全 文 ：Chinese Journal of New Drugs 2011，20(6)
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中国新药杂志 2011 年第 20 卷第 6 期
［基金项目］ 广西科学研究与技术开发计划(桂科攻 0322024-5E) ;
广西研究生教育创新计划(2006105981007D14)
［作者简介］ 张士军，男，博士，副教授，主要从事抗肝炎和抗肝纤维
化药物研究。联系电话:(0771)5358272，E-mail:gxykdxzsj@ 163． com。
［通讯作者］ 黄仁彬，男，教授，博士生导师，主要从事抗肝炎和抗肝
纤维化药物研究。联系电话:13807713926，E-mail:huangrenbin518@
163． com。
·实验研究·
复方六月青对肝星状细胞 I型胶原合成的抑制作用
张士军1，陈兆霓1，张志伟2，李勇文1，林 兴1，黄仁彬1
(1 广西医科大学药理学教研室，南宁 530021;2 广西中医学院附属瑞康医院，南宁 530011)
［摘要］ 目的:研究复方六月青(CLYQ)对肝星状细胞(HSC)I型胶原(Col I)合成的影响。方法:采用
四甲基噻唑蓝(MTT)法检测 CLYQ 对细胞的毒性，分别采用免疫细胞化学法和实时荧光定量 PCR 法检测
CLYQ 对 HSC的 Col I蛋白和 mRNA表达的影响。结果:CLYQ对 HSC毒性很低。CLYQ各剂量组中 HSC的
Col I蛋白表达显著减弱(P ＜ 0． 01)。CLYQ 高、中剂量组均可显著下调 HSC 的 Col I mRNA 表达(P ＜
0. 01)。结论:CLYQ通过下调 HSC的 Col I 蛋白及 mRNA表达，从而减少细胞外基质(ECM)合成，发挥抗肝
纤维化作用。
［关键词］ 复方六月青;肝纤维化;肝星状细胞;I型胶原
［中图分类号］ R978． 7 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1003 － 3734(2011)06 － 0544 － 04
Inhibitory effect of compound Liuyueqing on synthesis of collagen
type I in hepatic stellate cells
ZHANG Shi-jun1，CHEN Zhao-ni1，ZHANG Zhi-wei2，LI Yong-wen1，LIN Xing1，HUANG Ren-bin1
(1 Department of Pharmacology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China;
2 Affiliated Ruikang Hospital，Guangxi TCM University，Nanning 530011，China)
［Abstract］ Objective:To determine the effect of compound Liuyueqing (CLYQ)on the synthesis of colla-
gen type I (Col I)in hepatic stellate cells (HSCs)． Methods:The expression of Col I protein and mRNA in HSCs
was detected by immunocytochemistry and real-time fluorescence quantitative PCR，respectively． Results:Col I
protein expression in the HSCs was significantly weakened after CLYQ treatment at all concentrations (P ＜ 0． 01)．
The expression of Col I mRNA in HSCs was significantly down-regulated after CLYQ treatment at higher concentra-
tions (P ＜ 0． 01)． Conclusion:CLYQ can down-regulate the expression of Col I mRNA and protein in HSCs，re-
sult in reduction of extracellular matrix (ECM)synthesis，and may play a inhibitory role in hepatic fibrosis．
