全 文 ：· 实验研究·
大青叶水煎剂调节小鼠免疫细胞分泌 IL- 2、 TN F-α的体外研究
赵　红　张淑杰　马立人　华北煤炭医学院生物科学系 (唐山 063000)
顾定伟　华北煤炭医学院附属医院骨外科 (唐山 063000)
　　摘　要:目的: 通过研究大青叶 ( Fo lium Statidis, FS)水煎剂体外对 C57小鼠免疫细胞
分泌 IL- 2、 TN F-α水平的影响 ,探讨大青叶在细胞因子水平免疫调节作用
的机制。方法: 3 H- TdR掺入法测定不同浓度大青叶水煎剂对小鼠脾淋巴细胞
和腹腔巨噬细胞的毒性作用 , M TT方法 ( TN F的敏感细胞株 L929, IL- 2的
依赖株 CTLL- 2)分别检测 IL- 2、 TN F的生物学活性。结果:大青叶水煎剂
在 0. 4～ 1. 6mg /m l浓度时 ,能促进正常小鼠 被 ConA诱导的脾淋巴细胞分泌
IL- 2,但未见到对小鼠腹腔巨噬细胞分泌 TN F-α有明显作用。结论:大青叶
水煎剂通过促进淋巴细胞 IL- 2的分泌 ,可以上调小鼠免疫功能 ,同时对巨噬
细胞分泌 TNF致炎效应和免疫病理损伤无明显影响。
　　主题词: @大青叶水煎剂　免疫细胞　小鼠 /动物实验
　　祖国医学认为大叶 ( Fdium Sta tidis, Fs)味苦性寒 ,具
有清热解毒 ,凉血功效 ,对流行性乙型脑炎、流感、流行性
腮腺炎、肝炎等均有一定疗效 [1]。 现代临床和实验室均证
明大青叶及其复方具有抗病毒、抗炎和免疫增强作用。能
增强正常及免疫功能低下小鼠巨噬细胞吞噬功能、脾淋
巴细胞的转化率 [2, 3]。 我们的实验室也得出过相同的结
果。 免疫功能是由免疫细胞执行的 ,但免疫细胞的增殖、
分化和转化为效应细胞需细胞因子参与 ,尤其白细胞介
素 2( IL- 2)是 T细胞和 B细胞的双重生长因子 ; 肿瘤坏
死因子 ( TNF)也为多功能的细胞因子。因此 ,本文旨在从
分子水平进一步探讨大青叶免疫调节作用的机理。
1　材料和方法　 1. 1　主要试剂 细菌脂多糖
( LPS) ,刀豆蛋白 A( ConA ) , M TT ,硫代乙醇酸钠肉汤均
为 Sigma公司产品 , rh TN F,放线菌素 D为原平公司产
品 , rhIL2为北京医科大学免疫室提供。
1. 2　药材 大青叶产于河北 ,经药材公司鉴定为十字
花科植物菘蓝 ,常规方法 [4] 3次水煎混合液浓缩至 1g /
ml,离心 2000转 /分 , 10分钟。取上清液 60CO。照射灭菌。
1. 3　实验动物 C57小鼠 6～ 8W ,体重 18～ 22g ,购
自北京医科大学动物中心。
1. 4　实验方法　 1. 4. 1　大青叶对小鼠脾淋巴细胞
及腹腔巨噬细胞毒性试验 ①将新分离的浓度为 2× 106 /
ml小鼠脾淋巴细胞加入 96孔板 , 每孔 100μl, 然后加入
不同浓度 FS的 RPM I— 1640培养液 100μl, 并设阴性对
照 ,培养 24小时。经 3H- TdR掺入法 [5] ,按常规用 β液体
闪烁计数仪测量 cpm值。 ②将小鼠腹腔注射 3%硫代乙
醇酸钠肉汤诱导腹腔巨噬细胞 ,同上方法进行 FS的 24
小时毒性实验。
1. 4. 2　 TNF-α的诱生及测定　　腹腔巨噬细胞用
LPS(终浓度 10μg /ml)刺激 ,加入不同浓度的 FS的不完
全 RPM I- 1640培养液 200μl,每样 3个复孔 ,培养 24小
时后收获上清液。再以 L929细胞为靶细胞 ,完全 RPMI-
1640调其浓度至 1. 5× 105 /ml,铺于 96孔板中 ,每孔
200μl,过夜。 加新鲜收集的上清 100μl /孔并进行倍比稀
释。设标准 TNF做阳性对照 , RPMI- 1640培养基做阴性
对照。 最后每孔加放线菌素 D(终浓度为 2μg /ml)。 37℃
5% CO2孵箱培养 18- 24小时。加入 5mg /ml M T T10μl,
