全 文 ：三叶青黄酮对H22荷瘤小鼠
TIMP-2mRNA表达的影响＊
倪克锋　金　波1　蒋福升1　黄　挺　冯正权2 　林胜友2　吴良村2　黄　伶
(浙江省杭州市中医院·杭州 310007　1浙江中医药大学·杭州 310053　2浙江省中医院·杭州 310006)
摘　要　目的:观察三叶青总黄酮对H22荷瘤小鼠瘤体的抑制作用 , 并探讨其作用机理。方法:小鼠肝癌
H22细胞右前肢腋窝皮下接种 ,观察低 、中 、高剂量三叶青黄酮对荷瘤小鼠抑瘤率 、脾脏指数 、胸腺指数的
影响 ,并通过定量 RT-PCR 检测小鼠皮下移植瘤基质金属蛋白酶抑制酶-2(TIMP-2)的表达情况。结
果:低 、中 、高剂量三叶青黄酮对 H22荷瘤小鼠的肿瘤抑制率分别为 34.28%、32.56%和 29.24%;皮下移植
瘤 TIMP-2 mRNA的表达低剂量组明显高于模型组(P <0.05)。结论:三叶青黄酮可显著抑制肿瘤细胞
生长 ,这一作用与其上调肿瘤细胞TIMP-2基因的表达相关。
主题词　　肿瘤 中医药疗法　三叶青黄酮 治疗应用　基质金属蛋白酶抑制酶-2　基因表达　小鼠
＊浙江省中医管理局资助项目 No.2006C104.
　　三叶青(tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)属葡萄科崖
爬藤属植物 ,为浙江省主要药源植物。 具有清热解毒 、祛风
化痰 、活血止痛的功效[ 1] 。 临床多用于治疗小儿高热惊厥 、
肺炎等症 ,现常用来防治各类肿瘤。但目前既没有理化研
究 ,也没有质量标准。笔者前期对三叶青的成分进行提取分
离和鉴定分析 ,发现三叶青富含黄酮。为探讨三叶青抗肿瘤
作用的机制及有效部位 ,本实验研究了三叶青黄酮对 H22荷
瘤小鼠的抑制作用 ,并探讨其作用机理。
1　实验材料和方法
1.1　三叶青黄酮的提取和鉴定　三叶青购自杭州市中医院
中药房。取三叶青 3000g采用 5%氢氧化钠稀乙醇浸泡 5 小
时 ,连续浸提 3 次。浸提液加入稀盐酸酸化 , 得沉淀为三叶
青提取物 22.7g , 聚酰胺柱色谱分离黄酮类化合物 , 放置于
4℃冰箱保存备用。取少许提取物经盐酸-镁粉反应 、薄层
层析 、三氯化铝反应等鉴定分析呈黄酮类物质的显色反应。
1.2　细胞株及实验动物　小鼠肝癌H22细胞株:由浙江中医
药大学分子研究所提供 。昆明种小鼠 , 雄性(清洁级), 体重
(20±2)g , 购于浙江中医药大学实验动物中心 , 基础饲料喂
养及造模取材均在浙江中医药大学实验动物中心完成。
1.3　动物分组　健康雄性昆明种小鼠 40只 , 体重(20±2)g ,
称重后分组 、编号 ,随机分成 4组 , 每组 10 只。模型组 、三叶
青低剂量组 、三叶青中剂量组 、三叶青高剂量组。
1.4　动物造模　取小鼠肝癌 H22细胞株腹腔内接种 8 天的
种鼠 ,无菌条件下用 5ml注射器抽吸出 1 ～ 2ml牛奶状 、较黏
稠的腹水 ,先用 0.4%苔盼蓝染色 ,计数活细胞率>90%, 再
用白细胞稀释液计数瘤细胞数 , 然后以灭菌 D-Hanks 液稀
释调整肿瘤细胞浓度为 1×107 个 ml。小鼠右前肢腋窝皮下
接种 ,每只 0.1ml。
1.5　给药　将三叶青总黄酮用无菌蒸馏水溶解 , 稀释至所
需浓度(50mg·ml-1 , 100mg·ml-1 , 300mg·ml-1),于小鼠瘤细胞
接种后 24 小时开始每天灌胃给药 ,每只 0.3ml(模型组给予
等体积的 D-Hanks液)连续给药 12天。
1.6　指标测定
1.6.1　小鼠体重变化　在注射药物的第 1 天开始每隔一天
于给药前称取小鼠体重 , 同时观察小鼠活动进食情况。
1.6.2　肿瘤抑制率 、胸腺指数和脾指数　全部小鼠于最后
一次给药后 24小时 , 颈椎脱臼法处死 , 解剖称取瘤重 , 同时
记录胸腺及脾重。计算肿瘤抑制率 、胸腺指数和脾指数。肿
瘤抑制率(TGS)=[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对
照组平均瘤重] ×100%;胸腺指数=胸腺重(mg)/ 10g体重;
脾指数=脾重(mg)/10g 体重。
1.6.3　TIMP-2mRNA表达的测定　RT-PCR 检测。 取保
存在液氮中的瘤组织 , 分别以Trizol试剂提取总RNA ,具体操
作严格按试剂盒说明进行。提取后以紫外光分光光度计测
定其纯度并定量 , 在 1%的甲醛变性凝胶上电泳验证 RNA完
整性。逆转录以 AMV 逆转录酶提供的体系为标准 ,在 PCR
管中配制逆转录反应液 , 轻轻混匀 ,室温放置 10分钟后移入
