全 文 ：HPLC测定夏枯草中熊果酸 、齐墩果酸 、迷迭香酸的含量
刘　伟 , 　丁海杰
(河南中医学院分析测试中心 ,河南 郑州 450008)
收稿日期:2007-05-15
作者简介:刘　伟(1955～ ),男 ,教授 ,从事中药质量研究和仪器分析方法开发应用工作 ,电话:0371-65575838, E-mail:hnliuwei2088@sina.
com。
关键词:夏枯草;熊果酸;齐墩果酸;迷迭香酸;HPLC
摘要:目的:通过采用高效液相法测定夏枯草中熊果酸 、齐墩果酸和迷迭香酸的含量来比较夏枯草质量的优劣 , 为夏枯草
的质量控制方法提供一定的依据。方法:(1)测定熊果酸 、齐墩果酸色谱条件为 BetasilC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流
动相:磷酸二氢钠缓冲液 [取磷酸二氢钠 7.8 g加水至 1 000 mL] -甲醇(14∶86);流速:0.8 mL/min;柱温:25 ℃;检测波
长:210 nm;(2)测定迷迭香酸色谱条件为:采用 BetasilC18(250mm×4.6mm, 5 μm);流动相:甲醇-1%甲酸(40∶60)流
速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;检测波长:330 nm。结果:(1)熊果酸在 0.445 ～ 5.34 μg范围内线性关系良好;r=0.999 9;
平均回收率为 97.45%, RSD为 0.92%;齐墩果酸在 0.18 ～ 2.16 μg范围内线性关系良好:r=0.999 9;平均回收率为
97.61%, RSD为0.87%;(2)迷迭香酸在 0.44 ～ 8.80 μg范围内线性关系良好;r=0.999 9;平均回收率为 98.17%,
RSD%为 1.02%。结论:该方法简单 、准确并且专属性强。
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)04-0577-03
　　夏枯草(PrunelavulgarisL.)是唇形科夏枯草
属植物 。其药用部位为干燥果穗 ,有时也以全草入
药 。因 “此草夏至后即枯 ”故名 ,为中医临床常用的
一味中药。夏枯草始载于 《神农本草经 》, 列为下
品 ,其味 “苦辛寒 ,治寒热瘰疬 ,鼠瘘头痛 ,破症 ,散
瘿结气 ,脚肿湿痹 ,轻身 ,一名乃东 ,生川谷 ”。其味
苦 、性寒 、辛 ,具有清肝 、明目 、散结 、消肿 、止痛之功
效 。用于目赤肿痛 、目珠夜痛 、羞明流泪 、头痛眩晕 、
瘰疬 、瘿瘤 、乳痈肿痛 [ 1] 。现代临床多用于治疗甲
状腺肿大 、淋巴结核 、乳腺增生 、高血压 、肺结核 、急
性黄疸型传染性肝炎等疾病[ 2] 。熊果酸 、齐墩果
酸 、迷迭香酸为夏枯草中主要有效成分 ,它们的含量
直接影响夏枯草质量 。本文采用高效液相法测定不
同产地夏枯草中熊果酸 、齐墩果酸和迷迭香酸的含
量 ,为比较不同产地夏枯草质量提供科学依据 。
1　仪器与试药
1.1　仪器
DIONEXSummit系统高效液相色谱仪 , DI-
ONEXPDA-100检测器;DIONEXASI-100自动进样
器;DIONEXP680 pump;DIONEXChromeleon色谱
工作站 。 METTLERAE240十万分之一天平 (瑞
士);FA2004A万分之一天平。
1.2　试药
熊果酸对照品(批号:110742-200516 ,中国药品
生物制品检定所);齐墩果酸对照品(批号:709-8903
中国药品生物制品检定所);对照品迷迭香酸(批
号:1231-050419,中药固体制剂制造技术国家工程
研究中心);试验中所用甲醇为色谱纯 ,水为双蒸
水 ,其它试剂均为分析纯 。
试验所用夏枯草样品分别采自于:河南省南阳
