全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用
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2011年 第36卷 第12期
为十字花科植物菘蓝的干燥叶[1]，常用作清
热解毒中药。靛蓝和靛玉红是大青叶的主要有效
收稿日期：2011-05-19
基金项目：国家十二五科技支撑课题项目(2011BAD34B03)；青岛农业大学自然科学类重点项目(610608)。
作者简介：吕海涛(1968—)，男，山东烟台人，博士，教授，研究方向为天然产物化学及其应用。
成分。靛蓝主要用于食品、医药和日用化妆品的
着色，靛玉红具有抗菌抗炎、抗肿瘤、增强免疫
吕海涛1，刘 静1，单 虎2，房晓琳1
(1.青岛农业大学化学与药学院，青岛 266109；
2.青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109)
摘要：探讨了有机溶剂提取大青叶中靛蓝和靛玉红的生产工艺。考察了浸提法、回流法、超声
波法和微波法4种提取方法，结果表明，回流法提取效果最好。采用单因素和正交实验考察了甲
醇浓度、水浴温度、提取时间、料液比和提取次数对靛蓝和靛玉红得率的影响，最佳提取工艺
为：80%甲醇溶液，水浴66 ℃，料液比1:30，每次提取1.0 h，提取4次。在此优化条件下，大青
叶中靛蓝和靛玉红的得率分别达到2.088 mg/g和0.370 mg/g。
关键词：大青叶；靛蓝；靛玉红；回流法；正交实验
中图分类号：R 284.2 文献标志码： A 文章编号：1005-9989(2011)12-0246-05
The optimization of extracting indigo and indirubin from Dyers woad
leaves by orthogonal experiment
LV Hai-tao1, LIU Jing1, SHAN Hu2, FANG Xiao-lin1
(1.College of Chemistry & Pharmacy, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109;
2.Department of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao
266109)
Abstract: The extract technology of indigo and indirubin from Dyers woad leaves was investigated in
this paper. Using four extracting methods, such as organic reagent extraction, heating circumfluence
extraction, ultrasonic extraction and microwave extraction, indigo and indirubin were extracted by
methanol solvent. Among them, heating circumfl uence extraction method was the best method. Single
factor and orthogonal design L16(4
5) in the experiment of heating circumfl uence extraction were chosen
to research the best procedure. The optimum conditions were: 80% methanol solution, 66 ℃ water bath
temperature, 1:30 of material and liquid ratio, 1.0 h extraction time and extracted 4 times. The yield of
indigo and indirubin under the optimum conditions were 2.088 and 0.370 mg/g, respectively.
Key words: Dyers woad leaves; indigo; indirubin; heating circumfl uence extraction; orthogonal experiment
正交实验法优选大青叶中靛蓝和
靛玉红的提取工艺
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2011.12.006
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力等作用[2]。董娟娥[3]、彭文进[4]对靛蓝、靛玉红
含量的测定方法进行了报道，谢国祥[5]、余陈欢[6]
报道了提取靛玉红的工艺研究，但尚未见从大青