［Key words］ compound Liuyueqing (CLYQ) ;hepatic fibrosis;hepatic stellate cell (HSC) ;collagen type
I (Col I)
六月青系爵床科(Acanthaceae)肖鸡笼属植物
肖鸡笼(顶花马兰)Taraphochlamys affinis(Giff)Bre-
mekhu的干燥地上部分［1］，为广西民间草药。它与
白花蛇舌草、栀子花根等组成复方六月青(CLYQ，
又称复方六月雪)。CLYQ 是根据长时期的临床观
察而拟定的治疗急慢性乙型肝炎的验方，用于治疗
急性黄疸性肝炎的湿热黄疸等症。实验研究发现，
CLYQ在体内外具有显著的抗 HBV 作用［2 － 3］。本
实验采用 HSC-T6 细胞模型，分别采用免疫细胞化
学法和实时荧光定量 PCR 方法检测 CLYQ 对 HSC
的 Col I蛋白和 mRNA表达的影响，为开发 CLYQ用
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于肝纤维化治疗提供实验依据。
材 料
1 细胞株
肝星状细胞系 HSC-T6［4］为 SV40 转染 SD 大鼠
HSC，其表型为活化的 HSC，表达高水平的 I 型胶原
(Col-I)和组织金属蛋白酶抑制剂-1(Tissue inhibitor
of metalloproteases，TIMP-1)mRNA 等。由本药理学
教研室培养、传代。
2 药物及主要试剂
CLYQ(由广西医科大学药理学教研室采用全方
醇水双提的最佳工艺［5］提取，齐墩果酸 1． 24 mg·g －1，
总黄酮 13． 03 mg·g －1) ;秋水仙碱(美国 Sigma 公
司)。Trizol试剂(美国 Invitrogen 公司) ;cDNA 逆转
录试剂盒(美国 MBI 公司) ;TaqDNA 聚合酶(Fer-
mantas，美国 MBI 公司) ;RealMasterMix［SYBR
Green，天根生化科技(北京)有限公司］。一抗，
RAB ANTI RAT COLLAGEN Ⅰ(Biogenesis Morpho-
sys) ;二抗，Super PictureTM-HRP Polymer (广谱)
(天津津脉公司)。
3 主要仪器
iCycler iQ实时荧光定量 PCR 仪(美国 Bio-Rad
公司) ;76002 凝胶电泳成像分析系统(英国 UVitec
公司) ;核酸蛋白测定仪(美国 Bio-Rad 公司) ;
DMR +550 型病理图像分析仪(德国 Leica公司)。
方 法
1 CLYQ含药培养液的配制
将 CLYQ以培养液配成 72 mg·mL －1(以生药材
计，下同)的母液，经 0． 45 μm 的微孔滤膜，再经
0. 22 μm 微孔滤膜过滤除菌后，置 4 ℃冰箱保存备
用。实验时用完全培养液将 CLYQ稀释成所需终浓
度的应用液。
2 CLYQ的细胞毒性实验(MTT法)
根据 Mosmann建立的 MTT 法检测药物对细胞
的毒性作用［6］，稍加改进。将 2 × 104 个·mL －1的细
胞悬液加入 96 孔培养板中，每孔 200 μL，置 CO2 孵
箱(37 ℃，5% CO2)中培养 24 h后，细胞贴壁且生长
良好，吸除全部培养液，加入完全培养液将 CLYQ系
列稀释成 5 个终浓度为:12． 50，8． 84，6． 25，4． 42，
3. 13 mg·mL －1的应用液 200 μL，每个浓度设 5 个复
孔。连续培养 72 h，培养结束前 4 h，每孔加入 5
mg·mL －1的 MTT 10 μL，于 CO2 孵箱中继续培养。
4 h后小心吸弃上清液后，每孔加 DMSO 150 μL，
微量振荡器振荡 5 min，使甲臜(formazan)完全溶
解。自动酶标仪(检测波长 570 nm，参考波长 630
nm)读取各孔 A 值，记录结果。按 Reed-Muench
法［7］计算半数细胞毒浓度(TC50)和最大无毒浓度
(TC0)。
3 复方六月青对肝星状细胞 Col I蛋白表达的影响
取对数生长期 HSC-T6 细胞 1 × 105 个于六孔板
中培养 24 h，设终浓度分别为 0． 9，1． 8，3． 6 mg·
mL －1的 CLYQ，以秋水仙碱 6． 25 μg·mL －1为阳性对
照组和空白对照组。共同培养 24 h。严格按照免疫
组化常规步骤进行操作，用 PBS 代替一抗作为阴性
对照。选取阳性部位明显的区域采图，Col I 免疫细
胞化学染色结果分析使用图像分析系统对选区 30
个强阳性细胞进行平均灰度值测定，灰阶值越高，蛋
白表达越弱，反之越强。
4 复方六月青对肝星状细胞 Col I mRNA 表达的
影响