42℃恒温槽中。 42℃保温 1 小时进行逆转录反应。反应结
束后在冰水中冷却 2 分钟。所得到的反应液即可用于 PCR
反应。取上述的逆转录产物 5μl作为 PCR反应的模板 , 在
PCR管中配制反应液 , 加入事先设计的目的基因 TIMP-2的
预测引物 , 并以 β-actin 基因作为内参进行 PCR 反应 , 反应
体系为 50μl。扩增条件:94℃预变性 5 分钟后 , 94℃30 秒 、
55.5℃50秒 、72℃1 分钟 ,反应 30 个循环 , 最后一轮 72℃延
伸 5分钟 , 4℃保存。扩增产物取 5μl在 1%琼脂糖凝胶(含
EB 0.5 ng/ml)上电泳 , 紫外灯下观察结果并照相 , 吸光度扫
描仪扫描 PCR条带后用软件进行定量分析 , 每一个基因的
表达量用 β-actin内参进行标准化 , 结果为基因表达量与 β
-actin内参的比值 , 以上结果重复 3 次 ,取平均值。
·195·中国中医药科技 2009年 5 月第 16卷第 3 期 May 2009 Vol.16 No.3
1.7　统计学处理　采用 SPSS 11.0软件分析 ,不同药物浓度
组间的比较采用完全随机设计的方差分析 ,各药物浓度组与
对照组的比较采用 Dunnett t检验。
2　结果　见表 1。
表 1 各组小鼠观察指标的检测(x±s , n=10)
组别
　体重
　(g)
　瘤重
　(g)
抑瘤率
(%)
　脾脏指数
　(mg 10g)
胸腺指数
(mg 10g)
TIMP-2
模型组 27.31±4.62 0.81±0.19 85.34±12.20 17.40±9.30 0.37±0.372
低剂量 24.81±3.02 0.54±0.15＊＊34.28 105.87±36.43＊ 21.07±7.60 1.16±0.119＊
中剂量 25.38±3.20 0.55±0.10＊ 32.56 87.55±10.04 14.42±5.53 0.42±0.159
高剂量 25.09±3.69 0.58±0.14＊ 29.24 80.68±10.13 18.14±4.94 0.49±0.107
　　与模型组比＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
3　讨论
笔者前期研究发现三叶青块根中醇提乙酸乙酯萃取物
含量高 , 经鉴定分析主要作用物质为黄酮 , 体外实验发现三
叶青黄酮对体外培养的肿瘤细胞有较强的抑制作用[2] 。
肿瘤的生成 、生长和侵袭包括一个复杂的过程。值得一
提的是 ,肿瘤生长直径超过 2mm 就必须有新生血管的形成。
近来肿瘤的治疗已将转移和血管生成作为新的靶点 ,而肿瘤
血管的生成需要细胞外基质与肿瘤细胞间的相互作用。基
质金属蛋白酶(MMPs)涉及降解细胞外基质(明胶酶 、胶原酶
等一类酶的总称), 也是肿瘤血管生成和转移的关键因素。
MMPs受内源性基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的调控 ,
后者包括 TIMP-1 , 2 , 3 , 4。 TIMPs 和 MMPs 的失衡可引起细
胞外基质的过度降解 , 导致血管生成 、肿瘤细胞生长和侵
袭[ 3] 。调控某一关键 TIMPs 可以防止肿瘤新生血管的形成 、
肿瘤细胞的生长和侵袭。 Ⅳ型胶原酶尤其是MMP-2 与肿
瘤的关系最为密切 ,因为Ⅳ型胶原酶不但可以酶解细胞间基
质成分 ,还能酶解基底膜的主要成分-Ⅳ型胶原[ 4] , 大多数
肿瘤细胞和临近基质细胞均有MMP-2 表达[ 5 , 6] 。 Grigioni等
发现胃癌组织低 TIMP-2 表达的病人预后较差。进一步证
实肿瘤组织中 TIMP-2 水平与肿瘤及其预后的相关性。因
此 ,笔者选择 TIMP-2 为指标 , 对三叶青黄酮的体内抗肿瘤
作用及机理进行研究 , 并初步观察了其对 H22荷瘤小鼠的抑
瘤作用及免疫器官的影响。
本实验结果表明三叶青黄酮具有明显的抗肿瘤作用 ,其
作用并不呈剂量依赖性 , 综合分析低剂量的作用要优于高剂
量。低剂量三叶青黄酮可增加荷瘤小鼠脾脏和胸腺指数 ,对
脾脏指数的作用有统计学意义 , 说明低剂量对免疫系统有影
响。低剂量组可明显上调瘤组织内 TIMP-2 mRNA 表达 ,
中 、高剂量组虽有上调 ,但统计学分析无显著差异 , 提示三叶
青黄酮的抗肿瘤作用机制与上调 TIMP-2mRNA 的表达有
关。
　　参考文献
1　中国医学科学院药物研究所 ,北京医学院 , 南京药学院 ,等.中药
志.第 2册 ,北京:人民出版社 , 1984:219.