桐柏县 、安徽省亳州市 、江苏省苏州市 、湖南省益阳
市 、湖北省宜昌市 、河北省安国市 、山东省临沂市 、广
东省广州市 、贵州省贵阳市 、四川省南充市 。 (以上
样品经河南中医学院药学院陈随清教授鉴定为夏枯
草)
2　色谱条件
2.1　熊果酸 、齐墩果酸测定色谱条件
BetasilC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相:
磷酸二氢钠缓冲液 [取磷酸二氢钠 7.8 g加水至
1 000mL] ∶甲醇(14∶86);流速:0.8 mL/min;柱
温:25℃;检测波长:210nm。
2.2　迷迭香酸测定色谱条件
采用 BetasilC18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流
动相:甲醇-1%甲酸(40∶60)流速:1.0 mL/min;柱
温:25℃;检测波长:330nm。
3　实验方法与结果
3.1　供试溶液的制备
3.1.1　对照品溶液的制备
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精密称取熊果酸 、齐墩果酸对照品 4.45 mg、
1.80mg,置于 10mL的量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释
至刻度 ,摇匀 ,得每 1mL含熊果酸 、齐墩果酸 0.445
mg、0.18 mg的对照品溶液 。
精密称取迷迭香酸对照品 4.40mg,置于 10 mL
的量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,得每 1
mL含迷迭香酸 0.44mg的对照品溶液。
3.1.2　供试品溶液
分别称取样品粉末各 2 g,精密称定 ,置于索氏
提取器内 ,加入乙醚适量 ,浸泡过夜 ,水浴加热回流
约 6 h,至乙醚无色 ,回收溶剂 ,残渣用石油醚(60 ～
90 ℃)浸泡 2次 ,每次 15mL,每次 2 min,倾出石油
醚液 ,残渣挥干残留溶剂 ,用甲醇溶解并转移至 10
mL的量瓶中 ,加甲醇至刻度 , 摇匀 ,用微孔滤膜
(0.45 μm)滤过 ,滤液作为熊果酸 、齐墩果酸测定供
试品溶液。
分别称取样品粉末各 1 g,精密称定 ,精密加入
甲醇各 50mL,称定重量 ,超声提取 1 h,冷却 ,再称
定重量 ,用甲醇补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,精密量
取续滤液 25 mL,浓缩定容至 5 mL量瓶中。用微孔
滤膜(0.45 μm)滤过 ,滤液作为迷迭香酸测定供试
品溶液 。
3.2　系统适用性试验
分别取 3.1.2项下两种供试品溶液 4 μL,注入
高效液相色谱仪测试 ,理论塔板数以熊果酸 、齐墩果
酸 、迷迭香酸峰计分别不低于 4 000,熊果酸 、齐墩果
酸 、迷迭香酸色谱峰与相邻色谱峰的分离度不小于
1.5。
对照品及样品色谱图分别见图 1、2、3、4。
图 1　熊果酸 、齐墩果酸对照品色谱图
1.熊果酸　2.齐墩果酸
3.3　标准曲线及线性范围试验
分别精密吸取上述配制好的熊果酸 、齐墩果酸
(1、4、8、10、12 μL)和迷迭香酸(1、2、4、6、8、10、12
μL)对照品溶液注入高效液相色谱仪 ,在上述色谱
条件下测定峰面积(A),以峰面积为纵坐标 ,以对照
品的量为横坐标 ,分别绘制标准曲线 ,得出回归方程
分别为:熊 果酸 Y=7.281 9X-1.658 2, r=
0.999 9;齐墩果酸 Y=9.071 8X-0.888 9, r=
0.999 9;迷迭香酸 Y=50.937 2X-10.707 0, r=
0.999 9。熊果酸 、齐墩果酸 、迷迭香酸分别在 0.445
～ 5.34μg、0.18 ～ 2.16 μg、0.44 ～ 8.80 μg范围内