取对数生长期 HSC-T6 细胞 1 × 105 个于 50 mL
培养瓶中培养 24 h，设终浓度分别为 0． 9，1． 8，3． 6
mg·mL －1的 CLYQ，以秋水仙碱 6． 25 μg·mL －1为阳
性对照组和空白对照组。共同培养 24 h。采用 Tr-
izol法抽提细胞中总 RNA。用核酸蛋白测定仪测
定 RNA 含量及纯度，A260 /A280 均在 1． 8 ～ 2． 0
之间。取 cDNA 5 μg，采用 M-MuLV逆转录酶将其
逆转录成 cDNA。根据 Gene Bank 查找基因序列，
利用 Primer 5． 0 自行设计引物。引物序列为:Col
I:FP:5-CAACCTCAAGAAGTCCCTGC-3，RP:5-AG-
GTGAATCGACTGTTGCCT-3;GAPDH:FP:5-AT-
GATTCTACCCACGGCAAG-3，RP:5-CTGGAAGAT-
GGTGATGGGTT-3。由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。将 FQ-PCR 反应体系各成分充分混
匀后，按以下条件进行:95 ℃预变性，5 min;94 ℃变
性，10 s;55 ℃退火，20 s;72 ℃延伸，20 s。共反应 40个
循环。72 ℃延伸，5 min。扩增过程及荧光信号检查、数
据的储存和分析均由仪器及自带的软件自动完成。
5 统计学分析
应用 SPSS 13． 0 软件进行统计分析。数据均以
珋x ± s表示，组间比较采用 t检验。
结 果
1 CLYQ的细胞毒性作用
按照 Reed-Muench 法计算得出:TC50 = 6． 191
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mg·mL －1，TC0 = 3． 504 mg·mL
－1，即当各药物浓度≤
TC0 时，HSC-T6 细胞无论在形态上还是数量上与空
白对照相同，都没有发生变化。实验结果提示
CLYQ对 HSC-T6 细胞毒性很低。
2 CLYQ对 HSC-T6 细胞 Col I蛋白表达的影响
CLYQ 各剂量处理 24 h后，HSC-T6 细胞中 Col I
蛋白表达明显减弱，阳性部位颜色变为浅黄色。灰
阶值越高，蛋白表达越弱，反之越强。与空白对照组
比较，CLYQ 各剂量皆有显著的统计学差异(P ＜
0. 01) ，见表 1 和图 1。结果提示 CLYQ可以显著增
强 HSC-T6 细胞胶原降解，减少 ECM的沉积。
表 1 CLYQ对 HSC-T6 细胞 Col I蛋白
表达的影响 n = 4，珋x ± s
组 别 灰阶值
空白对照组 103． 27 ± 13． 43
阳性对照组 113． 46 ± 10． 22a
CLYQ高剂量组 169． 06 ± 10． 00a
CLYQ中剂量组 131． 75 ± 11． 70a
CLYQ低剂量组 123． 58 ± 11． 25a
与空白对照组比较，a:P ＜0． 01
图 1 CLYQ对 HSC-T6 细胞 Col I蛋白表达的影响(× 200)
3 CLYQ 对 HSC-T6 细胞 Col I mRNA 相对表达
量的影响
与空白对照组相比较，CLYQ 高、中剂量组均可
显著下调 Col I mRNA的表达(P ＜ 0． 01) ，且表现一
定的剂量依赖性，见表 2。其试验结果与免疫细胞
化学法检测 HSC-T6 细胞 Col I 蛋白表达所得结果
趋势相同。提示 CLYQ 可能通过下调 HSC-T6 细胞
Col I mRNA的表达，抑制胶原的合成，减少 ECM 的
沉积，从而逆转肝纤维化。
表 2 CLYQ对 HSC-T6 细胞 Col I mRNA相对
表达量的影响 n = 4，珋x ± s
组 别 相对表达量
空白对照组 2． 15 ± 0． 24
阳性对照组 0． 62 ± 0． 11a
CLYQ 高剂量组 0． 61 ± 0． 05a
CLYQ中剂量组 1． 16 ± 0． 02a
CLYQ低剂量组 1． 68 ± 0． 17
与空白对照组比较，a:P ＜0． 01
讨 论
肝纤维化是多种慢性肝病发展的共同病理基
础，也是慢性肝炎、肝硬化等进一步发展、恶化的重
要环节，是肝脏纤维组织的过度沉积和细胞外基质
的合成大于降解的结果，其中心环节是肝星状细胞
的活化和向肌成纤维样细胞和成纤维细胞的转化，
导致大量 ECM 的合成，另一方面 ECM 的降解减少
导致其合成与降解的不平衡促进了肝纤维化形成。
肝纤维化是肝硬化的早期阶段和必经阶段，若病因
持续存在，肝纤维化逐渐加重，肝小叶及血管等逐渐
被改建，肝脏的正常结构遭到破坏，中心静脉区和汇
管区出现间隔、假小叶形成，即发展为不可逆转的肝
硬化［8］。近年来大量实验及临床研究表明在此时