2　冯正权 ,倪克锋 ,何煜.三叶青黄酮诱导 SGC-7901胃癌细胞凋亡
的实验研究 ,中国临床药理学与治疗学 ,2006 , 6(6):75.
3　Stevenson WG , Hewitt R , Corcoran M.Matrix metalloproteinase and tu-
mor invasion:from correlation and causality to the clinic.Semin Cancer
Biol , 1996 , 7:147.
4　Matrisian LM.The matrix - degrading metalloproteinase.Bioessays ,
1992 , 14:455.
5　Imanishi Y , Fujii M , Tokumaru Y , et al.Clinic significance of expres-
sion of membrance type matrixmetalloproteinase andmatrix metalloprotein-
as-2 in human head amd neck squamous cell carcinoma.Hum Pathol ,
2000 , 31:895.
6　陈培丰 ,刘鲁明 ,陈震 ,等.参三七醇提液抑制肿瘤肝转移作用机
理的实验研究.中国中医药科技 , 2007 ,14(2):96.
(收稿:2008-12-15)
自拟祛银方治疗银屑病 50例
李　黎　(黑龙江省医院·哈尔滨 150001)
1　临床资料　50例均系门诊患者 ,其中男 24例 ,女 26例;年龄 11～
60岁;病程最短 7天 ,最长 20余年;寻常型 45例 , 红皮病型 3 例 ,脓
疱型 2例 ,关节病型 2例。排除妊娠 、哺乳期妇女及患有严重心肝肾
和内分泌系统疾病者。诊断参照《临床疾病诊断依据治愈好转标
准》和《中医病证诊断疗效标准》 。
2　治疗方法　所有患者均采用祛银方治疗 , 药物组成:荆芥 15g 、防
风 15g、羌活 15g 、独活 15g 、威灵仙 20g 、当归 15g、土茯苓 40g 、槐花
30g 、山豆根 30g、蜈蚣 2条 、紫草 30g 、乌梅 30g。血热甚皮损鲜红者加
茅根;风盛痒甚 、鳞屑较多者加乌梢蛇 、白僵蚕;风湿阻络 、关节痹痛
者加秦艽 、白鲜皮;血燥伤阴 、皮损干燥呈大斑块者加丹参 、女贞子;
扁桃腺肿大者加山豆根。每日 1剂 ,水煎 ,早晚分服。 4周为 1个疗
程 ,治疗 1～ 3个疗程。患者 1周复诊 1次。服药期间不再服用其他
治疗银屑病的药物。
3　结果
3.1　疗效标准　痊愈:皮损基本消退 , PASI 评分≥95%。显效:皮损
大部分消退 , 60%≤PASI 评分<95%。好转:皮损部分消退 , 30%≤
PASI 评分<60%。无效:治疗后皮损无明显消退或继续发展 , PASI
评分<30%。
3.2　治疗结果　50例中 ,痊愈 22 例(44%), 显效 8 例(16%),好转
18例(36%),无效 2例(4%),总有效率为 96%。所有患者在服药过
程中 ,未发现明显不良反应 ,血尿便常规及肝肾功能 ,均未发现任何
异常。
4　体会　银屑病是一种顽固性皮肤病 ,其发生的主要原因是血热。
血热可引起神经内分泌和免疫系统功能紊乱 ,久之可致机体表皮细
胞异常增生和炎症同时存在而引起银屑病的发生 、发展与反复发
作。清热解毒活血化瘀中药可彻底改变患者机体血热 、血燥 、血毒 、
血瘀的病理变化。 祛银方中生地 、白茅根清热凉血 、透邪消斑;羌
活 、独活疏风胜湿 、通络止痛;土茯苓 、槐花除湿清热 、解毒消斑;荆
芥 、防风 、威灵仙祛风胜湿通络;蜈蚣解毒通络止痛;紫草凉血活血 、
解毒透疹;乌梅去死肌。 诸药合用 ,共奏清热解毒 、活血祛风 、利湿
消斑之效 ,临床应用收到满意效果。
(修回:2009-04-01)
·196· 中国中医药科技 2009 年 5月第 16卷第 3 期 May 2009 Vol.16 No.3