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吸附层析法从啤酒废酵母中提取谷胱甘肽
邱雁临1 ,殷伟1 ,潘飞1 ,杨翠珍2(1.湖北工业大学生物工程学院 ,湖北 武汉 430068;2.武汉华珍药业有限公司 ,湖北 武汉 430068)
摘要:以壳聚糖作为吸附剂 , 通过吸附层析法从啤酒废酵母泥为原料 , 经预处理和细胞破碎后得到的富含谷胱甘肽的抽提液
中 ,分离纯化还原型谷胱甘肽。根据试验结果确定最佳提取条件为:上柱啤酒废酵母抽提液的最适 pH 值为 7.0 , 最适洗脱剂为
pH 值为 4.4 的磷酸盐缓冲液。在最适吸附条件下 , 还原型谷胱甘肽的平均洗脱率为 84.18%,平均回收率 79.55%。说明此法是
可行的。
关键词:壳聚糖;吸附层析;啤酒废酵母;谷胱甘肽
中图分类号:Q516　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)01-0049-03
Separation Glutathione from Abandoned Beer Yeast by Absorption Chromatography
QIU Yan-lin1 ,YIN Wei1 ,PAN Fei1 ,Yang Cui-zhen2(1.College of Bioengineering ,Hubei University of Technology ,Wuhan 430068;2.Wuhan Huazhen Pharmacy Ltd.,Wuhan 430068 P.R.China)
Abstract:The study introduced the method of separation glutathione from the extraction , which came from abandoned beer yeast.And chitosan was
regarded as absorption material.According to the study , They made sure the best distill condition:the best pH of sample liquid is 7.0 and the des-
orption process was performed with 4.4 phosphate liquid.At the best condition , the desorption ratio of GSH reaches 84.18% and the recovery ratio
of GSH reaches 79.55%.This technique was feasible.
Key words:chitosan;absorption chromatography;abandoned beer yeast;Glutathione
收稿日期:2004-08-02;修回日期:2004-12-23
攻关项目:湖北省教育厅重大项目(编号:2003Z001)
作者简介:邱雁临(1942-),女 ,教授 ,博导 ,研究方向为再生资源的微
生物转化 ,取得成果 15项 , 1项获省奖三等奖 ,发表论文 40余篇。
　　谷胱甘肽化学名为:N-(N-L-γ-Glutamyl-L-cysteni-
nyl)gly cine , 即 N-{N-L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰}甘氨
酸[ 1] 。谷胱甘肽是机体内的重要活性物质 , 它具有清除自由
基 、解毒 、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性 、维持 DNA
的生物合成 、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能[ 2] 。
临床用于中毒性肝炎和感染性肝炎治疗[3 ,4] ,有机物及重金属
