全 文 ：罗汉果组织培养技术的研究进展
罗剑 1 ,蓝群 2＊　(1.广西幼儿师范高等专科学校 ,广西南宁 , 530022;2.柳州师范高等专科学校化学与生命科学 ,广西柳州 545004)
摘要　对罗汉果(MomordicagrosvenoriSwingleC.Jefrey)组织培育的发展过程 ,培养基及激素的种类 ,外植体的种类 , 脱毒苗的获得和病
毒的检测方式等进行了综述 ,以期为罗汉果组培苗的发展提供理论依据。
关键词　罗汉果;组织培养;脱毒苗
中图分类号　S567.23+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2011)04-02100-02
ResearchProgressonTissueCultureTechniqueofMomordicagrosvenoriSwingleC.Jeffrey
LUOJianetal　(GuangxiColegeforPreschoolEducation, Nanning, Guangxi530022)
Abstract　ThedevelopingprocessoftissuecultureofMomordicagrosvenoriSwingleC.Jefrey, kindsofmediumandhormones, kindsofex-
plants, acquiringofvirus-freeseedlingsanddetectionmethodsofviruswerediscussedinthisstudy, aimingatprovidingtheoreticalevidencefor
thedevelopmentoftissuecultureseedlings.
Keywords　MomordicagrosvenoriSwingleC.Jefrey;Tissueculture;Virus-freeseedling
作者简介　罗剑(1973-),男 ,广西南宁人 , 讲师 ,从事植物生理研究。
＊通讯作者。
收稿日期　2010-10-11
　　罗汉果(MomordicagrosvenoriSwingleC.Jefrey)是我国
特有的葫芦科多年生草质藤本植物 ,以果实入药 ,具有止咳
祛痰 、润肠通便之功效。罗汉果以种植雌株为主 ,但种子繁
殖后代中雄株比例偏高 ,因此实际生产中主要采取压蔓等营
养繁殖的方式生产种苗 ,但繁殖系数低 ,且易感病毒病。在
罗汉果主产区广西永福 , 90%以上的罗汉果植株感染病毒
病 ,同时受花叶病毒危害较为严重 [ 1-3] ,病毒在植物体内世
代累积 ,导致品种退化 ,质量下降 ,产量锐减。因此 ,培育无
病毒种苗在生产上成为迫切的要求。罗汉果的组织培养研
究始于 1980年 ,林荣等以罗汉果胚轴 、茎尖等材料为外植
体 ,进行了离体培养的初步研究 ,并初步获得成功 [ 4-5] 。笔
者就近年来罗汉果组培菌及脱毒技术的研究进展进行综述。
1　培养基的种类和成分
目前对罗汉果的组培的研究多以 MS为基本培养基 ,琼
脂浓度为 0.35%～ 0.70%, pH值为 5.8 ～ 6.0,蔗糖为 30.00
g/L;激素种类和使用浓度为 0.10 ～ 1.00 mg/LIAA、0.50 ～
1.00mg/L6-BA、0.20mg/LIBA和 0.20 mg/LNAA。苏明申
等在罗汉果培养愈伤组织诱导过程中使用了 1.50 mg/L的
2, 4-D和 0.50 mg/L的 KT,也取得较好的效果 [ 6-8] 。
蔡时可等研究表明 ,在增殖培养中添加 0.20 mg/L的
IBA有利于罗汉果腋芽的重新诱导和生长 ,而添加 0.20
mg/L的 NAA则不利于腋芽的诱导和生长 ,但有利于愈伤组
织的产生 [ 9] 。杭玲等在生根培养基中加入 0.50 mg/L的
IBA,使组培苗生长健壮 ,根系发达 ,移栽成活率高 [ 10] 。黄燕
芬用 0.10 mg/L的 IBA为增殖培养基 ,使增殖倍数达 8.5[ 7] 。
周祖富等用 0.01 mg/L的 S-3307使罗汉果组培苗植株矮
化 、根茎粗壮 、叶片增厚 [ 11-12] 。解剖学观察表明 ,与 CK相
比 ,添加 S-3307的培养基培养的罗汉果幼苗其根 、茎细胞
明显缩短增粗 ,细胞层数增加 ,其叶片栅栏组织细胞变长 ,海
绵组织细胞宽度增大。
梁春秀等在加入不同种类及浓度激素的 MS基本培养
基上进行罗汉果继代培养和生根试验筛选出罗汉果继代培
养的较优配方为:MS基本培养基 +0.10 mg/L6-BA+0.01