叶中同时提取靛蓝和靛玉红的系统研究报道。本
文采用单因素和正交实验设计，以靛蓝、靛玉红
总含量为考察指标，考察影响靛蓝和靛玉红提取
率的因素，优选最佳提取工艺条件，并对靛蓝、
靛玉红的稳定性进行了初步的探讨。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪；G1315B-DAD
检测器；Cascada超纯水系统Pall Corporation；
AR2140电子分析天平：上海奥斯豪国际工贸公
司；AE240梅特勒电子天平；SHB-B88型循环水
式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；HH-S
数显恒温水浴锅：金坛市金城国运实验仪器厂；
RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；
KQ3200DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪
器有限公司；日本岛津UV-1601型紫外分光光度
计；DZX-1型真空干燥箱：上海福玛实验设备有
限公司。
大青叶(Folium Isatidis)：青岛城阳当地药店，
产地安徽沪谯，经青岛农业大学辛华教授鉴定为
蓼科植物蓼蓝的干燥叶。靛蓝、靛玉红对照品购
自中国药品生物制品检定所(靛蓝对照品批号：
110716-200610，纯度>98%；靛玉红对照品批
号：110717-200204，纯度>98%)。
无水乙醇、甲醇和乙酸乙酯：分析纯，莱阳
市康德化工有限公司；冰醋酸：色谱纯，天津市
津东天正精细化学试剂厂；甲醇：色谱纯，济南
市化工研究所。
2 方法与结果
2.1 检测波长的选择
利用日本岛津紫外分光光度计，将靛蓝、靛
玉红标准品分别用氯仿溶解，水浴锅66 ℃中回流
0.5 h自然冷却得到的标准品溶液，在220~400 nm
波长范围内得到靛蓝、靛玉红的紫外吸收光谱
图，见图1。靛蓝最大吸收波长为286 nm，靛玉红
的最大吸收波长为292 nm，由于大青叶中靛蓝的
含量高于靛玉红，因此确定检测波长为292 nm。
2.2 色谱条件的选择
由于大青叶提取样品成分复杂，杂质峰较
多，比较了不同比例的甲醇-水、甲醇-冰乙酸-水
体系做流动相和用不同的溶剂溶解样品提取物对
分离的影响。确定最佳色谱条件为：Eclipse XDB-
C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相:甲
醇:水:乙酸=55:44.55:0.45(v/v/v)，柱温：30 ℃，流
速：1.0 mL/min，检测波长：292 nm，进样量：20
μL。在该色谱条件下，靛蓝和靛玉红与其他杂质
图2 靛蓝和靛玉红的HPLC色谱图
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注：(a)-靛蓝；(b)-靛玉红。
图1 靛蓝和靛玉红的紫外光谱图
注：(a)-对照品；(b)-样品；1-靛蓝；2-靛玉红。
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峰达基线分离，色谱图见图2。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取靛蓝和靛玉红对照品适量，加甲
醇溶解，制成116.00 μg/mL的靛蓝对照品溶液和
44.00 μg/mL的靛玉红对照品溶液。
2.4 标准曲线的绘制及样品的测定
取116.00 μg/mL的靛蓝和44.00 μg/mL的靛
玉红对照品，用纯甲醇配制一系列混合标准品
溶液，靛蓝和靛玉红浓度分别为3.625、7.25、
14.50、29.00、58.00 μg/mL和0.6875、1.375、
2.75、5.50、11.00、22.00 μg/mL，通过高效液相
色谱分离测定，以峰面积A为纵坐标，靛蓝和靛
玉红浓度(c，μg/mL)为横坐标，标准曲线分别为
A=1.74c+2.70和A=97.09c+34.95，相关系数分别为
0.9999和0.9997，线性范围分别为3.60~116.00 μg/
mL和0.69~44.00 μg/mL，检出限分别为0.24 μg/
mL和0.03 μg/mL。
2.5 单因素法提取靛蓝和靛玉红
2.5.1 提取方法的选择 称取干燥(烘箱50 ℃)至
恒重的大青叶粉末1.00 g，分别采用回流法、浸
提法、超声波法和微波法提取大青叶中的靛蓝和
靛玉红。(1)回流法：100%甲醇、料液比1:20、
提取0.5 h、水浴66 ℃。(2)浸提法：100%甲醇、
料液比1:20、提取0.5 h、水浴50 ℃。(3)超声波
法：100%甲醇、料液比1:20、提取0.5 h、水浴
50 ℃、超声波功率150 W。(4)微波法：100%
甲醇、料液比1:20、提取10 min、微波功率800
W、微波温度66 ℃。
提取液经旋转蒸发仪真空浓缩至干，用流动
相溶解，过滤，滤液定容至50 mL，避光低温保
存，用HPLC检测靛蓝和靛玉红的含量。回流法、
浸提法、超声波法和微波法4种方法提取的靛蓝含
