全 文 ：利用 psbA-trnH片段鉴定罗汉果和山药破壁草本
郑夏生1，2，赖智填1，成金乐1* (1．国家中医药管理局中药破壁草本技术与应用重点研究室，中山市中智药业集团有限公司，广东
中山 528437;2．中国中医科学院中药研究所，北京 100700)
摘要 ［目的］解决罗汉果和山药破璧草本 DNA提取困难，而无法用分子生物学鉴定的问题。［方法］通过比较常用 DNA提取试剂盒法
和改良的 CTAB法，利用 psbA-trnH片段鉴定罗汉果和山药破壁草本。［结果］改良的 CTAB法可从罗汉果和山药的药材、破壁粉末和破
壁草本 3种形态中成功地提取出基因组 DNA，并可进一步利用 DNA条形码的 psbA-trnH片段进行分子鉴定。［结论］该方法稳定可行，
可用于罗汉果和山药的药材、破壁粉末和破壁草本的 DNA条形码鉴别。
关键词 罗汉果;山药;破壁草本;DNA条形码
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2016)06 －163 －04
Identification of Ultra-fine Granular Powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA by psbA-trnH Fragment
ZHENG Xia-sheng1，2，LAI Zhi-tian1，CHENG Jin-le1* (1． The Key Laboratory of Technology of Breaking Cell Wall and Application in Chi-
nese Medicine Decoction Pieces，Zhongshan Zhongzhi Pharmaceutical Group，Zhongshan，Guangdong 528437;2． Institute of Chinese Materia Medi-
ca，Chinese Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700)
Abstract ［Objective］To solve the problems of difficult extraction of DNA extraction from ultra-fine granular powers of SIRAITIAE FRUCTUS
and DIOSCOREAE RHIZOMA．［Method］Ultra-fine granular powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA were identified by
psbA-trnH fragment by comparing the traditional DNA extraction kit and improved CTAB method．［Result］The improved CTAB method could
successfully extract the medicinal materials，ultra-fine powders and ultra-fine herbs of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA． ps-
bA-trnH fragment in DNA barcode was used for molecular identification．［Conclusion］This method is stable and feasible，and can be used for the
DNA barcode identification of medicinal materials，ultra-fine powders and ultra-fine herbs of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZO-
MA．
Key words SIRAITIAE FRUCTUS;DIOSCOREAE RHIZOMA;Ultra-fine granular power of Chinese Herbal Medicine;DNA barcode
作者简介 郑夏生(1987 － ) ，男，广东揭阳人，博士，从事药用植物分子
生物学研究。* 通讯作者，教授，博士生导师，从事中药质
量研究。
收稿日期 2016-01-22
草晶华破壁草本由广东省中药破壁粉粒工程技术研究
开发中心(依托中山市中智药业集团有限公司)开发，是利用
现代粉碎技术将传统中药饮片深加工成 D90 ＜ 45 μm(300目
以上)的粉体，再通过无固体添加成型技术制成的干燥颗粒
状饮片(30 ～100目)［1］。与传统饮片相比，经过细胞破壁后
破壁草本的有效物质溶出率更高［2 －3］。破壁后药材的颗粒
粒径非常小，失去了绝大多数的显微特征，增加了其物种鉴
定的难度。
DNA条形码是通过基因组中一段公认的、相对较短的
DNA序列来进行物种鉴定的生物技术，具有快速、准确、重复
性高等优点［4］。Chen等［5］通过对近万份药用植物样本进行
DNA条形码筛选，提出一条药用植物基因鉴定思路，即以
ITS2作为标准 DNA 条形码，以 psbA-trnH 作为辅助 DNA 条
形码［6］。DNA条形码不仅可以从基因水平解决中药材与混
伪品的物种识别问题，同时也可用于建立中药材二维 DNA
条形码流通监管体系，为中药材流通监管提供有力的技术
支持［7］。
罗汉果为葫芦科植物罗汉果 Siraitia grosvenorii (Swin-