mg/LNAA+30.00g/L白糖 +5.00g/L琼脂粉 [ 13] ;适宜的生
根配方为:MS基本培养基 +0.10 mg/LNAA+30.0 g/L白糖
+5.00g/L琼脂粉;用其培养罗汉果生根率达到 94.73%,移
栽成活率高达 97.78%。秦新民等通过研究外植体苗龄 、激
素组合等因素对罗汉果离体繁殖的影响 ,建立了罗汉果高效
再生系统 , 3 ～6天内 ,子叶不定芽的分化率随着苗龄的增加
而增加 ,第 6天的子叶出芽效果最好(83.3 %),随后不定芽
分化率逐渐下降 [ 14] 。 BA和 IBA不同浓度组合对子叶不定
芽诱导的影响表明 ,在 MS+1.00mg/LBA+0.50 mg/LIBA
+3.00%蔗糖 +0.65 %琼脂(pH=5.8)培养基中 ,子叶外
植体不定芽的诱导率达 85.7%;在 1/2 MS+1.00 mg/LIBA
液体培养基中无菌苗生根率可达 91.7%。抗生素敏感性试
验表明 ,在培养基中添加 10.00和 20.00 mg/ L的潮霉素能
完全抑制不定芽和不定根的分化 。蒋水元等则提出了 5种
培养基参考配方 [ 15] ,即茎段诱导培养配方:MS+0.50 ～ 1.00
mg/LBA+0.05 ～ 0.10 mg/LIAA(NAA)+3.00 %白糖 +
4.50g/L琼脂(pH=5.8);茎尖诱导培养配方:MS+0.50 ～
1.00mg/LBA+0.05～ 0.10 mg/LNAA+100 ml椰子水 +白
糖 3.00%+琼脂 4.50mg/L(pH=5.8);继代培养(丛生芽方
式)配方:MS+0.30 ～ 0.70 mg/LBA+0.05 mg/ LNAA+
0.10mg/LIAA+3.00%白糖 +4.50mg/L琼脂(pH=5.8);
继代培养(微型扦插方式配方):MS+0.10 mg/LBA+0.30
mg/LIAA+0.07g/L活性炭 +3.00%白糖 +4.50mg/L琼脂
(pH=5.8);生根培养配方:MS+0.07mg/LBA+0.15mg/L
IBA+0.10mg/LIAA+0.10g/L活性炭 +3.00%白糖 +4.50
mg/L琼脂(pH=5.8)。付长亮等 [ 3]研究指出罗汉果组织培
养常用的培养基(表 1)。
2　接种外植体的种类
2.1　胚　林荣等将罗汉果无菌苗胚轴 、子叶接种到 MS+
1.00mg/LBA+0.50 mg/LIAA(或 0.50 mg/LIBA)培养基
上 [ 4] ,结果表明 ,胚轴 、子叶都能诱导出愈伤组织 ,但生成的
愈伤组织进一步分化成芽的能力各异 ,上胚轴和子叶分化成
芽的频率较低 ,而下胚轴形成芽的频率较高 ,且形成丛生芽 。
2.2　叶　1981年林荣以罗汉果主栽品种青皮果无菌苗的叶
片为材料 ,对细胞分裂素及与生长素不同组合对芽形成的影
响进行了研究。结果表明 , BA与 KT均能诱导叶片产生愈伤
责任编辑　刘群燕　责任校对　况玲玲安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2011, 39(4):2100-2101, 2104
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.04.199
组织 ,但在愈伤分化生成芽的过程中 BA是必需的 , MS+
1.00mg/LBA+0.50 mg/LIBA组合效果最好 ,形成芽的频
率达到 92%,生成丛生芽的数目较多 [ 16] 。桂耀林等的研究
表明 ,罗汉果叶片较易诱导愈伤组织 ,但只有在加入 1.00
mg/LBA+0.50 mg/LIBA的 MS培养基中生成愈伤组
织 [ 17] 。宋鹏飞等在 MS十 1.00mg/LBA+0.70mg/LIBA培
养基中培养周愈伤组织 ,其诱导率达 90.0%以上 ,可进一步
在此培养基上诱导生成小植株 [ 18] 。苏明申等 [ 6]以罗汉果秋
季老叶和新生嫩叶为材料 ,分别接种到愈伤与增殖培养基:
MS+1.00 mg/LBA+0.10 mg/L2, 4-D和 MS+2.00 mg/L
BA+0.20 mg/L2, 4-D,结果表明 ,叶柄诱导愈伤组织率较
高 ,叶片诱导愈伤组织能力较弱 ,其中幼叶较老叶诱导愈伤
组织能力强 ,老叶很难诱导愈伤组织 [ 6] 。
表 1　罗汉果组织培养常用的培养基组成及用途
Table1　CombinationandusageofcommonculturemediumforM.