的解毒 ,癌症辐射和化疗的保护[ 5-7] , 抑制白内障以及角膜与
视网膜疾病的改善[ 8] , 对肺纤维化 、肝癌 、卵巢癌 、艾滋病也是
有益的联合用药[9-11] , 亦广泛用于食品加工业 、化妆品工业
等。
本研究是以壳聚糖为吸附剂通过吸附层析法 , 从啤酒废
酵母的预处理以及细胞破碎得到富含谷胱甘肽抽提液 , 分离
纯化还原型谷胱甘肽;试图为填补我国 GSH 生产空白做点工
作。本试验用的壳聚糖是一种无毒 、价廉的天然新型吸附剂 ,
用它从啤酒废酵母中提取还原型谷胱甘肽的方法目前未见文
献报道。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
啤酒废酵母抽提液:由废酵母抽提液制备组提供。
壳聚糖:市售 , 分子量 270kD ,脱乙酰度:87.22%。
1.1.2　主要试剂
偏磷酸:分析纯 , 中国医药(集团)上海化学试剂公司;碘
酸钾:分析纯 , 上海化学试剂采购供应站;环氧氯丙烷:分析
纯 ,天津市博迪化工有限公司。
1.1.3　主要仪器
层析柱:定制直径 16×600mm 、直径 40×600mm。
RE-52A旋转蒸发器 , 上海亚荣生化仪器厂;JJ-I 型精密
增力电动搅拌器 ,常州国华电器有限公司;BSZ-100自动部分
收集器 ,上海泸西分析仪器厂。
1.1.4　还原型谷胱甘肽的测定:碘量法[ 12]
取5ml的待测样品 , 置于 250ml的锥形瓶中 , 加入 5ml的
2%偏磷酸溶液 , 1ml 5%的碘化钾溶液和 2 滴淀粉指示剂 , 用
碘酸钾溶液 0.001mol l滴定至溶液由无色变为蓝色即为滴定
终点。每毫升待测液中 GSH 含量=滴定值×0.001×307.22
V , V 为吸取的待测液的毫升数。
1.2　试验方法
工艺流程:
1.2.1　层析柱制备
1.2.1.1　壳聚糖小球的制备[ 13]
取平均分子量为 27 万的壳聚糖溶于 1%的醋酸溶液中制
成质量分数为 3%的壳聚糖醋酸溶液 ,用针形注射器把壳聚糖
醋酸溶液注入凝结液中 , 控制针头与液面的距离和液滴落下
的速度 ,得到粒度均匀 ,形状规则 , 内有空心的白色壳聚糖小
球 ,水洗至中型 , 用丙酮洗涤脱水.将壳聚糖小球置于环氧氯
丙烷中 , 环氧氯丙烷的量以浸没壳聚糖小球为准。室温下电
磁搅拌 4h ,用水和丙酮反复洗涤 , 洗去环氧氯丙烷 , 得到有一
定机械强度 , 对酸碱有一定耐受性的交联壳聚糖小球 , 小球置
于于稀碱液中备用。
1.2.1.2　壳聚糖小球的酸性赖受性试验
分别配置 pH 为 1.5 、2.0、2.5、3.0 、3.5、4.0、4.5 、5.0 的缓
冲溶液 25ml置于小烧杯中 , 向其中加入 1g除去表面水的形壳
聚糖小球 , 常温下静置 24h , 观察壳聚糖小球的溶解情况。
1.2.2　装柱
取 60g 球形交联壳聚糖(用滤纸吸去表面水),悬浮于水中
并搅拌均匀 , 连同水一起装入 Υ16×600mm 的层析柱中 , 保证
装柱时均匀 、松紧一致且无气泡产生 , 并用水覆盖壳聚糖小球
表面上。
1.2.3　上柱样品 pH 值的选择试验
分别配置 pH 值为 6.5、7.0、7.5 、8.0 的缓冲液 45ml , 向其
中加入除去表面水的球形交联壳聚糖(5g), 然后加入 5ml的啤
酒废酵母抽提液 , 常温下在摇床上以 180r min 震荡 12 h , 测定
震荡前后的 GSH 的含量 , 计算其吸附率与静态吸附量。
吸附率 E=(ρO-ρe)/ρOρO:酵母抽提液中 GSH 初始质量浓度;
ρe:吸附平衡后溶液中 GSH 的质量浓度。
静态吸附量 qe=(ρO-ρe)V/M
V:酵母抽提液体积;
M:球形交联壳聚糖的质量。
1.2.4　洗脱液 pH 值的选择试验
用 pH 值为 7.0 磷酸盐缓冲液平衡层析柱 , 取 5ml啤酒废
酵母抽提液 , 调节其 pH值 7.0。把酵母抽提液倾入层析柱中 ,
分别用 pH为 6.5、6.0、5.5、5.0、4.4 的缓冲溶液洗脱 , 部分收
集(5ml 管)洗脱液 , 直到无 GSH 流出 , 检测每管洗脱液中 GSH
