全 文 ：书药理药化
收稿日期:2011-03-04; 修订日期:2012-03-12
基金项目:广西壮族自治区教育厅自然科学基金(No． 200911MS28)
作者简介:黄权芳(1973-) ，女(壮族) ，广西南宁人，现任广西中医学院第
一附属医院主管中药师，主要从事中药鉴定及开发研究工作．
* 通讯作者简介:林 兴(1975-)，男(壮族)，广西南宁人，现任广西医科大
学副教授，硕士学位，主要从事肝炎、肝纤维化靶向诊断和治疗研究工作．
山芝麻含药血清对 HepG2． 2． 15 细胞
HBV复制的抑制作用
黄权芳1，韦 刚2，杨 辉2，林 兴3* ，张士军3，黄仁彬3
(1．广西中医学院第一附属医院，广西 南宁 530023;
2．广西分析测试研究中心，广西 南宁 530022; 3．广西医科大学，广西 南宁 530021)
摘要:目的 观察山芝麻体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法 采用血清药理学方法，在 HBV的体外细胞培养系统
中(2． 2． 15 细胞)进行山芝麻抗 HBV 作用观察。结果 山芝麻含药血清在 HepG2． 2． 15 细胞培养中可有效地抑制细胞
HBV DNA的复制，其作用呈明显的量效和时效反应关系。结论 山芝麻在体外能明显抑制 HBV。
关键词:山芝麻; 乙型肝炎病毒; HepG2． 2． 15 细胞
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 07． 128
中图分类号:R962 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)07-封 3-02
The Inhibitory Effect of the Serum Containing Helicteres angustifolia on HBV DNA in the
HepG2． 2． 15 Cells
HUANG Quan-fang1，WEI Gang2，YANG Hui2，LIN Xing2，ZHANG Shi-jun3，HUANG Ren-bin3
(1． The First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University，Nanning，530023，China;
2． Guangxi Center for Analysis and Test Research，Nanning 530022，China;3． Guangxi Medical University，Nan-
ning 530021，China)
Abstract:Objective To study anti － HBV activity of Helicteres angustifolia in vitro．Methods The HBV in vitro cell culture sys-
tem(HepG2． 2． 15 cell)was used for examining the anti － HBV activity of Helicteres angustifolia with Serum － pharmacology． Re-
sults The serum containing Helicteres angustifolia could decrease the HBV DNA level in HepG2． 2． 15 cell，and its inhibitory
effects were dose － and time － dependent． Conclusion Helicteres angustifolia can inhibit HBV DNA in vitro significantly．
Key words:Helicteres angustifolia; HBV; HepG2． 2． 15 cell
慢性乙型肝炎(慢肝)迁延难愈，目前现代医学尚无良策，其
中医药治疗已成为世界研究的热点［1］。本课题组多年来一直致
力于发掘广西特色中草药用于抗乙型肝炎的研究，我们首次成功
建立了广西麻鸭乙肝动物模型，实验证实该品种麻鸭易感染，其
病程较规律，病毒血症持续时间较长且较稳定，无明显的自然转
阴现象，保证了模型的稳定性和可靠性，并先后利用该模型开展
了大量的抗乙肝中药的筛查研究工作［2 ～ 4］。此外，体外细胞模型
因其实验周期较短，试剂用量少等优点，而被广泛用于药物的高
通量初筛，我们前期利用 HepG2． 2． 15 细胞模型筛查了几十种广
西民族习用抗乙肝草药［5 ～ 7］，山芝麻即是我们目前系列研究的民
族药之一，前期实验尚发现山芝麻能保护 CCl4 所致小鼠肝损伤，
具有显著的抗脂质过氧化作用［8］，为我们进一步研究其是否具
有抗乙肝病毒作用奠定了前期研究基础。
山芝麻系梧桐科植物山芝麻 Helicteres angustifolia L．的根，能
清热解毒，主要用于感冒发热、肺热咳嗽、咽喉肿痛、麻疹等。至
今，对山芝麻公开报道的研究主要集中在其化学成分的分离、鉴
定方面，其药效学研究很少。本研究以 HepG2． 2． 15 细胞模型，
探讨山芝麻对乙型肝炎病毒的影响，首次评价山芝麻对乙型肝炎
病毒 DNA的抑制作用。
1 材料
1． 1 动物 Wistar大鼠，雌雄各半，体质量(250 ± 10)g，实验动物
使用许可证号:SYKG 桂 2003 － 0005;实验动物生产许可证号:
SCXKG桂 2003 － 0003;由广西医科大学实验动物中心提供。
1． 2 细胞株 HepG2． 2． 15 细胞株(北京医科大学第一附属医院
病毒研究所) ，本室自行传代，定期用 G418 筛选。
1． 3 药品与试剂 山芝麻，经广西中医学院第一附属医院药学部
黄权芳中药师鉴定为梧桐科植物山芝麻 H． angustifolia L．的根，
其水提物由广西医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中
心自行提取。阿昔洛韦(Aciclovir，ACV 湖南迪诺制药有限公司
医药工业研究所产品，批号:20070518) ;RPMI1640 培养基(美国
Gibco公司，Cat №21202 － 016) ;胎牛血清(美国 Gibco 公司，Cat
№ 21607 － 042) ;G418(美国 Sigma公司，Cat№228527 － 72) ;HBV
