全 文 ：文章编号:1002-8110(2005)03-0066-03
从啤酒酵母中提取 RNA的研究
张 帅
(广东省肇庆学院轻工化学系 ,肇庆 526061)
摘 要:研究了从啤酒酵母中提取 RNA的两种方法 , 即浓盐法和氨解法 ,并主要对氨解法进行了研究 , 分别得
出了最佳工艺条件 ,同时对两种方法进行了比较。
关键词:啤酒酵母;RNA;盐氨
中图分类号:TS262.5;Q93-33 文献标识码:B
0 前言
RNA(核糖核酸)是重要的生物遗传物质 , 主要分布在细
胞质中 ,是指导蛋白质合成的模板物质。 RNA 主要有三大
类 ,其中 ,核糖体 RNA(rRNA)占 RNA 总数的 80%以上 , 一般
从酵母中提取的大分子 RNA 主要是 rRNA。
核酸大分子的不完全水解产物中有核苷和核苷酸。其
中鸟苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)是强力助鲜剂[ 1] , 胞苷酸
(CMP)和尿苷酸(UMP)可作为生产治疗癌症 、肝炎及冠心病
等药物的原料。在化妆品中加入核酸或其水解物 ,可促进皮
肤蛋白合成 ,达到养护皮肤的作用。在农业上 , RNA 降解物
具有促进作物生长增产的作用 ,已在水稻 、小麦 、柑橘及多种
蔬菜中生产应用 ,取得了明显的增产效果[ 2] 。
目前 ,我国的核酸工业虽然取得了一定的进展, 但同欧
美、日本相比仍然比较缓慢[ 3] 。从啤酒酵母中提取 RNA 的工
艺方法很多[ 4] , 本文主要就浓盐法和氨解法进行研究和比较。
收稿日期:2004-12-20
作者简介:张 帅(1978-), 男 ,硕士 , 肇庆学院教师。
研究方向:生物产品分离分析技术 , 现主要从事食品发酵方
面研究工作。
1 材料与方法
1.1 原料
啤酒酵母 , 由本系微生物实验室提供。供试菌种处于对
数期 , 此时含 RNA 最丰富 ,约为 6%～ 8%。
1.2 主要试剂
食盐 、盐酸 、氨水 、乙醇 、钼酸铵 、过氯酸 、三氯乙酸 、硫酸
1.3 主要仪器设备
TDL-5 离心机 、721 分光光度计 、pH 计 、电热恒温干燥
箱 、501 型超级恒温器
1.4 方法
1.4.1 原料预处理
称取 10g供试酵母 , 配成 10%酵母溶液。若浓度太高 ,
溶液成糊状 , 不易搅拌;浓度太低 , 调上清液等电点时 RNA
不易沉淀 , 因为 RNA 在水溶液中有一定的溶解度。
1.4.2 核酸提取步骤
核酸提取主要分三步进行:(1)破壁 ,使核蛋白从细胞
中溶出。(2)加热 , 使杂蛋白变性沉淀。(3)离心 , 使核酸与
蛋白分离 , 得 RNA 清液 , 再调 RNA 等电点 , 使 RNA 粗品沉
淀 ,经纯化 、干燥得到成品。
1.4.3 浓盐法提取 RNA的工艺流程
Study and Optimization on the Method for Dimethyl Sulfide
Precursor in Malt by Headspace Gas Chromatography
HUANGYan-jun2 ,3 ,LI Hong1 , 3 ,WANG Yun-chuan2 , 3 ,ZHENG Xi 2 ,3 ,
LUO Huai-min2 ,3 ,WU Yong-yang2 ,3 , ZHANG Wu-jiu1 ,3
(1.Kingway Brewery Co., Ltd., Shenzheng , 518019;2.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing , 100027
3.Kingway Brewery Co., Ltd.&China National Research Insti tute of Food and Fermentation Industries Joint Institute , Shenzheng , 518019)
ABSTRACT:The method for determination of SMM and DMSO in malt was studied.These two precursors of DMS are determined by convert-
ing SMM into DMS in high temperature and alkaline condition and by converting DMSO into DMS using Sodium Pyrosulfite as reducing agent.
