全 文 ：• 2367 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年10月第26 卷第10期 CJTCMP , October 2011, Vol . 26, No. 10
复方六月青诱导肝星状细胞凋亡的研究
张士军1，张志伟2，陈兆霓1，李勇文1，林兴1，黄仁彬1
（1广西医科大学，南宁 530021；2广西中医学院附属瑞康医院，南宁 530011）
摘要：目的：研究复方六月青（CLYQ）对肝星状细胞（HSC）凋亡的影响。方法：采用四甲基噻唑蓝（MTT）
法检测CLYQ对细胞的毒性。采用吖啶橙荧光染色和流式细胞术检测CLYQ对HSC凋亡的影响。结果：CLYQ对HSC
毒性很低。吖啶橙荧光染色法结果显示，与空白对照组相比较，CLYQ对HSC-T6凋亡细胞比例的影响有统计学
差异（P<0.01），其凋亡率细胞比例有明显的剂量依赖性。流式细胞术结果显示，空白对照组凋亡细胞比例为
4.82，CLYQ 3.6mg/mL浓度组凋亡细胞比例为10.10，1.8mg/mL浓度组凋亡细胞比例为6.76，0.9mg/mL浓度组凋亡细
胞比例为5.18。结论：CLYQ通过诱导HSC细胞凋亡，从而发挥抗肝纤维化作用。
关键词：复方六月青；肝纤维化；肝星状细胞；细胞凋亡
基金资助：广西科学研究与技术开发计划科技攻关项目（No.桂科攻0322024-5E），广西研究生教育创新计
划资助项目（No.2006105981007D14）
Apoptosis of hepatic stellate cells induced by Compound Liuyueqing
ZHANG Shi-jun1, ZHANG Zhi-wei2, CHEN Zhao-ni1, LI Yong-wen1, LIN Xing1, HUANG Ren-bin1
( 1Guangxi Medical University, Nanning 530021, China; 2Affi liated Ruikang Hospital, Guangxi TCM University,
Nanning 530011, China )
Abstract: Objective: To investigate the effect of Compound Liuyueqing (CLYQ) on apoptosis of hepatic stellate cells
(HSC). Methods: Cytotoxicity caused by CLYQ was detected by MTT assay. HSC cell apoptosis were detected by acridine orange
(AO) staining and fl ow cytometry (FCM). Results: The CLYQ cytotoxicity to the HSC cell was very low. The results of AO
staining showed that compared with the blank control group, the effect of CLYQ on the HSC apoptosis proportion had a signifi cant
difference (P<0.01) and the rate of apoptosis cells had dose-dependent relationship. The results of FCM showed that the apoptosis
rate of HSC cell in blank control group was 4.82, 10.10 in the CLYQ 3.6mg/mL group, 6.76 in 1.8mg/mL group, 5.18 in 0.9mg/mL
group respectively. The results suggested that CLYQ could promote the apoptosis of HSC cells to some extent. Conclusion: CLYQ
could induce apoptosis of HSC, and played a role in anti-hepatic fi brosis.