gle．)C． Jeffrey ex A． M． Lu et Z． Y． Zhang 的干燥成熟果实。
山药为薯蓣科植物薯蓣 Dioscorea opposita Thunb． 的干燥根
茎。笔者所在课题组前期研究发现这 2 个品种的药材和破
壁草本均无法按照常规的试验方法进行 DNA 条形码鉴别。
原因可能是由于 DNA提取困难，导致后续的 PCR失败。笔
者利用 psbA-trnH片段鉴定罗汉果和山药破壁草本，克服了
这 2个品种的 DNA提取困难，并成功进行后续的 DNA条形
码鉴别。
1 材料与方法
1． 1 试验材料 草晶华破壁草本均由中山市中智药业集团
有限公司提供，详细信息见表 1。中药饮片经过破壁处理后得
到破壁粉末，再被制备成破壁草本(图 1)。以上药材由中山市
中智药业集团有限公司贾世清中药师鉴定，凭证标本保存于国
家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室。
表 1 样品信息
Table 1 Sample information
编号
Code
样品
Sample
批号
Batch number
LHG1 罗汉果饮片 20140601
LHG2 罗汉果破壁粉末 20140601
LHG2 罗汉果破壁草本 20140601
SY1 山药饮片 20140701
SY2 山药破壁粉末 20140701
SY3 山药破壁草本 20140101
1． 2 试验方法
1． 2． 1 样品前处理。①传统饮片:用灭菌的解剖刀切取约
0． 1 g，切碎，置于陶瓷研钵中，加入等量的 PVP-40，用力研磨
粉碎，称取 0． 1 g用于 DNA提取。②破壁粉末:直接称取样
品 50 mg用于 DNA提取。③破壁草本:分别称取各样品 50
mg，置于 2． 0 mL离心管中，加入 2颗Φ 5 mm的灭菌钢珠，用
生物样品均质仪(爱施德，Bioprep-24)以 6． 0 m/s 振荡 30 s，
重复振荡 2次，每次间隔 30 s，使样品变成粉末状，即可用于
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2016，44(6) :163 － 166 责任编辑 李占东 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.06.055
DNA提取。
1． 2． 2 DNA提取。①试剂盒法:按照新型快速植物基因组
DNA提取试剂盒(百泰克，DP3111)说明书操作。②改良
CTAB法:向各样品管中加入 800 μL CTAB free 缓冲液(100
mmol /L Tris-HCl，20 mmol /L EDTA，1． 4 mol /L NaCl) ，剧烈振
荡，旋转混匀 5 min，13 000 r /min离心 3 min，弃上清液;重复
该步骤 1 ～2 次。向各样品管中加入 800 μL CTAB 缓冲液
(3% CTAB，100 mmol /L Tris-HCl，20 mmol /L EDTA，1． 4
mol /L NaCl) ，充分振荡混匀，65 ℃金属浴中孵育 3 h，期间每
隔 10 min左右颠倒混匀数下。加入 600 μL 氯仿 －异戊醇
(24∶ 1，V∶ V) ，充分振荡混匀，静置5 min，13 000 r /min离心15
min，小心吸取上清于新的 1． 5 mL离心管中。加入等体积 －
20 ℃预冷的异丙醇，－ 20 ℃放置 10 min，13 000 r /min离心
15 min，弃上清。加入 800 μL －20 ℃预冷的 75%乙醇，上下
颠倒混匀数次，13 000 r /min离心 15 min，重复 1次。弃尽上
清，打开离心管盖子室温晾干 5 min，加入 50 μL 65 ℃预热的
ddH2O，小心吹打沉淀，将可溶部分转移至新的离心管中。取
适量 DNA用于质量检测，其余的置于 －20 ℃保存，备用。
1． 2． 3 DNA质量检测。取5 μL DNA，加45 μL ddH2O，混合
均匀。以 ddH2O为空白对照，用紫外分光光度计测定 OD260
和 OD280，通过计算 OD260 /OD280评价 DNA质量。
另取 5 μL DNA，加 1 μL 6 × DNA Loading buffer，混合
均匀。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测条带，评价 DNA完整度。
1． 2． 4 PCR 扩增和测序。PCR 反应体系:2 × Power Taq
PCR MasterMix(百泰克，PR1701)12． 5 μL，正反向引物(psbA
_F:GTTATGCATGAACGTAATGCTC，trnH_R:CGCGCATGGT-
GGATTCACAATCC)各 1． 0 μL，DNA 模板 2． 0 μL，ddH2O 补
足至 25． 0 μL。PCR 反应程序:94 ℃，2 min;94 ℃，30 s，52
℃，20 s，72 ℃，50 s，35个循环;72 ℃，5 min。
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测各 PCR产物，目的区域出现
清晰条带的样品则送样测序。
1． 3 数据处理 利用 CodonCode Aligner(版本:5． 1． 5． 0)分
析测序所得的原始峰图，拼接后去除低质量区和引物区。所
得各样品的 DNA序列分别在 NCBI上进行 BLASTN;在中药
材 DNA条形码鉴定系统(http:/ /www． tcmbarcode． cn /china /
index． php optionid =174)上进行比对，取同源性(Identity)最