量分别为1.791、1.397、1.504、1.806 mg/g，提取
的靛玉红含量分别为0.330、0.248、0.286、0.306
mg/g。回流法对靛玉红提取量明显超过其他方
法，对靛蓝提取量与微波法相近。因此，本实验
确定的提取方法为加热回流法。
2.5.2 提取条件的选择 以料液比1:20、提取0.5
h、提取1次，水浴66 ℃为固定条件，提取试剂分
别为甲醇、乙醇和乙酸乙酯，提取的靛蓝分别为
1.791、0.730和0.661 mg/g，提取的靛玉红分别为
0.330、0.134、0.155 mg/g。表明甲醇有利于靛蓝
和靛玉红的提取。
以料液比1:20、提取0.5 h、提取1次、水浴
66 ℃为固定条件，甲醇浓度分别为40%、60%、
80%和100%进行提取，提取的靛蓝分别为0.279、
1.052、1.685 mg/g和1.791 mg/g，提取的靛玉红分
别为0.026、0.107、0.300、0.330 mg/g。表明甲醇
溶液浓度越高，越有利于靛蓝和靛玉红的提取。
以料液比1:20、提取0.5 h、提取1次、100%
甲醇为固定条件，提取水浴温度分别为66、70、
80、90 ℃，提取的靛蓝分别为1.791、1.872、
1.786、1.685 mg/g，提取的靛玉红分别为0.330、
0.334、0.322、0.306 mg/g。表明水浴温度过高不
利于靛蓝和靛玉红的提取。
以100%甲醇溶液、甲醇用量1:30、提取1
次、水浴70 ℃为固定条件，提取时间分别为
0.5、1.0、1.5、2.0 h，提取的靛蓝分别为1.872、
1.900、1.840、1.717 mg/g，提取的靛玉红分别为
0.334、0.337、0.316、0.306 mg/g。结果表明，随
提取时间的延长，靛蓝和靛玉红的含量逐渐提
高，但时间过长，靛蓝和靛玉红的含量反而会
下降。
以100%甲醇溶液、提取0.5 h、提取1次、
水浴70 ℃为固定条件，料液比分别为1:10、
1:20、1:30和1:40时进行提取，提取的靛蓝分别为
1.788、1.900、1.912、1.918 mg/g，提取的靛玉红
含量为0.207、0.337、0.343、0.329 mg/g。表明甲
醇用量越多，越有利于靛蓝和靛玉红的提取。
以100%甲醇溶液、甲醇用量1:30、提取1.5
h、水浴70 ℃为固定条件，提取次数分别为1、
2、3、4次，提取的靛蓝分别为1.912、1.946、
1.972、1.992 mg/g，提取的靛玉红含量分别为
0.343、0.353、0.361、0.364 mg/g。结果表明，
随提取次数的增加，靛蓝和靛玉红的含量逐渐
提高。
2.6 回流法提取靛蓝和靛玉红的正交实验方案
设计
为了考察回流法提取靛蓝和靛玉红的最佳工
艺条件，根据单因素实验结果，选取甲醇浓度、
水浴温度、提取时间、甲醇用量、提取次数5个因
素进行正交实验(表1)，实验结果见表2，方差分析
结果见表3。
以靛蓝靛玉红的总含量为指标，直观分析结
果表明各因素对测定结果的影响顺序是D＞B＞A
＞E＞C，即甲醇用量和水浴温度对总含量的提取
率影响最大，其次为甲醇浓度和提取次数，提取
时间影响最小。最佳提取条件为A2B1C4D4E4。
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表3 总含量方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 0.203 3 0.976
3.290 P<0.05
B 0.314 3 1.510
C 0.044 3 0.212
D 0.406 3 1.952
E 0.073 3 0.351
误差 1.04 15
由方差分析表3可知，从统计学的角度而言，
各提取条件对靛蓝、靛玉红含量都没有显著性影
响，以经济有效、合理利用、效率最高为原则，
最后确定最佳提取条件为：80%甲醇溶液、水浴
66°C、30倍甲醇用量、提取1.0 h、提取4次。
2.7 加标回收率实验
取在最佳提取工艺条件下加入一定量的标准
品，计算加标回收率，结果见表4。结果表明，加
标回收率很高，从而说明本法效果准确、可靠。
表4 加标回收率测定结果
被测
成分 编号
样品量/
μg
加入量/
μg
测得量/
μg 回收率/%
平均回
收率/%
靛蓝
1 24.04 69.60 94.55 101.31
103.062 24.04 29.00 53.72 102.34
3 24.04 7.25 31.69 105.52
靛玉红
1 0.283 0.825 1.169 107.39
105.692 0.283 0.367 0.672 105.99
3 0.283 0.108 0.395 103.70
2.8 验证实验
选取最佳提取工艺条件后，进行验证实验。
取1.00 g干燥的大青叶粉末，在最佳提取工艺条件
下提取，重复5次，靛蓝和靛玉红的平均含量分别
为2.088、0.370 mg/g，相对标准偏差分别为0.829%
和1.162%。结果表明，与正交实验组所测得的最
高提取率相近，故选定的最佳工艺参数可行。
2.9 靛蓝和靛玉红的稳定性实验