3- 4小时 , 加入 3% SDS,过夜。 酶标仪读 OD570nm。线
性回归方程计算 TNF活性单位 [6 ]。
1. 4. 3　 IL- 2的诱生及测定　小鼠脾细胞悬液用
Con A(终浓度 2. 5μg /ml)刺激 ,加入不同浓度 FS培养 24
小时收获上清液。取对数生长期的 IL- 2依赖株 CTLL-
2 ,用 M TT比色法测定所获上清液中 IL- 2生物学活
性 [7] ,并设标准 rh IL- 2及 RPM I- 1640培养基阴性对照
组 ,常规方法计算 IL- 2活性单位。
1. 5　统计学处理　实验结果 x-± S ,实验数据的 t
检验及直线相关回归方程用 ST ATA软件处理。
2　结　果　 2. 1　 FS的细胞毒性分析 FS在 0mg /
ml～ 102. 4mg /ml范围内的 12个浓度对小鼠脾淋巴细胞
和腹腔巨噬细胞进行了细胞毒性实验 ,结果显示 FS在 6.
4mg /ml以下对小鼠腹腔巨噬细胞无毒性 ,在 3. 2mg /m l
以下对小鼠脾淋巴细胞无毒性 ,且分别在 3. 2mg /ml及
757陕西中医 2003年第 23卷第 8期
1. 6mg /ml对细胞有一保护作用。 见表 1。
表 1　 FS对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的
细胞毒性试验结果 ( x-± s )
Macrophage
( cpm值 )
FS浓度
( mg /ml)
Lymphocy te
( cpm值 )
0. 0 169. 90± 49. 29 167. 05± 10. 36
0. 05 145. 57± 46. 95 196. 03± 31. 21
0. 1 147. 20± 28. 75 191. 47± 47. 22
0. 2 153. 17± 32. 30 225. 23± 28. 14
0. 4 218. 03± 47. 86 218. 91± 39. 29
0. 8 212. 60± 76. 90 193. 90± 25. 33* *
1. 6 357. 87± 68. 76* 230. 50± 21. 02
3. 2 169. 20± 90. 67 366. 40± 11. 85*
6. 4 86. 60± 39. 18* * 103. 67± 20. 13
12. 8 67. 57± 20. 58* 76. 83± 16. 13* *
25. 6 50. 93± 6. 31* 71. 03± 15. 48* *
51. 2 40. 03± 5. 89* 79. 60± 16. 99*
102. 4 58. 33± 18. 10* 46. 63± 11. 93*
　　注:经 t检验 ,与阴性对照组比 ,* P < 0. 05,* * P
< 0. 01
2. 2　 FS对 LPS活化的小鼠腹腔巨噬细胞分泌
TN F-α的影响分析 小鼠腹腔巨噬细胞在 LPS刺激下 ,
分泌 TNF-α。 培养时加入不同浓度的 FS,观察对 TNFα
产生能力的影响。 结果如表 2。
FS在 0. 2- 1. 6mg /ml对 LPS诱导的小鼠腹腔巨噬
细胞分泌 TNF-α有增高趋势 ,但无统计学意义。
表 2　 FS对 LPS活化的小鼠腹腔巨噬细胞
分泌 TN F-α的影响效应 ( x-± s )
FS浓度 ( mg /m l) TNF活性 (∪ /m l)
0. 0 22. 30± 3. 45
0. 1 21. 73± 0. 96
0. 2 30. 17± 2. 43
0. 4 28. 87± 5. 51
0. 8 31. 29± 2. 57
1. 6 29. 07± 1. 32
3. 2 20. 04± 5. 50
6. 4 24. 89± 1. 10
　　注: 经线性回归方程及 t检验 ,与阴性对照组比
2. 3　 FS对 Con A活化的小鼠脾淋巴细胞分泌 IL-