的含量 , 以洗脱液体积(以收集的管数表示)为横坐标 , 以流出
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2005 年 2 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.15 , No.1:49
Feb.2005
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2005.01.023
GSH含量占上样 GSH 含量百分比为纵坐标绘制 GSH 的随体
积流出曲线 ,并据此确定最佳洗脱 pH 值。
1.2.5　扩大实验
于直径 40×600mm 的层析柱中按照 1.5.1.3 方法装柱。
上样 50ml , 部分收集(50ml 管), 测定每管洗脱液中的 GSH 含
量 , 按照 1.5.5方法绘制 GSH 的随体积流出曲线 , 根据曲线确
定GSH 集中流出体积段 ,做平行试验 , 集中历次洗脱液。按照
1.4方法测定其中GSH 含量计算洗脱率并计算得率与纯度。
洗脱率=(GSH 洗脱液的体积×GSH 洗脱液的浓度)/
(GSH 上柱液的体积×GSH 上柱液的浓度)×100%
2　结果分析
2.1　壳聚糖的预处理与小球成形效果
凝结液的配方以及壳聚糖溶液的质量浓度 , 针形注射器
针头的孔径 ,针头距凝结液液面的距离对载体的成型具有重
要影响[ 14] 。针头距液面太高 ,壳聚糖液滴下落速度较大 , 其接
触液面瞬间 ,液滴与液面间又有一个较大的冲力使液滴变为
片状 ,不能成为内有空心的壳聚糖小球。针头距液面太近 , 所
产生的冲力不足以使液滴迅速浸入凝结液 , 小球下部分迅速
凝结 ,而上部分凝结较慢 , 从而形成的小球并不规则。针头孔
径对壳聚糖小球形状也有影响 , 孔径较大 , 形成的小球较扁 ,
孔径较小形成的小球较圆。从试验看 , 直径 3mm 的针头距液
面 10cm 左右可得到的形状规则 , 内有空心壳聚糖小球。
2.2　壳聚糖小球的酸溶解性试验结果
表 1　壳聚糖小球的酸溶解性试验结果对照表
pH值 1.5 2.0 2.5 3.0
溶解情况 溶解 溶解 大部分溶解 部分溶解
pH值 3.5 4.0 4.5 5.0
溶解情况 小部分溶解 未见明显溶解现象 不溶解 不溶解
　　由上表试验结果说明壳聚糖小球对酸有一定的耐受性 ,
pH 值在 4.0以上时壳聚糖小球不溶解。
2.3　上柱样品 pH 值的选择试验结果
图 1　不同 pH 洗脱条件下 GSH 对体积流出曲线
图 2　扩大试验GSH随体积流出曲线图
表 2　不同 pH 下壳聚糖小球对GSH 的静态
吸附量以及吸附率结果表
pH 6.5 7.0 7.5 8.0
GSH初始浓(mg 100ml) 13.86 13.86 13.86 13.86
吸附后GSH 浓度(mg 100ml) 2.49 1.99 2.17 2.56
吸附率(%) 82.05 85.68 84.36 81.56
静态吸附量(mgGSH g 小球) 1.137 1.188 1.169 1.130
　　由此可见 , 上柱的啤酒废酵母抽提液在 pH 值为 7.0 的条
件下 , 壳聚糖小球对 GSH 有最大的静态吸附量和吸附率 , 因
此确定 pH7.0为啤酒废酵母抽提液的最佳上柱 pH 值。由于
球形交联壳聚糖表面带有大量的正电荷 , 调节 GSH 的 pH 值与
等电点 5.93 以上可以使 GSH 分子带上负电荷 , 通过正负电荷
间的吸引作用可以使 GSH 分子牢固的结合在壳聚糖表面上。
选择合适的 pH 值 ,使壳聚糖与GSH 有适中吸附力和最大的静
态吸附量。
2.4　洗脱 pH 的选择试验结果
由图 1可知 , 以壳聚糖小球作为吸附剂来吸附分离 GSH
基本上能够获得单一的流出峰 , 在洗脱液的 pH 值为 4.4 的的
情况下 , GSH的流出曲线更为集中 ,收集相关体积段的洗脱液
获得的谷胱甘肽浓度较高。
2.5　扩大试验结果