将在最佳提取工艺条件下得到的粗提液在旋
蒸仪上蒸去甲醇及水分，剩余物溶于流动相，将
靛蓝和靛玉红溶液分为3份密封保存，1份放在自
然光照下，1份放在室温避光的通风橱内，1份放
在冰箱中4 ℃保存。样品在自然光照下保存时间
分别为：0.5、1.2、2.0、2.8、3.5 h，靛蓝的含量
为1.261、0.830、0.672、0.546、0.457 mg/g，靛
玉红的含量为0.291、0.273、0.266、0.261、0.255
mg/g，表明靛蓝和靛玉红对光不稳定。在室温避
光和低温保存时间分别为1、2、3 d，在室温避光
条件下靛蓝的含量为1.432、0.992、0.535 mg/g，
靛玉红的含量为0.358、0.249、0.132 mg/g；4 ℃保
存下靛蓝的含量为1.737、1.524、1.498 mg/g，靛
玉红的含量为0.350、0.304、0.278 mg/g。表明靛
蓝和靛玉红低温保存比在常温下保存稳定，但时
间也不能过长。
3 结论
甲醇作为靛蓝和靛玉红的提取溶剂时，提取
量最多。并且由于甲醇具有良好的稳定性、毒性
小、价廉等优点，本文选用甲醇作为提取溶剂。
氯仿的提取效果也不错，但由于毒性较强，本文
没有考察用氯仿进行提取。加热回流法提取靛蓝
和靛玉红的含量最高。通过L16(45)正交实验，确定
表1 靛蓝和靛玉红提取工艺正交实验因素水平表
水
平
因素
甲醇浓度
/% A
水浴温度
/℃ B
提取时间/h
C
甲醇用量
/倍 D
提取次数/
次 E
1 70 66 0.5 1:15 1
2 80 70 1.0 1:20 2
3 90 80 1.5 1:25 3
4 100 90 2.0 1:30 4
表2 L16(45)正交实验结果
实验
号
含量
靛蓝
/(mg/g)
靛玉红/
(mg/g)
总含量
/(mg/g)
1 1 1 1 1 1 1.587 0.187 1.774
2 1 2 2 2 2 1.461 0.310 1.771
3 1 3 3 3 3 1.650 0.290 1.940
4 1 4 4 4 4 1.829 0.303 2.132
5 2 1 2 3 4 1.995 0.360 2.355
6 2 2 1 4 3 1.691 0.370 2.061
7 2 3 4 1 2 1.389 0.293 1.682
8 2 4 3 2 1 1.331 0.273 1.604
9 3 1 3 4 2 1.906 0.370 2.276
10 3 2 4 3 1 1.673 0.313 1.986
11 3 3 1 2 4 1.415 0.290 1.705
12 3 4 2 1 3 1.228 0.298 1.526
13 4 1 4 2 3 1.538 0.295 1.833
14 4 2 3 1 4 1.228 0.347 1.575
15 4 3 2 4 1 1.297 0.366 1.663
16 4 4 1 3 2 1.257 0.251 1.508
K1 1.904 2.059 1.762 1.639 1.757
K2 1.926 1.848 1.829 1.728 1.809
K3 1.873 1.748 1.849 1.947 1.840
K4 1.645 1.693 1.908 2.033 1.942
R 0.281 0.366 0.146 0.394 0.185
因素
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大青叶中靛蓝和靛玉红的最佳提取工艺为：水浴
80%甲醇溶液、水浴66 ℃、料液比1:30、提取1.0
h、提取4次。其工艺合理、操作简单、成本低，
可以为靛蓝和靛玉红的进一步纯化提供科学依据
和坚实的基础。
通过稳定性测试，发现在自然光照和室温
避光条件下，随着放置时间的增长，靛蓝和靛玉
红含量显著地下降，并且靛蓝的含量减少的更明
显，说明在自然光照和室温避光条件下靛蓝和靛
玉红都不稳定，容易分解，相比之下，靛玉红的
稳定性比靛蓝的稳定性好，这与两者的结构不同
有一定的关系[7]；在冷藏条件下，靛玉红和靛蓝的
含量也有少许的降低，说明靛蓝和靛玉红的稳定
性在冷藏条件下比在自然光照和室温避光条件下
好。在正交实验的方差分析中，靛蓝和靛玉红的
含量随水浴温度的升高而降低，也可以看到靛蓝
和靛玉红的热稳定性较差。至于在提取过程中随
着提取温度的升高，或在自然光照和室温避光放
置的过程中，靛蓝和靛玉红发生了何种变化使其
含量下降，还有待进一步研究。
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从超临界CO2萃取花生壳中木犀草素的单因
素实验可以看出，Z%值随分离压力和温度的增加
均出现先升高后降低的变化，出现此变化的原因
是当温度和压力过低时木犀草素从流体中析出量
增大，但与此同时杂质的析出量也增大，导致样
品中木犀草素含量降低；当温度和压力过高时，
木犀草素不能从流体中顺利析出，导致产率和含
量同时降低。
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