2的影响分析小鼠淋巴细胞在 ConA刺激下 ,分泌 IL- 2,
经不同浓度 FS的共同作用后 ,对脾淋巴细胞分泌 IL- 2
的量有提高作用。 结果见表 3。
3　讨　论　 现代免疫学认为淋巴细胞和巨噬细胞
是免疫功能的重要组成部分 ,在抗感染免疫 (抗菌感染 ,
抗病毒感染 ,抗寄生虫感染 )、免疫监视与自稳功能中发
挥关键作用。 它们通过活化后转化为效应细胞直接作用
表 3　 FS对 ConA活化的小鼠脾淋巴细胞
分泌 IL- 2的影响效应 (x-±s )
FS浓度 ( mg /ml) IL- 2活性 ( U /ml)
0 60. 24± 4. 45
0. 2 59. 35± 5. 75
0. 4 85. 14± 0. 40
0. 8 96. 45± 1. 08* *
1. 6 86. 12± 1. 5
3. 2 65. 53± 1. 61
6. 4 53. 16± 2. 50
　　注: 经线性回归方程及 t检验 ,与阴性对照组比 , *
P < 0. 05,* * P < 0. 01。
于靶细胞或释放细胞因子发挥作用。 细胞因子能够协助
效应细胞完成免疫功能 ,也有造成炎症反应等其它多种
生物学效应。其中 IL- 2是 T细胞的自分泌生长因子 ,也
是 B细胞旁分泌生长因子 ,因此对细胞免疫、体液免疫均
有辅助作用。另一方面 ,免疫应答的同时巨噬细胞可释放
TN F—α、 IL— 1等炎症因子 ,导致局部炎症反应和病理损
伤。
实验证明大青叶增强小鼠脾淋巴细胞增殖及腹腔巨
噬细胞吞噬功能 [2, 3] ,我们的实验表明大青叶促进 ConA
活化的 T淋巴细胞分泌 IL- 2但对小鼠腹腔巨噬细胞分
泌 TNF- α水平无影响。 一方面 ,大青叶可通过促进 Th
细胞和分泌 IL- 2,辅助 Tc细胞和 B细胞的分化和增殖。
在细胞免疫和体液免疫两个方面上调免疫功能。 与临床
报道 FS抗炎、抗病毒 ,抗肿瘤作用一致。 由于胞内感染、
病毒感染靶细胞及肿瘤细胞的清除主要是细胞免疫发挥
作用。 而大青叶在 T细胞和巨噬细胞两个方面全面提高
细胞免疫功能 ,提示大青叶在病毒感染与肿瘤治疗方面
可能会更有前景。 当然大青叶在其它环节如何增强细胞
免疫功能还需进一步研究。 另一方面 , TNF-α是一种重
要炎症介质 ,能激活间质组织释放蛋白水解酶 ,强烈刺激
内皮细胞表达组织因子 ( TF) , 导致局部组织损伤、肝急
性期反应、甚至弥散性血管内凝血 ( DIC)。 大青叶促进吞
噬细胞的吞噬作用 [2, 3] ,但对其分泌 TN F- α水平无影
响 ,提示大青叶免疫增强作用的同时没有更多影响白细
胞的活动 ,不造成更严重的病理损伤及功能失调。大青叶
这种免疫增强作用的针对性在临床免疫调节治疗中可能
更具有优越性。
综上所述 ,大青叶水煎剂体外改善免疫功能 ,不促进
炎症介质的释放 ,为其临床应用提供了依据 ,本实验中所
用大青叶水煎剂成份复杂 ,目前国内学者已从大青叶中
分离得到靛蓝 ,靛玉红 (被认为是抗癌新药 ) ,β ,γ谷甾醇
等成份 [1]。 进一步开发大青叶新成份 ,探讨每种成份各自
在不同的水平对免疫功能的调控机制 ,都是进一步需要
做的工作。
758 陕西中医 2003年第 23卷第 8期
参考文献
1　乔传卓 .大青叶类药材的研究概况 . 中药材 ,
1986, 5: 41
2　张艳萍 .热毒清的拆方研究 . 对小鼠腹腔巨噬细
胞功能的影响 . 同济医科大学学报 , 1995, 24( 6): 456
3　周永霞 . 中药复感灵对环磷酰胺造型小鼠免疫功
能的影响 . 广州中医药大学报 , 1998, 15( 2): 129
4　中药房中药店工作手册 . 广州: 东科技出版社 ,
1991, 103
5　 Gillis S, Ferm MM, Ov W , e t a l. T cell g row th
facto r: pa ramet ers of production and a