如果病因消除并经适当治疗，纤维化可被逐渐吸收，
肝纤维化是可以逆转的［9］。目前除病因治疗(通过
作用于肝纤维化始动因子，间接发挥改善纤维化的
功能)外，阻抑、逆转肝纤维化进程成为非常重要的
治疗对策。
肝脏有多种胶原，其中以 Col I 为主，测定 Col I
mRNA的表达和蛋白合成可以从分子水平最先反映
出肝脏胶原合成的变化，从一个方面反映药物对胶
原合成的影响，而与胶原的降解无关。
本实验分别采用免疫细胞化学法和实时荧光定
量 PCR法检测 CLYQ对 HSC的 Col I蛋白和 mRNA
表达的影响。实验结果表明，CLYQ对 HSC 毒性很
(下转第 552 页)
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断 LTs 通路以平复 AS 炎症反应而达到防治 AS 的
目的及抗 AS新药的筛选提供了新的理论依据。
［ 参 考 文 献 ］
［1］ LIBBY P． Inflammation in atherosclerosis［J］． Nature，2002，420
(6917) :868 － 874．
［2］ BACK M． Leukotriene signaling in atherosclerosis and ischemia
［J］． Cardiovasc Drugs Ther，2009，23(1) :41 － 48．
［3］ QIU H，GABRIELSEN A，AGARDH HE，et al． Expression of
5-lipoxygenase and leukotriene A4 hydrolase in human atheroscle-
rotic lesions correlates with symptoms of plaque instability［J］．
Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(21) :8161 － 8166．
［4］ BEAUDEUX JL，GIRAL P，BRUCKERT E，et al． Matrix metal-
loproteinases，inflammation and atherosclerosis:therapeutic per-
spectives［J］． Clin Chem Lab Med，2004，42(2) :121 － 131．
［5］ BERGMAN MR，TEERLINK JR，MAHIMKAR R，et al． Cardi-
ac matrix metalloproteinase-2 expression independently induces
marked ventricular remodeling and systolic dysfunction［J］． Am J
Physiol Heart Circ Physiol，2007，292(4) :H1847 － H1860．
［6］ CHEN WQ，ZHANG L，LIU YF，et al． Prediction of atheroscle-
rotic plaque ruptures with high-frequency ultrasound imaging and
serum inflammatory markers［J］． Am J Physiol Heart Circ Physi-
ol，2007，293(5) :H2836 － H2844．
［7］ CIPOLLONE F，MEZZETTI A，FAZIA ML，et al． Association
between 5-lipoxygenase expression and plaque instability in hu-
mans［J］． Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(8) :1665 －
1670．
［8］ CIPOLLONE F，PRONTERA C，PINI B，et al． Overexpression
of functionally coupled cyclooxygenase-2 and prostaglandin E syn-
thase in symptomatic atherosclerotic plaques as a basis of prosta-
glandin E(2)-dependent plaque instability［J］． Circulation，
2001，104(8) :921 － 927．
［9］ BLANKENBERG S，RUPPRECHT HJ，POIRIER O，et al． Plas-