DNA荧光定量 PCR试剂盒(深圳匹基生物工程股份有限公司，
批号:20070613)。
1． 4 仪器与设备 iCycler FQ 实时荧光定量 PCR 仪(美国 Bio －
Rad公司) ;CO2 孵箱(美国 Thermo Forma公司，Model311)。
2 方法
2． 1 山芝麻含药血清的制备 3 月龄 Wistar 大鼠 50 只，随机分
为 5 组，每组 10 只。①空白对照组:等量的生理盐水;②阳性对
照组:ACV 0． 1 mg·(kg·d)－ 1;③山芝麻 H 组:10 g·(kg·
d)－ 1;④山芝麻 M组:5 g·(kg·d)－ 1;⑤山芝麻 L 组:2． 5 g·
(kg·d)－ 1。各组动物在同样条件下饲养，均以每日 2 次，早晚各
1 次空腹灌胃，连续给药 7 d。于末次灌胃(灌胃前禁食不禁水
12h)后 2 h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并
将每组动物的血清混合。经 56℃ 30min 灭活处理，经 0． 45 μm
的微孔滤膜，再经 0． 22 μm微孔滤膜过滤除菌后，置 － 20℃冰箱
保存备用。
2． 2 HBV DNA的荧光定量 PCR(FQ － PCR)法检测［5］ 取 HepG
2． 2． 15 细胞 1 瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整
细胞浓度至 2 × 104cell·ml －1，加入 24 孔细胞培养板，每孔 900
μl，置 CO2 孵箱(37℃，5%CO2)中培养 24 h 后，分别加入各组含
药血清 100 μl，每个浓度 3 个复孔。以等量的完全培养液为空白
对照。连续培养 72 h后，分别吸出上清液于 1． 5 ml 灭菌 Eppen-
dor管中，－ 20℃保存，统一待检。再次加入上述含药血清的培
养液继续培养 72 h后，分别吸出上清液于 1． 5 ml灭菌 Eppendorf
管中，－ 20℃保存，统一待检。
按试剂盒方法提取样品 HBV DNA。HBV DNA 定量标准品
由深圳匹某公司直接提供。各反应管放入 FQ － PCR 仪，按以下
条件进行扩增:94℃预变性 1min，95℃变性 5 s，60℃退火、延伸
20 s。共反应 42 个循环。扩增过程及荧光信号检查、数据的储
存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成。
2． 3 统计学处理 采用 SPSS10． 0 统计软件分析数据，组间比较
采用方差分析，各均数两两比较。
3 结果
与空白对照组比较，给含药血清培养 72 h 时，山芝麻 3 个剂
量组 HepG2． 2． 15 细胞上清液中 HBV DNA的拷贝数显著降低(P
＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ;培养 144 h 时，山芝麻高、中剂量组 HBV
DNA水平明显降低(P ＜ 0． 05) ，而低剂量组 HBV DNA 水平变化
不明显。比较 72 h和 144 h的抑制率，山芝麻各剂量组对细胞的
抑制作用均有随着时间的延续抑制率越高的趋势。综合分析
HBV DNA 拷贝数和抑制率数据，144h 山芝麻各剂量组 HBV
DNA水平与空白对照组比较，其统计学差异没有比 72h 显著，究
其原因可能是例数较少，而标准差较大的缘故。总体上看，山芝
麻对 HBV DNA具有显著的抑制作用，并且随着药物浓度和作用
时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效
反应关系。见表 1。
表 1 山芝麻含药血清对 HepG2． 2． 15 细胞
HBV DNA的抑制作用(珋x ± s)
组别
HBV DNA
72 h拷贝数 抑制率(%)
HBV DNA
144 h拷贝数 抑制率(%)
空白对照 7． 13 ± 0． 69 － 28． 03 ± 6． 11 －
ACV 3． 24 ± 0． 55＊＊ 54． 6 7． 93 ± 2． 28＊＊ 71． 7
山芝麻L 5． 39 ± 0． 78* 24． 4 20． 15 ± 4． 96 28． 1
山芝麻M 4． 27 ± 0． 53＊＊ 40． 1 15． 43 ± 3． 68* 45． 0
山芝麻H 3． 38 ± 0． 42＊＊ 52． 6 10． 83 ± 3． 87* 61． 4
与空白对照组比较:* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 3
4 讨论
HepG2． 2． 15 细胞模型是 Sells等人在 1987 年将克隆的 2 个
头尾相连的 HBV DNA全基因及抗 G418 质粒直接导入受体细胞
－人肝癌细胞株 HepG2 细胞构建而成。该细胞不仅支持 HBV
DNA的复制，且支持 Dane 样颗粒的包装与分泌。目前，该细胞
模型已被国内外学者公认且广泛用于抗 HBV药物筛选和评价等
研究，现已成为申报抗 HBV新药必须做的体外实验模型［6］。
本实验采用了快速、准确的实时 FQ － PCR 技术，FQ － PCR
在常规 PCR的基础上，添加了一条与待扩增的靶序列互补并且
标记了 2 个荧光基团标记的一段 TaqMan 探针，该探针只与模板
特异性地结合。该方法精确、灵敏、重复性好、污染少，是目前国
际公认的核酸分子定量定性检测标准方法，广泛用于药物疗效考
核和病原体检测等领域。本实验采用实时荧光定量 PCR 法检测
山芝麻在作用 HepG2． 2． 15 细胞 72h 和 144 后上清液中 HBV
DNA的含量。结果表明，山芝麻在作用 HepG2． 2． 15 细胞 72h和
144 后，均可使细胞上清液中 HBV DNA 的拷贝数降低，对 HBV
DNA具有明显的抑制作用，即在病毒复制水平抑制了 HBV 的合
成。且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，
呈现一个明显的量效和时效反应关系。这说明该药可抑制
HepG2． 2． 15 细胞上清液中 HBV DNA 的复制，提示山芝麻在体
外具有直接抗 HBV作用，为高效低毒的抗 HBV药物。山芝麻究
竟作用于病毒复制过程的哪一环节有待进一步研究证实。
参考文献:
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