呈良好线性关系。
图 2　熊果酸 、齐墩果酸测定样品色谱图
图 3　迷迭香酸对照品色谱图
图 4　迷迭香酸测定样品色谱图
3.4　精密度试验
分别精密吸取同一熊果酸 、齐墩果酸和迷迭香
酸对照品溶液各 4 μL,分别重复进样 6次 ,测定峰
面积 ,结果见表 1。RSD<2%。
表 1　 精密度试验结果
试验号 熊果酸峰面积 齐墩果酸峰面积 迷迭香酸峰面积
1 30.541 15.517 78.151
2 30.753 15.269 77.963
3 30.781 15.391 77.370
4 30.493 15.450 78.815
5 30.315 15.232 78.945
6 30.247 15.493 79.102
RSD(%) 0.72 0.77 0.86
3.5　稳定性试验
分别精密吸取同一熊果酸 、齐墩果酸测定供试
品溶液和迷迭香酸测定供试品溶液 6μL,分别于 0,
3, 6, 9, 12h注入高效液相色谱仪 ,分别测定熊果酸 、
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齐墩果酸和迷迭香酸峰面积 ,其相对标准偏差 RSD
分别为 1.38%、1.29%和 0.52%,表明样品中熊果
酸 、齐墩果酸和迷迭香酸均在 12 h内稳定。
3.6　重复性试验
分别取同一样品 ,按 3.1.2项下制备方法 ,分别
制备 5分供试品溶液 ,按 3.8项下测定方法分别测
定熊果酸 、齐墩果酸和迷迭香酸的含量 ,其相对标准
偏差 RSD分别为 1.06%、1.13%和 0.63%。
3.7　加样回收率试验
分别取已知含量的样品各 6份 ,精密称定 ,分别
加入一定量的熊果酸 、齐墩果酸和迷迭香酸 ,按 3.8
项下的含量测定方法进行提取测定熊果酸 、齐墩果
酸和迷迭香酸的含量 ,计算加样回收率 ,结果见表
2, RSD<2%。
表 2　 加样回收率试验结果
成分 样品含量/mg
加入量
/mg
测得总量
/mg
回收率
/%
平均回收率
/%
RSD
/%
2.700 3 2.62 5.200 3 95.42
熊 2.700 5 2.57 5.192 9 96.98
果 2.699 5 2.69 5.309 3 97.02 96.95 1.19
酸 2.700 8 2.52 5.134 1 96.56
2.699 7 2.64 5.312 5 98.99
2.700 3 2.49 5.109 3 96.75
0.800 1 0.74 1.505 0 95.26
齐 0.800 2 0.79 1.567 7 97.15
敦 0.799 8 0.80 1.571 1 96.41 96.47 1.04
果 0.800 2 0.77 1.554 1 97.91
酸 0.799 9 0.83 1.601 6 96.60
0.800 1 0.82 1.583 0 95.48
0.899 8 0.92 1.787 9 96.53
迷 0.900 2 0.92 1.798 7 97.66
迭 0.900 5 0.92 1.794 5 97.17 96.83 0.87
香 0.900 2 0.92 1.791 5 96.88
酸 0.899 8 0.92 1.776 7 95.32
0.899 5 0.92 1.795 9 97.43
3.8　样品测定
分别精密吸取 3.1.2项下制备好的熊果酸 、齐
墩果酸供试品溶液 10 μL和迷迭香酸供试品溶液
15μL注入高效液相色谱仪 ,记录色谱图 ,计算各样
品中熊果酸 、齐墩果酸和迷迭香酸的含量 ,结果见表
3。
4　讨论
4.1　本实验考察了甲醇超声 、甲醇回流 、95%乙醇
回流 、乙醚索氏提取 4种提取方法 ,每种方法平行做
2份 。结果表明甲醇 、95%乙醇提取出来的杂质较
多 ,使熊果酸 、齐墩果酸的峰形变宽 ,检测灵敏度降
