处理。
目前最常用的有液 -液萃取和液 -固萃取 ,后者又称为固相
萃取(solidphaseextraction, SPE)。比较简单的处理方法是将生
物样品碱化后用甲醇 、乙醇 、乙腈等常见的蛋白沉淀试剂沉淀蛋
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