图 2 可知 ,在扩大试验中 , GSH 洗脱液对体积流出曲线基
本上能够成单一峰。在第 350ml到 1000ml体积段的洗脱液中
GSH 的含量相对较高 , 洗脱率可以达到 84.84%。
表 3　扩大平行试验GSH洗脱率结果表
上样体积 上样GSH浓度 洗脱液体积 洗脱液GSH浓度 洗脱率 平均洗脱率
50ml 19.57mg 100ml 650ml 1.25mg 100ml 83.12%
50ml 19.57mg 100ml 650ml 1.29mg 100ml 85.63% 84.18%
50ml 19.57mg 100ml 650ml 1.26mg 100ml 83.79%
通过平行扩大试验来看 , 平均洗脱率与洗脱曲线基本相
符。图 2 能够明显说明表 3的结果。得到洗脱液 1950ml , 浓度
为 1.36mg 100ml , 平均洗脱率为 84.18%。
3　结论
3.1　试验结果表明壳聚糖小球对啤酒废酵母抽提液中 GSH
有一定的吸附能力.其吸附率为 85.68%, 最佳提取条件为:上
柱 GSH 抽提液最适 pH值为 7.0 ,最适洗脱剂 pH 值为4.4的磷
酸盐缓冲液。在最适吸附条件下 , 还原型谷胱甘肽的平均洗
脱率为 84.18%, 平均回收率 79.55%。说明此法是可行的。
3.2　谷胱甘肽的含量为 1.36mg 100ml , 总体积为 1950ml可用
于制备功能性饮品和调味品。
3.3　谷胱甘肽的吸附率 、洗脱率 、回收率等有待进一步研究提
高。
3.4　本试验用的壳聚糖是一种无毒 、价廉的天然新型吸附剂 ,
用它从啤酒废酵母中提取还原型谷胱甘肽的方法目前未见文
献报道。
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一种碱裂解菌液直接电泳快速筛选重组子的方法
熊敏 ,李青 ,李文涵 ,费世江 ,吴雄文＊(华中科技大学同济医学院免疫学系 , 湖北 武汉 430030)
摘要:目的:从碱裂解法提取质粒 DNA 的原理 ,经过实验摸索获得一种快速 、经济 、结果可靠的菌液直接碱裂解电泳筛选重
组子的方法。方法:不需提取质粒 DNA ,只需将细菌培养液碱裂解后直接进行普通琼脂糖凝胶电泳分析 , 就可以快速筛选出转化
重组子。结果:结果和提取质粒酶切鉴定鉴定结果一致。结论:经实验证明菌液直接碱裂解电泳筛选重组子是一种快速 、经济 、
可靠的方法。
关键词:碱裂解菌液筛选;重组子
中图分类号:Q784　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)01-0051-02
A Rapid Method to Screen Recombinants through Direct gel Electrophoresis
of Bacteria solution by Alkaline lysis
XIONG Min ,LI Qing ,LI Wen-han ,FEI Shi-jing ,WU Xiong-wen
(Department of Immunology , Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology ,Wuhan 430030, P.R.China)
Abstract:Objective:An efficient method was provided to screen recombinant clones.Method:The bacterical cultures treatment with alkaline lysis
and direct analy sis by agarose gel electrophoresis.Result:Recombinant clones was identified rapidly.Conclusion:This method is a convenient ,
economical and rapid methods to screen recombinant clones.