低 ,两者的分离度达不到要求 。而以乙醚为提取溶
剂的索氏提取器提取法能很好的富集熊果酸 、齐墩
果酸 ,有利于夏枯草的鉴别和含量测定 ,再用石油醚
浸泡除杂后 ,可有效减少干扰物质 。
表 3　 夏枯草中各成分的含量(n=3)
样品产地 熊果酸含量 /% 齐墩果酸含量 /% 迷迭香酸含量 /%
河南 0.31 0.08 0.42
安徽 0.27 0.08 0.42
江苏 0.21 0.05 0.20
湖南 0.21 0.05 0.20
河北 0.29 0.08 0.05
山东 0.14 0.04 0.07
广东 0.18 0.04 0.18
贵州 0.19 0.04 0.15
四川 0.22 0.06 0.17
湖北 0.27 0.08 0.12
4.2　夏枯草化学成分复杂 ,含多种三萜类成分 ,以
熊果酸 、齐墩果酸含量最高 ,由于两者结构相似 ,只
有一个甲基位置的差异 ,给分离带来一定难度 ,且熊
果酸 、齐墩果酸中无共轭体系 ,紫外吸收波长较短 ,
因为在 210 nm熊果酸 、齐墩果酸吸收峰灵敏度较
高 ,其他色谱峰干扰较小 ,分离最为理想 ,故试验选
210 nm测熊果酸 、齐墩果酸的含量 。
4.3　试验所用的高效液相色谱条件是在参考有关
文献的基础上[ 3-9] ,经过多次优化 、筛选而确定的。
采用磷酸二氢钠缓冲液 [取磷酸二氢钠 7.8 g加水
至 1 000mL] ∶甲醇(14∶86),基线平稳 ,峰形 、分
离效果较佳 ,分离度为 1.96,达到基线分离 ,可以对
熊果酸 、齐墩果酸准确定量。测定迷迭香酸采用甲
醇-1%甲酸(40∶60)流动相 ,简单易行 ,重现性好 ,
并且干扰小 ,非常便于操作 。建议 《中国药典 》在制
定 “夏枯草 ”项下熊果酸含量测定方法中增加对齐
墩果酸的定量及熊果酸 、齐墩果酸分离度的要求 ,使
更加准确地反映夏枯草的质量。
4.4　本试验采用高效液相法对夏枯草中熊果酸 、齐
墩果酸和迷迭香酸的含量进行了测定 ,由试验可以
看出不同产地夏枯草中所含熊果酸 、齐墩果酸和迷
迭香酸并不一致 ,这与土壤条件 、种植方法以及采集
时间和存放时间等客观条件有很大关系。因此 ,判
断夏枯草质量的优劣并不能根据某一种化学成分来
判断 ,而是要根据多种成分指标来判断夏枯草质量 ,
只有多种成分的综合指标好的才能判断其质量为优。
参考文献:
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ChineseTraditionalPatentMedicine
April2008
Vol.30　No.4
收稿日期:2007-05-18
作者简介:吴　敏(1974～ ),女 ,硕士 ,讲师 ,研究方向:中药新制剂与新技术开发 ,电话:028-88051652。
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[综　　述 ]
SFE在天然药物和食品农药残留分析中的应用
吴　敏
(成都医学院 ,四川 成都 610081)
关键词:SFE;天然药物;食品;农药残留;分析
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:B　　　　　文章编号:1001-1528(2008)04-0580-03
　　超临界流体萃取(SFE)是近代出现的一种新型的分离
提取技术。与传统萃取方法相比具有简便快速 、低温无毒 、
选择性好 、提取效率高 、没有溶剂残留等优点 ,主要用于中草
药 、食品等有效成分的提取和分离 ,但最近在农药残留分析
中也逐步得到应用。其应用范围如水果 、蔬菜 、土壤 、生物组
织和其它原料 [ 1] 。现就国内外近年来用 SFE在中草药中的
农药残留分析以及在食品中的应用作一综述。
1　SFE用于天然药物中有机氯农药残留分析