guantitativ emicr oassay fo r activity. J Immuno l, 1978,
120: 2027
6　钱玉昆 . 实用免疫学新技术 . 北京: 北京医科大
学协和医科大学联合出版社 , 1994: 54
7　武建国主编 .实用临床免疫学检验 .南京: 江苏科
学技术出版社 , 1991; 1612
(收稿 2003-05-06;修回 2003-06-15)　　
复方虫草片对体力性疲劳小鼠脑内氨基酸代谢的影响
赵　光　闫淑莲　首都医科大学化学药理系 ( 100054)
黄如彬　首都医科大学生物化学系 ( 100054)
　　摘　要: 目的:通过小鼠游泳试验、爬杆试验以及脑内谷氨酸 ( Glutama te, Glu) ,谷酰胺
( Gluatamine, Gln ) ,丝氨酸 ( Serine, Ser ) ,甘氨酸 ( Glycine, Gly ) ,苏氨酸
( Th reonine, Thr ) ,丙氨酸 ( Alanine, Ala) ,γ- 氨基丁酸 (γ- Amino - n -
Butyric Acid, GABA)和色氨酸 ( T rytophan, Tr P)含量变化对复方虫草片进行
抗疲劳机理的研究。 方法:丹酰氯 ( dansyl chloride. DNS- Cl)柱前衍生反相高
效液相 ( HPLC)法测定小鼠脑内氨基酸含量。 结果:给予不同剂量受试物 28d
后 ,与对照组相比爬杆时间和游泳时间显著提高 ;谷酰胺 ( Gln)高剂量组明显
低于中剂量组和对照组 ,甘氨酸 ( Gly )高剂量组低于对照组而中剂量组却高于
对照组并有显著性的差异 ,苏氨酸 ( Thr)高剂量组显著性高出对照组和中剂量
组近 7- 8倍 ,丙氨酸 ( Ala)中剂量组高于对照组有统计学意义 ,γ-氨基丁酸
( GABA)实验组含量均显著高于对照组。脑内 Glu /GABA比值实验组均明显
低于对照组。结论:有可能具有抗体力性疲劳作用的复方虫草片配方中虫草与
其它药物的配伍调整体内氨基酸代谢 ,并且药物的调节并不是简单的兴奋或
抑制有可能是一个更为复杂的机理。
　　主题词: @复方虫草片　氨基酸　小鼠 /动物试验
　　 氨基酸是体内合成蛋白质的原料 ,起氧化分解提供
能源 ,而且某些氨基酸还是体内的调节因子 ,在运动中 ,
氨基酸担负着重要的功能。 无论是长期训练还是一次性
运动都会影响血清中氨基酸的浓度 ,说明运动使氨基酸
代谢分解代谢加强 ,利用率增高 [1]。 体力性疲劳又称运动
性疲劳 [2] ,其含义:即指有机体运动本身所引起的“机体生
理过程不能持续其机能在一特定水平和 /或不能维持预
定的运动强度”的机体运动能力下降。根据虫草生物功能
和药理作用研制出了复方虫草片。其以虫草为主 ,按配方
量分别添加了: 牛磺酸 ,维生素 ,有机硒 ,茶碱 (能兴奋中
枢神经系统 ,兴奋心脏 ,松弛平滑肌和利尿 ) ;低聚糖 ,肉
毒碱。 虫草提取液具有抗自由基的作用 [3, 4]。虫草提取物
能降低血清胆固醇和甘油三酯含量、增加心肌和脑对
86Rb的摄取 ,并有抗缺氧和镇静的作用 [5]。大运动量训练
后适当补充牛磺酸 ,对于维持心血管系统功能 ,及时消除
运动疲劳 ,预防心肌损伤等运动性疾病的发生具有一定
的作用 [6 ]。 有研究发现疲劳时尿中排除肉毒碱的总量明
显增加 ,体内肉毒碱减少是人体氧化利用脂肪酸的能力
下降 ,表现出肌肉乏力 ,肌纤维内和肌纤维间有大量的甘
油三脂堆积 ,运动能力明显下降 [7]。 先前我们实验结果表
明 [8]: 复方虫草片对小鼠游泳时间、爬杆时间、血清尿素
氮、肝糖原的影响 ,实验组与对照组相比爬杆时间和游泳
时间显著提高 ;血清尿素氮明显降低 ;肝糖原含量显著性
提高 ,提示复方虫草具有延缓疲劳出现的作用。复方虫草
片对小鼠血乳酸的影响的结果表明 , 运动后 15min内血
乳酸含量分别降低并趋于正常对照组 ,说明复方虫草具
759陕西中医 2003年第 23卷第 8期