Key words:alkaline lysis;bacterical cultures;screen ;recombinants
收稿日期:2004-08-02;修回日期:2004-10-19
作者简介:熊敏(1978-), 女 , 硕士生 , E-mai l:karren1209@hotmail.
com;＊指导教师:吴雄文(1964-), 男 ,湖北人 , 教授 ,博士导 ,从事免
疫遗传和移植免疫学研究。
　　重组子筛选是分子克隆技术中非常重要的步骤之一 ,α互
补蓝色 白色筛选法 、PCR 筛选法是常用的重组子筛选方法。
但蓝色 白色筛法在实际运用中存在不少的假阳性 , 需要进一
步验证 , PCR筛选法需要引物 , 对没有这种筛选标记的载体更
需要一种快速 、成本低的筛选方法。 我们从碱裂解法提取质
粒 DNA中得到启发 ,首次经过实验摸索获得一种快速 、经济 、
结果可靠的菌液直接碱裂解电泳筛选重组子的方法。该法不
需提取质粒 DNA , 只需将菌液裂解后直接进行普通琼脂糖凝
胶电泳分析 ,就可以快速筛选出转化重组子 , 结果和提取质粒
酶切鉴定鉴定结果一致。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌株与载体
大肠杆菌 DH5α与载体 pET-22b 由本实验保存。外源片
段大小约 1.2 kb ,片段的克隆在本实验室完成。
1.1.2　试剂
限制性内切酶 BamH1 , Nde1 为 Takara 公司产品 , 试剂 LB
培养基 、Tris-base、EDTA , RnaseA、SDS、NaOH 、氨苄青霉素均购
自凌飞公司。
1.1.3　培养基
LB液体培养基:10g 胰蛋白胨 , 5g 酵母提取物 , 10g NaCl ,
1000ml蒸馏水 , 5mol L NaOH 调至 pH7.0 , 高压灭菌。 LB 固体
培养基:15g琼脂糖 , 1000ml LB 液体培养基 ,高压灭菌。
1.1.4　仪器
电泳仪 , DNA显相分析仪。
1.2　方法
片段的酶切 、连接 、转化按文献[1]进行 , 在转化的 LB 平板
上挑取单菌落 , 2 ml(氨苄 100 μg ml)的 LB 液体培养基中 , 37
℃振荡培养 6-8h。然后取菌液用碱裂解后直接进行琼脂糖
电泳 ,含有外源片断的质粒将出现滞后现象。具体操作如下:
取5μl悬浮液(50 mmol L 葡萄糖 , 25 mmol L Tris-HCl(pH8.
0), 10 mmol L EDTA(pH8.0), RNase A 0.2 mg ml , 保存于4℃)于
96 孔V 型板孔中 , 加入 20 μl 菌液 , 再加入 10 μl裂解液(1%
SDS , 0.2mol L NaOH 室温保存)溶液于室温裂解 5 min。然后加
3μl 10×电泳上样缓冲液用移液枪反复抽吸几次上样到未进
水的琼脂糖凝胶上 , 放入电泳槽小心加入电泳缓冲液并淹没
凝胶。 110V电泳 30-30min后置于紫外灯下观察质粒 DNA 带
有无滞后现象。电泳检查质粒 DNA 有滞后现象的菌落 , 可能
为重组质粒 , 需进一步验证。将滞后质粒的小量提取质粒酶
切 37℃恒温酶切 4h后 , 电泳检查。
图 1　菌体裂解电泳结果
1 ,3 , 4:有滞后;2:无滞后
Fig.1　The electrophoresis result of the bacterical cultures treatment with alka-
line lysis 1, 3 , 4:showing lagging;2:no lagging
图 2　质粒酶切的结果
1 ,3 , 4:含外源片段的重组子;2:非重组子
Fig.2　Restriction enzyme digestion of the plasmid
M:marker DL2000;1 ,3 , 4:recombinant plasmids;2:not recombinant plasmids
2　结果与讨论
菌液裂解后直接电泳结果见图 1 ,从图 1 可以看出菌液裂
解后直接电泳可以在前后观察到两部分带型 , 滞后的带型是
由宿主 DNA 产生的共同带型。后面的带型是由质粒 DNA 产
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BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.15 , No.1:51
Fer.2005