grosvenoritissue
培养基与激素组合Culturemediumandhormonecombination
用途Usage
MS+0.50mg/LBA+0.50mg/LIBA 诱导叶片生成愈伤组织并分化成芽
MS+1.00mg/LBA+0.10mg/L2, 4-D诱导叶片生成愈伤组织
MS+0.10mg/LBA+0.10mg/LIAA 茎尖分生组织为外植体培养脱毒苗
MS+0.50mg/LBA+0.10 mg/LIAA+0.10mg/LIBA 继代培养和茎段增殖
MS+0.10～ 0.50mg/LNAA 诱导试管苗生成不定根
MS+0.10～ 0.50mg/LIBA 诱导试管苗生成发达的根系
2.3　茎段　周琦丽等以长滩果无菌苗带节茎段为材料 ,培
养在 MS+0.10 mg/LBA+0.10mg/LIBA培养基中 ,生成了
白色疏松的愈伤组织 ,对培养不同时间的愈伤组织切片观察
表明 ,愈伤组织可进一步分化 ,但较难生成芽 [ 8] 。黄燕芬等
用茎段培养罗汉果也取得得成功 [ 7] 。
2.4　茎尖分生组织　林治良等的研究结果表明 [19] ,离体培养
的罗汉果茎尖越小 ,脱毒效果越好 ,但越不易成活 ,成苗时间也
越长。小于 1.0 mm的茎尖脱毒率为 100.0%,需 7周才能出
苗;0.1 ～0.2mm茎尖成活率约为 65.0%,培养 17周才能成苗。
杭玲等将罗汉果的无菌苗茎尖分生组织接种到 MS+
1.00mg/LBA+0.10 mg/LIAA+0.35%琼脂 +3.00%蔗糖
(pH=5.8)的培养基上培养 [ 10] ,当茎尖小于 0.5mm时 ,培养
20天生出绿苗 , 50天左右形成正常植株 ,成活率只有 50.0%
左右;当茎尖为 1.0 mm时 , 10天即可诱导出绿苗 , 30天左右
可以形成小植株 ,成活率达 100.0%,脱毒率也达到 100.0%;
当茎尖超过 1.0 mm,脱毒率下降。因此 ,选择 1.0 mm的茎
尖能达到脱毒的目的 ,还能缩短培养时间 ,加快成苗率 。
3　脱毒苗的获得和病毒的检测
3.1　脱毒苗的获得方式　林治良等 [ 19]和杭玲等 [ 10]的研究表
明 ,取 0.5 ～1.0 mm罗汉果茎尖 ,在 MS+0.10～ 0.50mg/LBA
+0.10mg/LNAA培养基中培养 ,可以在较短时间内诱导出绿
苗 ,且形成的愈伤组织少 ,成苗率高 ,正常条件下培养试管苗脱
毒率达到 100.0%,效果最好。在培养基中加入 0.5mg/LIBA
能使组培苗生长健壮 ,根系发达 ,移栽成活率高。
3.2　脱毒苗病毒的检测　脱毒处理的罗汉果试管苗须经严
格检测 ,证明没有病毒粒体存在后 ,才能作为脱毒苗。目前
脱毒苗的病毒检测方法主要有以下 3种。
3.2.1　直接检测法。对脱毒处理得到的罗汉果试管苗移栽
后与感染花叶病毒的植株进行植物形态比较 ,脱毒的种苗应
生长健壮 、无花叶病毒特有的可见症状。
3.2.2　指示植物法。以黄瓜作为指示植物 ,脱毒处理的罗
汉果组培苗隔离土培 2个月后 ,将未出现染病症状的植株的
叶片与明显染病植株的叶片用擦液法接种于黄瓜 ,一段时间
后观察无病叶接种的黄瓜是否有病毒症状从而鉴定相应植
株是否脱毒 。
3.2.3　电镜观察病毒和叶片的游离氨基酸检测法。利用电
子显微镜直接观察 、检查有无病毒颗粒存在以及颗粒大小 、
形态和结构 ,借以鉴定病毒种类。以上 3种罗汉果病毒的检
测方法都存在一定的不足:直接检测法和指示植物法操作方
便简单 ,但不能做到快速检测 ,且灵敏度有限 ,可信度不高。
对无毒苗和有毒苗叶片的游离氨基酸进行检测 ,林治良等的
研究结果表明 ,无毒苗和有毒苗的游离氨基酸的含量差异达
到显著水平 [ 13] 。
近些年发展的酶联免疫法(ELISA)及 RTPCR等病毒检
测方法具有灵敏 、快速和特异性强等优点 ,在脱毒苗检测中
应用较多 [ 20] ,但目前在罗汉果脱毒苗中的应用较少。秦碧
霞已经建立了罗汉果花叶病毒(WMV2Luo)ELISA技术的检
测方法 [ 21] 。
4　罗汉果组培苗的质量评价
罗汉果组培苗是在实验室培育的无菌脱毒苗 ,比用种薯
繁殖的幼苗弱 、小 ,不能直接用于大田栽培 ,必须经过营养杯
培育后才能移植栽培 。根系发育好 ,茎粗壮 ,真叶 6 ～ 8片 ,
叶片深绿 、肥厚 ,才能有较高的成活率和挂果率 [ 22] 。
5　小结
前人对罗汉果的组培研究已取得很大的进展 ,已有的研
究表明 ,用 0.5 ～1.0 mm茎尖作外植体培养效果较好;以 MS