Key words: Compound Liuyueqing (CLYQ); Hepatic fi brosis; Hepatic stellate cell (HSC); Apoptosis
Fund assistance: Guangxi Science and Technology Development Program (No.0322024-5E)，Guangxi Graduate
Education Innovation Program (No.2006105981007D14)
·研究报告·
通讯作者：黄仁彬，广西省南宁市双拥路22号广西医科大学药理学教研室，邮编：530021，电话：0771-5339805
E-mail：huangrenbin518@163.com
六月青系爵床科（Acanthaceae）肖鸡笼属植物肖鸡笼（顶
花马兰）Taraphochlamys affi nis（Giff）Bremekhu的干燥地上部
分[1]，为广西民族特色草药。由六月青、白花蛇舌草、栀子花根、
半枝莲、天胡荽、垂盆草，以2:1:1:1:1:1的配比组成复方六月青
（CLYQ，又称复方六月雪）。CLYQ是根据长时期的临床观察而
拟定的治疗急慢性乙型肝炎的验方，民间常用于治疗急性黄疸
性肝炎的湿热黄疸等证。本课题组对该方进了大量的研究，笔
者发现CLYQ在体外和体内均可有效地抑制乙型肝炎病毒DNA
的复制[2-3]。本实验是前期系列研究的一部分，是CLYQ临床前
研究的必要补充，即采用HSC-T6细胞模型，应用吖啶橙荧光染
色法和流式细胞术检测CLYQ对HSC-T6细胞凋亡的影响，进一
步完善复方六月雪的药效学研究，为把该方开发成抗乙肝病毒
中药新药提供实验依据。
材料与方法
1. 材料
1.1 细胞株 肝星状细胞系HSC-T6[4]为SV40转染SD大鼠
HSC，其表型为活化的HSC，表达高水平的Ⅰ型胶原和TIMP-1
mRNA等。由本室培养、传代。
1.2 药品与试剂 CLYQ：由广西医科大学药理学教研室采
用全方醇水双提的最佳工艺[5]提取（齐墩果酸1.24mg/g，总黄酮
• 2368 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年10月第26卷第10期 CJTCMP , October 2011, Vol . 26, No. 10
13.03mg/g）；秋水仙碱：美国Sigma公司；MTT：美国Sigma公司；
Annex V凋亡试剂盒：美国Biovision公司。
1.3 仪器 Epics -XL Ⅱ型流式细胞仪：美国Beckman
Coulter公司；LeicaDMR+Q550荧光显微镜：德国Leica公司。
2. 方法
2.1 CLYQ含药培养液的配制 将CLYQ以培养液配成
72mg/mL（以生药材计，下同）的母液，经0.45μm的微孔滤膜，
再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，置4℃冰箱保存备用。实验
时用完全培养液将CLYQ稀释成所需终浓度的应用液。
2.2 CLYQ的细胞毒性实验（MTT法） 根据Mosmann
建立的MTT法检测药物对细胞的毒性作用[6]，稍加改进。将
2×104个/mL的细胞悬液加入96孔培养板中，每孔200μL，置
CO2孵箱（37℃，5%CO2）中培养24h后，细胞贴壁且生长良好，
吸除全部培养液，加入用完全培养液将CLYQ系列稀释成5个终
浓度为：12.50、8.84、6.25、4.42、3.13mg/mL的应用液200μL，
每个浓度设5个复孔。连续培养72h，培养结束前4h，每孔加入
MTT10μL，于CO2孵箱中继续培养。4h后小心吸弃上清液后，
每孔加DMSO150μL，微量振荡器振荡5min，使结晶紫完全溶
解。自动酶标仪（检测波长570nm，参考波长630nm）读取各
孔OD值，记录结果。按Reed-Muench法[7]计算半数细胞毒浓度
（TC50）和最大无毒浓度（TC0）。
2.3 吖啶橙染色检测CLYQ对HSC细胞凋亡的影响 取对
数生长期HSC-T6细胞1×105个培养于六孔板中24h，设终浓度
分别为0.9、1.8、3.6mg/mL的CLYQ低、中、高剂量组，以秋水仙
碱6.25μg/mL为阳性对照组，以及空白对照组。共同培养24h，
用PBS洗涤3次除去血清。用95%酒精固定15-30min；1%醋酸
作用30s；1×10-4mol/L吖啶橙染色30-60s；0.1mol/L CaCl2处理
30s-2min，PBS漂洗3次；用PBS封片。荧光显微镜下观察，细胞
质和细胞核的颜色。并用数码相机摄像，描述镜下所见的细胞形
态。计数100个细胞中凋亡细胞数，观察4个视野。
2.4 流式细胞术检测CLYQ对HSC细胞凋亡的影响 取对
数生长期HSC-T6细胞1×105个/mL培养于50mL培养瓶中24h，
设终浓度分别为0.9、1.8、3.6mg/mL的CLYQ低、中、高剂量组，
以秋水仙碱6.25μg/mL为阳性对照组，以及空白对照组。共同
培养24h，PBS冲洗2次，用100μL含钙离子Buffer重悬，加5μL
Annex V-FITC染料染色20-30min，加5μL PI染料染色5min，加
入适量含钙离子Buffer调整细胞浓度到1×105个/mL左右，上流
式细胞仪检测。激发波长为488nm，发射波长为530nm。所得流
式图中的左上象限（第一象限）为无意义的部分，右上象限（第
二象限）代表死亡细胞与Annexin V和PI都结合，左下象限（第三
象限）代表正常细胞与Annexin V和PI都不结合，右下象限（第四
象限）代表凋亡细胞只与Annexin V结合。
2.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件分析数据。数