ma concentrations and genetic variation of matrix metalloprotein-
ase 9 and prognosis of patients with cardiovascular disease［J］．
Circulation，2003，107(12) :1579 － 1585．
［10］ KOJIMA C，INO J，ISHII H，et al． MMP-9 inhibition by ACE
inhibitor reduces oxidized LDL-mediated foam-cell formation［J］．
J Atheroscler Thromb，2010，17(1) :97 － 105．
［11］ RICCIONI G，BACK M，CAPRA V． Leukotrienes and athero-
sclerosis［J］． Curr Drug Targets，2010，11(7) :882 － 887．
［12］ JAWIEN J，GAJDA M，WOLKOW P，et al． The effect of monte-
lukast on atherogenesis in apoE /LDLR-double knockout mice
［J］． J Physiol Pharmacol，2008，59(3) :633 － 639．
［13］ LIU D，GE S，ZHOU G，et al． Montelukast inhibits matrix met-
alloproteinases expression in atherosclerotic rabbits［J］． Cardio-
vasc Drugs Ther，2009，23(6) :431 － 437．
编辑:罗娟 /接受日期:
櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃櫃
2010 － 12 － 20
(上接第 546 页)
低。CLYQ各剂量组中 HSC 的 Col I 蛋白表达显著
减弱(P ＜ 0． 01) ，且表现一定的剂量依赖性。CLYQ
高、中剂量组均可显著下调 HSC 的 Col I mRNA 表
达(P ＜ 0． 01)。实验结果提示，CLYQ可能通过下调
肝组织 Col I mRNA的表达和蛋白合成，抑制胶原的
合成，减少 ECM的沉积，从而逆转肝纤维化。
［ 参 考 文 献 ］
［1］ 林兴，黄权芳，黄仁彬，等． 广西民间药六月青的性状与显微鉴
定［J］． 中药材，2005，28(7) :541 － 543．
［2］ 张士军，林军，黄仁彬，等． 复方六月雪对鸭乙型肝炎病毒
DNA的抑制作用［J］． 中药材，2007，30(2) :191 － 193．
［3］ 张士军，焦杨，黄仁彬，等． 复方六月雪对 HepG2． 2． 15 细胞
HBV DNA的抑制作用［J］． 中药药理与临床，2007，23(1) :
59 － 61．
［4］ VOGEL S，PIANTEDOSI R，FRANK J，et al． An immortalized rat
liver stellate cell line (HSC-T6) :a new cell model for the study of
retinoid metabolism in vitro［J］． J Lipid Res，2000，41(6) :882 －
893．
［5］ 李江，黄忠仕，黄仁彬，等． 复方六月雪颗粒提取工艺研究
［J］． 中国药房，2005，16(1) :16 － 19．
［6］ MOSMANN T． Rapid colorimetric assay for cellular growth and
survival:application to proliferation and cytotoxicity assays［J］． J
Immunol Methods，1983，65(1 － 2) :55 － 63．
［7］ 黄祯祥． 医学病毒学基础及实验技术［M］． 北京:科学出版
社，1990:143 － 146．
［8］ HUI AY，FRIEDMAN SL． Molecular basis of hepatic fibrosis［J］．
Expert Rev Mol Med，2003，5(5) :1 － 23．
［9］ MURPHY F，ARTHUR M，IREDALE J． Developing strategies for
liver fibrosis treatment［J］． Expert Opin Investig Drugs，2002，11
(11) :1575 － 1585．
编辑:周卓 /接受日期:2010 － 10 － 20