高的比对结果。
图 1 试验所用样品
Fig． 1 Sample used in this research
2 结果与分析
2． 1 DNA质量 2种方法提取得到的 DNA，经紫外分光光
度计检测所得的吸光度比值见表 2。由表 2 可知，试剂盒法
提取的 DNA质量较差，OD260 /OD280均与理想值 1． 80 ～ 2． 00
相差较大;而改良 CTAB 法获得的 DNA 质量较好，OD260 /
OD280与理想值 1． 80 ～2． 00 相差较小。
从电泳结果看，试剂盒法未见明显的 DNA条带;而改良
的 CTAB法则可以获得清晰的 DNA 条带(图 1)。综合紫外
分光光度值与电泳结果，说明改良的 CTAB法更适合用于提
取罗汉果和山药的基因组 DNA。
2． 2 序列比对结果 PCR 扩增后，改良 CTAB 法制备的样
品可获得清晰的 DNA 条带，而试剂盒法制备的样品均为阴
性(图 3)。将阳性样品送检测序，发现 6 个样品均为阳性结
果。说明改良的 CTAB 法用于提取罗汉果和山药的基因组
461 安徽农业科学 2016 年
DNA是可靠的。
3种形态的罗汉果样品经过 PCR所得的 psbA-trnH序列
一致(均为 173 bp) ，与中药材 DNA条形码鉴定系统和 NCBI
数据库中罗汉果 Siraitia grosvenorii 的序列(登录号分别为:
HAP00104和 JN406966)同源性达 100%(图 4A) ;3种形态山
药样品的 psbA-trnH 序列也是一致的(均为 208 bp) ，与中药
材 DNA条形码鉴定系统中山药 Dioscorea polystachya的序列
(登录号:HAP00148)同源性达 100%，与 NCBI数据库中山药
的序列(登录号:JQ60354)同源性达 99%(图 4B)。表明 ps-
bA-trnH可用于罗汉果和山药中药破壁草本的物种鉴定。
表 2 2种方法提取得到的 DNA吸光度
Table 2 Absorbancy of DNA extracted by two different methods
样品
Sample
OD260 /OD280
试剂盒法
Kit method
改良 CTAB法
Improved CTAB method
LHG1 1． 18 1． 71
LHG2 1． 23 1． 85
LHG3 1． 07 1． 81
SY1 0． 98 2． 14
SY2 1． 46 2． 14
SY3 1． 37 2． 11
图 2 2种方法提取得到的 DNA电泳结果
Fig． 2 Electrophoresis result of DNA extracted by two different methods
图 3 PCR结果
Fig． 3 PCR results
3 结论与讨论
DNA条形码用于中药相关制品的物种鉴别，具有快速、
高效的特点。该技术主要依靠对样品 DNA条形码的成功扩
增和测序，而前提是要获得足够量和达到一定纯度的基因组
DNA。DNA提取是一门相对成熟的技术，目前已有许多
DNA提取试剂盒被开发出来，用于不同类型样品的 DNA 提
取。然而，这些试剂盒在植物 DNA 提取方面效果较差。因
为植物种类纷繁复杂，且含有多酚和多糖等次生代谢产物，
导致 DNA提取困难甚至失败。中药材主要来源于植物，部
分品种甚至经过高温处理等炮制，更加重了 DNA 提取的困
难。CTAB法是常用的 DNA提取方法，许多学者以该方法为
基础，通过改良部分试验环节或试剂以获得适合于自身研究
的物种［8 －9］。
该研究采用的改良 CTAB法主要有 3处改进:①在药材
粉碎环节采用 PVP-40 与样品一起研磨，一方面可以在未使
用液氮的情况下增加样品的可研磨性，另一方面 PVP-40 可
以与样品中的多酚、萜类物质起络合作用及与多糖结合［10］，
在裂解过程中将这些杂质除去。②采用 CTAB free缓冲液预
处理研磨后的样品粉末［11］，除去色素等杂质。③将 CTAB的
浓度由 2%提高至 3%［12］，同时将裂解条件改进为 65 ℃裂解
3 h(试剂盒法为常温裂解 10 min) ，加强对样品细胞的裂解，
以更大程度地获取 DNA。由此可知，该研究所用的改良
CTAB法可以获得纯度较高、量较多的 DNA。
中药破壁草本是经过细胞破壁处理的一类新型饮片，由
56144卷 6期 郑夏生等 利用 psbA-trnH片段鉴定罗汉果和山药破壁草本
注:A．罗汉果，B．山药。
Note:A was SIRAITIAE FRUCTUS and B was DIOSCOREAE RHIZOMA．
图 4 序列比对结果
Fig． 4 Results of sequence alignment
于失去绝大多数的细胞及组织显微特征，造成物种鉴定困
难。特别是部分中药材，由于药材经过炮制，或者药材自身
包含影响 DNA提取的次生代谢产物，往往导致其 DNA提取
困难，而无法用于分子鉴定。DNA条形码技术近年来在中药
鉴定方面的推广，为破壁草本等粉末或颗粒状中药制品的物
种鉴定提供了技术参考。
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112．
(上接第 69页)
时，紫薯富含硒元素和花青素，营养价值高，是农产品加工的
优质原料，有利于产业化开发。尤其重要的是紫薯种植需要
的化肥量低，病虫害发生比水稻等作物轻微，加之需水量小，
节肥、节药、节水效果显著，符合绿色生态农业生产的发展要
求。发展紫薯生产，对于促进农业产业结构优化升级，推进
高产、优质、高效、生态农业可持续发展具有重要意义。
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