KEY WORDS:malt DMS SMM DMSO Sodium Pyrosulfite
第 32卷 第3期
2 0 0 5 年 5 月
酿 酒
LIQUORMAKING
Vol.32 ,No.3
May., 2005
通过盐溶液产生较大的细胞渗透压 , 使细胞破裂 , 释放
出核蛋白体 , 从而使核蛋白体与酵母菌体分离。由于 RNA
钠盐易溶于水 ,在含盐的菌体溶液中 , RNA 有较高的溶解度 ,
这样 ,通过控制温度使蛋白质变性沉淀 ,通过离心将 RNA 及
蛋白质和脱核酵母菌体分离 ,从而达到提取之目的。
酵母液※盐处理※快速加热※抽提保温※迅速冷却※
离心分离※上清液※等电点沉淀 RNA※乙醇洗涤※干燥※
RNA干品
1.4.4 氨解法提取 RNA 的工艺流程
用 1.0%氨水处理酵母细胞 , 是通过稀碱作用将酵母细
胞壁中的脂溶性物质溶解 ,使核酸溶出 ,采取分步调等电点
的方法:加三氯乙酸使蛋白质沉淀 , 同时用硫酸调蛋白等电
点4.2 , 除杂蛋白 , 将核酸上清液用盐酸调核酸等电点 2.3 ,
离心后得核酸粗品 ,用 70%酒精洗涤得核酸产品。
酵母液※氨水破壁※离心分离※上清液※分步调等电
点※乙醇洗涤※干燥※RNA 干品
1.4.5 RNA的测试方法
A.上清液中 RNA 的测定[ 5, 6]
分光光度法:上清液※调 pH 为 7※取 1mL 稀释 500 倍
※测OD值※计算
规定 1mg/mL溶液 A260=20 , 则 RNA%= A26020 ×500×
100
1000
为 100mL溶液中 RNA的含量
B.RNA干品纯度测试方法
表 1
编号 样品 水 沉淀剂
甲管
乙管
2mL
2mL
2mL
2mL
精确称量 0.5g 粗核酸粉※研磨※加 10mL水※5%氨水
调 pH 为 7※50mL容量瓶※冰箱冷置 30min※离心分离※取
0.5mL定容 50mL※测 OD。取两支 10mL 离心管 , 按下式操
作:
(1)样品实际浓度= 0.5
50ml× 4
2
×50
0.5
=50ug/ml
RNA%=甲OD260±-乙OD260±
0.022×50 ×100%, 0.022 是浓度为
1ug/ mL的 RNA溶液的 OD值
甲液 OD260为总的核酸 , 核苷酸的值 , 乙液 OD260为核苷
酸小分子的值 ,两者之差即为核酸大分子的值 。
(2),纯 RNA溶液的 A260/A280值为 2.0 , 样品中若含有蛋
白质 , 则 A260/A280值要下降 , 因为蛋白质的最大吸收峰在
280nm。
2 结果与讨论
2.1 浓盐法提取 RNA
此方法研究和应用最为普遍 ,本人经实验得出的最佳工
艺条件是:取 10%的酵母液 , 加盐浓度为 10%, 加热温度为
92℃,加热时间为 4h。一般得率在 2.6%左右 , 纯度在 74.5
左右。由于提取 RNA 后的上清液中仍含有一定量的 RNA ,
所以采用循环使用上清液的方法 , 既省水 ,又省盐。 下面主
要分析一下上清液的循环使用情况。
表 2
参数 配液用水 得率(%)
纯度
(%)
净得率
(%)
1
2
3
4
清水
第一次循环上清液
第二次循环上清液
第三次循环上清液
2.56
3.26
3.48
2.65
96.6
77.5
79.3
82.3
2.49
2.51
2.61
2.38
由上表可知 , 同样条件下 ,使用第二次循环上清液 , 即循
环两次 , 抽提的 RNA 的净得率最高。
2.2 氨解法提取 RNA
2.2.1 氨法破壁条件确定
采用酵母质量分数 10%,氨 1.0%,破壁温度为 60℃,不
同时间不同量做正交实验如下:
表 3
因素 时间(min) 三氯乙酸浓度(%)
1
2
3
25
40
60
2
3
5
表 4
实验号 A提取时间
B
三氯乙酸浓度
得 率
(%)
净得率
(%)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1(25min)
1
1
2(40min)
2
2
3(60min)
3
3
1(2%)
2(3%)
3(5%)
1
2
3
1
2
3
51.2
70.7
69.4
77.0
68.3
70.6
65.8
68.0
66.2
1.126
0.495
1.040
1.155
1.366
1.690
0.790
0.880
0.861
M 1i
M 2i
M 3i