为基本培养基 ,加入浓度为 0.35%～ 0.70%和浓度为 2.00%
～3.00%的琼脂和蔗糖 , pH值为 5.8 ～ 6.0,培养温度为 25 ～
27℃,光照强度为 800 ～ 1 500lux,光照时间为 10 ～ 12 h/d,
培养效果最好。
在组培苗的研究基础上 ,罗汉果的脱毒技术也取得了成
功 ,在广西桂林主要产区已有大量的种植 ,但是还存在不少
问题 ,主要表现在脱毒不彻底 、种植成活率低 、种薯腐烂 、生
长不稳定及产量起伏较大等问题 [ 23] 。永福县种植罗汉果脱
毒苗的成功率不足 30.0%,严重挫伤了果农栽种脱毒苗的积
极性 [ 24-25] 。因此 ,要加强脱毒苗的规范管理和严格的病毒
检测 ,同时还要加强通过基因工程技术将抗病 、抗逆等相关
基因转到罗汉果脱毒苗中 ,提高它的抗病 、抗逆能力 ,从而提
高它的产量 。
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(下转第 2104页)
210139卷 4期　　　　　　　　　　　　　　　　　罗 剑等　罗汉果组织培养技术的研究进展
图 2　样品色谱
Fig.2　HPLCChromatogramofsample
制备 6份供试品溶液 ,按 “1.4”色谱条件测定含量并计算。
样品平均含量为 2.769 mg/g, RSD=2.43%(n=6, RSD<
5.00%),表明该法重现性良好。
2.5　加样回收率试验　精确称定已知绿原酸含量的杜仲叶
粉末 0.54 g(绿原酸含量为 2.772mg/g),分别准确加入绿原
酸对照品 0.620 8 mg,按 “1.6”方法制备供试品溶液 ,按
“1.4”色谱条件测定含量 ,计算加样回收率 ,结果见表 1。由
表 1可知 ,平均回收率为 100.72%, RSD=1.50%。
2.6　样品含量测定　根据上述色谱条件对 10份样品进行
含量测定 , 利用回归方程 Y=1.488 9X+13.005 (r=
0.999 2)计算绿原酸含量 ,结果见表 2。由表 2可知 ,四倍体
杜仲叶片中绿原酸的平均含量为 4.005 mg/g,二倍体杜仲叶
片绿原酸的平均含量为 0.850mg/g。
　　利用 DPS软件中 LSD法对表 2中数据进行多重分析 ,结
果表明 ,四倍体杜仲叶片中的绿原酸含量显著高于二倍体杜
仲叶片的绿原酸含量。
3　结论
(1)四倍体杜仲叶片中的绿原酸含量显著高于二倍体杜
仲叶片的绿原酸含量 ,二倍体含量是 0.730、0.969 mg/g,四
倍体含量是 2.424～ 6.217mg/g。
(2)该试验采用HPLC法测定杜仲叶片中绿原酸的含
量 ,结果准确 ,精密度 , 重复性好 ,平均加样回收率为
100.72%, RSD=1.50%。
表 1　绿原酸加样回收率
Table1　Chlorogenicacidrecoveries
样品含量∥mgContentofthesample
实测量mgMeasuredconcentration
回收率∥%Recoveryrate
平均回收率∥%AverageRecoveryrate
相对标准偏差 RSD∥%Relativestandarddeviation
1.482 5 2.077 2 98.76 100.72 1.50
1.467 0 2.132 3 100.94
1.484 3 2.124 9 102.13
1.468 6 2.134 3 102.15
1.460 5 2.073 2 99.61
　　(3)对流动相进行比较 ,采用不同比例的甲醇 -水 、甲醇
-磷酸 -水 、乙腈 -水 、乙腈 -磷酸 -水等系统 ,结果以乙腈
-磷酸 -水(10.0∶0.4∶90.0)的较好 ,保留时间适中 ,绿原酸
能与非被测成分基线分离。
表 2　不同基因型杜仲叶片绿原酸含量
Table2　chlorogenicacidcontentofdifferentgenotypeseucommialeaf
品系
SampleNo.
染色体倍数Chromosomenumbers
绿原酸含量∥mg/gChlorogenicacidcontent
1 四倍体 2.942
2 四倍体 2.900
3 四倍体 2.424
4 四倍体 3.245
5 四倍体 5.876
6 四倍体 6.217
7 四倍体 4.608
8 四倍体 3.827
9 二倍体 0.969
10 二倍体 0.730
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