据均以-x±s表示，分别采用t检验和卡方检验进行统计处理，
P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
1. CLYQ的细胞毒性作用 按照Reed-Muench法计算得出：
TC50=6.191mg/mL，TC0=3.504mg/mL，即当各药物浓度≤TC0
时，HSC-T6细胞无论在形态上还是数量上与空白对照组相同，都
没有发生变化。实验结果提示CLYQ对HSC-T6细胞毒性很低。
2. 吖啶橙荧光染色法检测CLYQ对HSC凋亡细胞比例的影
响 见表1。空白对照组中的HSC-T6细胞绝大部分细胞状态良
好，胞质呈红色，胞核呈绿色。阳性对照组细胞凋亡比较严重，
有凋亡小体，胞核呈黄色，胞核内有块状，核物质外溢。CLYQ
各浓度组大部分细胞状态良好，随着用药剂量增大，凋亡细胞
逐渐增多，胞核呈黄色深染，碎裂，核物质外溢进入胞质。与空
白对照组相比较，CLYQ各剂量组对HSC-T6凋亡细胞比例的影
响有统计学差异（P<0.01），其凋亡率细胞比例有明显的剂量依
赖性。
表1 CLYQ对HSC凋亡细胞比例的影响( -x±s，n=4 )
组别
空白对照组
阳性对照组
CLYQ 高剂量组
CLYQ中剂量组
CLYQ低剂量组
凋亡细胞比例(%)
05.50±1.29
51.50±4.20**
38.00±3.92**
21.25±3.77**
12.50±2.89**
注：与空白对照组比较，**P<0.01。（下表同）
3. 流式细胞术检测CLYQ对HSC-T6细胞凋亡的影响 见
图1和表2。空白对照组中HSC-T6细胞绝大部分分布于流式图得
第三象限为正常活细胞。随着CLYQ作用浓度的增高，HSC-T6
的第二和第四象限细胞比例不同程度的增加，而正常活细胞比
例呈浓度依赖性的降低。根据流式图处于各状态的细胞具体数
阳性对照组空白对照组
1
1
10P1
10
0
10
00
（1
28
×
12
8）
1 1 10
FITC
100 1000
1 2
0
3 4
（1
28
×
12
8）
1
1
10P1
10
0
10
00 1 2
0
4
1 1 10
FITC
100 1000
CLYQ 高剂量组 CLYQ中剂量组
1 1 10
FITC
100 1000
1
1
10P1
10
0
10
00
（1
28
×
12
8）
1 2
0
3 4
1 1 10
FITC
100 1000
1
1
10P1
10
0
10
00
（1
28
×
12
8）
1 2
0
4
• 2369 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2011年10月第26 卷第10期 CJTCMP , October 2011, Vol . 26, No. 10
量，采用卡方检验，与空白对照组比较，CLYQ各剂量皆有显著
的统计学差异（P<0.01）。表明CLYQ对HSC-T6有一定的促凋亡
和致坏死的作用。
HSC细胞凋亡的作用，实验结果表明，CLYQ作用后，HSC细胞
凋亡率显著性升高，提示引起HSC细胞直接坏死又能诱导其细
胞凋亡是CLYQ发挥抗纤维化作用的重要途径，值得进一步研
究开发。
参 考 文 献
[1] 林兴,黄权芳,黄仁彬,等.广西民间药六月青的性状与显微鉴
定.中药材,2005,28(7):541-543
LIN Xing,HUANG Quan-fang,HUANG Ren-bin,et al.Pharmacognostic
Identification of Dried Twigs and Leaves of Taraphochlamys affinis
(Giff) Bremekhu.Journal of Chinese Medicinal Materials,2005,28(7):
541-543
[2] 张士军,焦杨,林兴,等.复方六月雪对鸭乙型肝炎病毒的抑制
作用研究.中国药房,2008,19(33):2563-2565
ZHANG Shi-jun,JIAO Yang,LIN Xing,et al.The Inhibitory Effect of
Compound Liuyuexue on DHBV DNA.China Pharmacy,2008,19
(33):2563-2565
[3] 张士军,焦杨,林兴,等.复方六月雪对HepG2.2.15细胞HBV
DNA的抑制作用.中药药理与临床,2007,23(1):59-61
ZHANG Shi-jun,JIAO Yang,LIN Xing,et al.The inhibitory
effect of Compound Liuyuexue on HBV DNA in the
HepG2.2.15 cells.Pharmacology and Clinics of Chinese Materia
Medica,2007,23(1):59-61
[4] Friedman S L,Lalazar A,Wang L.HSC-T6 cells,an immortalized rat
hepatic stellate cell line.Hepatology,1997(26):338
[5] 李江,黄忠仕,黄仁彬,等.复方六月雪颗粒提取工艺研究.中国
药房,2005,16(1):16-19
LI Jiang,HUANG Zhong-shi,HUANG Ren-bin,et al.Study on
Extraction Technique of Compound Liuyuexue Granules.China
Pharmacy,2005,16(1):16-19
[6] Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and
survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.