以六六六(BHC)、滴滴涕(DDT)为代表的有机氯农药
(OCPs)是我国最早大规模使用的农药 , 由于 OCPs毒性强 ,
降解速度慢 , 特别是中草药的培养一般需要较长时间 ,因而
OCPs农药的积累更为严重 , 目前在许多药材中仍可检出 , 直
接影响了中药的出口。目前有机氯农药已成为中草药中农
药残留分析的首选目标。如 ZhaoC等 [ 2]研究了一种 SFE同
时提取并分离当归中 12种有机氯农药残留的分析方法 , 用
气相色谱(GC)-电子捕获检测器(ECD)和高效液相色谱
(HPLC)测定当归活性组分含量。结果表明 ,添加样品中 12
种 OCPs(α-, β -, γ-, δ-六氯苯 、五氯硝基苯 、五氯苯胺 、甲基五
氯苯基硫化物 、七氯 、op′-DDT、pp′-DDT、DDE和 DDD)优化
条件为温度 60℃、压力 15 MPa、萃取 20 min, 流速 1.5 mL/
min,设定的 SFE方法对 OCPs萃取率高 、活性成分损失小。
可为中草药中 OCPs的常规分析提供依据。
LingYC等 [ 3]研究了 SFE在线萃取并纯化中草药中 13
种有机氯农药残留继而运用 GC-ECD和 MS测定其含量的
分析方法。这些有机氯农药包括 α-, β-, γ-, δ-六氯苯 ,七氯 ,
艾氏剂 , 环氧七氯 , 硫丹 I, 4, 4′-DDE, 狄氏剂 , 异狄氏剂 , 4,
4′-DDD, 硫丹Ⅱ , 4, 4′-DDT, 异狄氏剂醛 , 硫丹硫酸盐。 SFE
最优萃取条件为:以纯 CO2作为超临界流体 , 萃取压力 250
atm,萃取温度 50 ℃,静态萃取 5 min, 动态萃取 20 min。此
法已成功用于台湾市场上中草药中 OCPs的检测 ,可用作测
定 CHMs中 OCPs的常规方法。
QuanCan等 [ 4]建立了一种运用 SFE和离线固相萃取
(SPE)同时提取并净化人参中 9种有机氯农药残留的分析
方法 , 9种有机氯农药包括 α-, β -, γ-, δ-六六六 ,五氯硝基苯
和 DDT及其代谢产物。 萃取的目标分析物用 SPE柱收集 ,
用洗脱液洗脱 , GC-ECD定量 , 同时用质谱法确认。其优化
的 SFE萃取条件为:萃取压力 300Pa, 萃取温度 60℃。研究
者又对比了 SFE和索氏提取两种方法 , 结果表明 SFE法更
快速 、更有效。
ZuinVG等 [ 5]研究了一种简单 、快速而廉价的 SFE同
时提取并分离两种巴西药用植物叶中有机氯农药(林丹 、六
氯苯 、百菌清 、四氯杀螨砜 、α-硫丹 、β-硫丹 、狄氏剂)残留的
分析方法 , 并用高分辨气相色谱-电导检测器 /裂变产物探测
(HRGC-ECD/FPD)直接分析。 平均回收率为 69.8% ～
107.1%。药食兼用的大蒜 [ 6]中则主要存在四种有机氯农药
残留。所有 OCPs添加样品回收率为 85.0% ～ 110.0%, 其
RSD为 3.9% ～ 7.2%。显示该种方法可作为检测大蒜中
OCPs的一种常规方法。
2　SFE用于天然药物中有机磷农药残留分析
有机磷农药(OPP)是继有机氯农药之后在我国大量使
用的一类农药 ,在天然药物中亦存在有机磷农药残留 , 两种
巴西药用植物叶 [ 5]中有机磷农药(马拉硫磷 、杀扑磷 、杀螟
硫磷 、倍硫磷 、对硫磷 、甲基对硫磷)残留的分析方法 ,用 SFE
优化条件为:温度 50 ℃、压力 25 MPa、静态 5 min、动态 10
min/2 g,萃取物用高分辨气相色谱-电导检测器 /裂变产物探
测(HRGC-ECD/FPD)直接分析。平均回收率 69.8% ～
107.1%, RSD1.4% ～ 14.7%。 23%的样品检测显示存在着
有机磷农药残留。
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