RI
0.877
1.216
0.913
0.329
1.024
0.973
0.197
0.224
①时间对 RNA提取的影响
从上表看出 , 时间的极差不是最大 ,即时间不是最大影
响因素 , 时间取 40min 为最佳。
②三氯乙酸量对 RNA提取的影响
从上表看出 , 三氯乙酸的极差也不是最大 , 即说因素 B
也不是最大因素 , 三氯乙酸含量取 5%为最佳。
·67·第 3期 张 帅:从啤酒酵母中提取 RNA的研究
通过对指标影响分析得出较好的实验方案是:
A2 时间 第二水平 40min
B3 三氯乙酸量 第三水平 5%
考虑经济因素 ,三氯乙酸价格较贵 , 加 2%与 5%的量对
RNA得率差别不大 , 所以通常加 2%的沉淀剂。
2.2.2 破壁时间的确定
基于正交实验的结果 , 考虑破壁时间的影响 , 做补充实
验:采用酵母质量分数 10%, 氨 1.0%, 在 60℃分别破壁
30min、40min、50min , 加 2%三氯乙酸 , 用H2SO4 调蛋白等电点
4.2 , 离心去杂蛋白 ,再提取。结果见表 5
表 5
时间
(min)
得率
(%)
纯度
(%)
净得率
(%)
2.22 30 2.32 95.6
2.70 40 3.22 83.7
4.31 50 4.90 88.0
提取核酸后得上清液 ,核酸含量测定如表 6:
表 6
时间 A260 A280 A260/A280 RNA%(g/ 100mL)
30min 0.106 0.05 2.08 2.22
40min 0.118 0.06 1.97 2.70
50min 0.130 0.065 1.54 4.31
由以上两表可以看出 , 破壁 50min 时核酸产量最多 , 上
清液中杂质多 ,残留的核酸液多 , 可知破壁时间长 ,核酸溶出
多 ,同时其他杂蛋白也较多溶出 , 从核酸中的百分含量也可
以看出 50min最好。若破壁时间短 , 虽然核酸纯度高 , 上清
液中核酸残留量少 , 但最终百分含量低 ,所以不可取;若时间
过长 ,其他杂质溶出量大于核酸溶出量 , 影响核酸的等电点
提取 ,所以也不可取 ,综上可得 , 氨解法破壁时间为 50min 时
最佳。
2.3 两种方法的比较
表 7
方法 氨解法 浓盐法
条件
10%酵母液 , 氨 1.0%,
60℃破壁 50min , 分步调
等电点除蛋白
酵母浓度 10%,盐 10%于
90-95℃抽提 4h
结果 得率>3%,纯度>80% 得率>2%,纯度>70%
优缺点
时间短 , 温度低 , 氨需量
少 , 但对酵母有选择性 ,
氨对人体有刺激作用
时间长 , 温度高 , 适用于
任何酵母
3 结论
3.1 核糖核酸定性定量的测定采用紫外分光光度法 , 操作
简单方便 , 误差小。
3.2 本实验制备的虽然不是活性核酸 ,本实验制备的虽然
不是活性核酸 , 但也要防止核酸的分解。因为小分子物质难
于提取。回收上清液要重新利用时 , 立即将 pH 调为 7 , 以防
止酸性条件下核酸分解成小分子物质。
3.3 两种方法各有优缺点 , 仅从 RNA 得率和纯度来看 , 氨
解法略优于浓盐法。
[ 参考文献]
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49.
STUDY ON EXTRACTING RNA FROM BREWING YEAST
ZHANGShuai
(Department of Light Industry &Chemistry , Zhaoqing University Zhaoqing 526061 , China)
ABSTRACT:Two processing method of extracting RNA from brewing yeast was studied , that is high concentration saline method &ammonia
analyzation method , the latter was studied mainly.the best processing conditions were both obtained , then the two method were compared.
KEY WORDS:Brewing Yeast , RNA , Salt , Ammonia
·68· 酿 酒 2005