J Immunol Methods,1983,65(1-2):55-63
[7] 黄祯祥.医学病毒学基础及实验技术.北京:科学出版社,1990:
143-146
HUANG Zhen-xiang.Medical Virology and Experimental
Techniques.Beijing:Science Press,1990:143-146
[8] Negri C,Donzelli M,Bernardi R,et al.Multiparametric staining to
identify apoptotic human cells.Exp Cell Res,1997,234(1):174
[9] 贺宇彤,刘殿武,李青,等.抗纤I号和硒药物血清对肝星状细胞
增殖和凋亡的影响.中华中医药杂志,2006,21(4):219-222
HE Yu-tong,LIU Dian-wu,LI Qing,et al.Sera Pharmacological
Effect of Anti-fibrosis Herbs and Selenium on the Proliferarion
and Apoptosis of Hepatic Stellate Cells.China Journal of TCM and
Pharmacy,2006,21(4): 219-222
（收稿日期：2010年7月19日）
表2 CLYQ对HSC死亡、正常和凋亡细胞比例的影响（n=4 )
组别
空白对照组
阳性对照组
CLYQ 高剂量组
CLYQ中剂量组
CLYQ低剂量组
细胞比例 (%)
死亡细胞
3.36
4.34
10.70
7.59
3.93
正常细胞
91.50
83.20
78.60
85.30
90.70
凋亡细胞
4.82
11.70**
10.10**
6.76**
5.18**
讨论
细胞凋亡（apoptosis），又称程序性细胞死亡，是指为维持
内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性的死亡，是多细
胞有机体在细胞分化发育中及在各种生理、病理条件下起重要
作用的一种调节适应过程[8]。与细胞的坏死不同，细胞凋亡是
一种主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的
作用。它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是更好地
适应生存环境而主动采取的一种死亡过程。
HSC是肝纤维化的关键，静止的HSC合成低水平基质蛋白，
但是由于损伤，HSC被激活，基质过度沉积正是由于HSC数量
的增加和激活后基质蛋白合成分泌增加共同的结果[9]。因此，
纤维化的治疗应以逆转HSC到静止表型或是改变细胞增生与死
亡的平衡，其净效应达到使活化HSC减少为目的。
肝纤维化恢复期清除活化的HSC主要通过细胞凋亡机制，
细胞凋亡是HSC细胞数量减少的主要途径。因此，诱导活化的
HSC细胞凋亡是抗肝纤维化的重要方向。诱导HSC细胞凋亡成
为肝纤维化治疗研究的热点，通过HSC细胞凋亡，减少胶原合
成的来源，促进ECM的降解，有利于肝纤维化的逆转。因此诱
导HSC细胞凋亡是抗肝纤维化的重要环节，对于抗肝纤维化具
有重要的意义。
本实验通过吖啶橙荧光染色法和流式细胞术检测CLYQ对
图1 CLYQ对HSC死亡、正常和凋亡细胞比例的影响
CLYQ低剂量组
1 1 10
FITC
100 1000
1
1
10P1
10
0
10
00
（1
28
×
12
8）
1 2
0
3 4