全 文 ： Marine Sciences/Vol.31,No.1/2007 1
极大螺旋藻胞内多糖对体外肿瘤细胞抑制作用的实验研究
朱劲华 1, 张 威 1, 王 敏 2, 李朝军 2, 张成武 2
(1. 江苏职工医科大学，江苏 南京 210029；2. 南京师范大学 江苏省分子医学生物技术重点实验室，江苏 南
京 210097)
摘要：研究了极大螺旋藻（Spirulina maxima）胞内多糖对 SMMC7721等肿瘤细胞系的生长
及凋亡的影响。在体外培养条件下，用半抑制浓度（80, 5 mg/L）的极大螺旋藻胞内多糖（IPS
Ⅰ,IPSⅡ）处理肿瘤细胞，并用MTT，SRB，DNA ladder, Annexin Ⅴ等方法测定。结果表
明， IPSⅠ（80 mg/L）对 SMMC7721, A549, HeLa, U251等肿瘤细胞系抑制率分别为 64.97
％、46.1％、43.3％、27.02％；IPSⅡ（5 mg/L）能诱导 SMMC7721细胞凋亡。

关键词：极大螺旋藻（Spirulina maxima）；胞内多糖；细胞凋亡
中图分类号：Q2 文献标识码：A 文章编号：1000-3096（2007）01-0001-05


螺旋藻是一种在碱性水体中生长的螺旋形丝状
蓝藻,因含有独特的藻蓝蛋白及藻多糖等多种活性成
分,具有潜在的多种保健和药理功效。研究表明螺旋
藻中具抗癌及免疫调节作用的生物活性物质主要是
多糖[1~3]。国内外研究结果显示,螺旋藻多糖在体内外
都有较好的抑瘤效果[4~6],为了进一步验证极大螺旋藻
胞内多糖的抑瘤功能,探索其抑瘤机制,作者利用肿瘤
细胞系(SMMC7721，A549，HeLa，U251)进行体外
抑瘤研究,主要观察其对肿瘤细胞生长及凋亡的影响,
以明确其作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料及试剂来源
极大螺旋藻（Spirulina maxima）藻种来源于美国
Texas大学藻种保藏中心（原产于非洲乍得湖）；藻种
鉴定人：南京大学生物系曾昭琪教授；人肝癌细胞
SMMC7721、人小细胞肺腺癌细胞 A549、人宫颈癌
细胞 HeLa、人神经瘤细胞 U251、正常人胚肝细胞
LO-2 等细胞株皆由中科院上海生物研究所提供；
RPMI1640培养粉为美国 sigma 公司产品；胰酶、胎
牛血清（Fetal bovineserum,FBS）购自卫生部上海生
物制品研究所；培养板为美国 Falcon 96孔板；MTT
（四甲基偶氮唑盐）、SRB（Sulforhadamine B，磺基
罗丹 B）、染色剂 Annexin-V-Fluos购自美国 sigma公
司；DE-52、DEAE-Sephedex A-25、Sephedex G-100
购自美国 sigma 公司；极大螺旋藻胞内半精品多糖
（IPSⅠ）、极大螺旋藻胞内半精品多糖（IPSⅡ）皆
由本实验室制备。
1.2 主要仪器和设备
RE-52 型旋转蒸发仪，CO2 恒温培养箱（Forma
Scientific 公司 美国），ELx800 型酶联免疫检测仪
（Bio-Tek 公司 美国），Leitz 倒置显微镜，超净工
作台，LeicaDMR型荧光显微镜，分光光度计，Leica
数码相机等。
1.3 胞内多糖的制备
热水提取胞内粗多糖，丙酮、乙醚脱水脱色，在
经改良的 Sevag等方法脱蛋白，获得胞内多糖半精品
（IPSⅠ），经 DE-52、Sephadex G-100层析柱纯化，
得到两种单一组分的多糖精品（IPSⅡ）：IPSⅡA 和
IPSⅡB。利用 HPLC，IR等方法测定其初步结构，结
果显示：IPS ⅡA的平均分子质量为 238 000u，主要
单糖组成为 L-岩藻糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-甘露
糖（摩尔比为 6.09: 3.38: 0.66: 0.072），硫酸根质量浓

收稿日期：2004-07-10 修回日期：2004-10-21
作者简介：朱劲华（1973-），江苏南京人，女，江苏职工医科
大学讲师，硕士，电话：025-86278261，E-mail：zhjh7312@163.com
海洋科学/2007年/第 31卷/第 1期 2
度为 26.3 mg/L±3.7 mg/L，糖醛酸质量浓度约为 13.37
mg/L±0.45 mg/L；IPSⅡB的平均分子质量为 34 900u，
主要单糖组成包括 D-木糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-
葡萄糖、L-岩藻糖、D-半乳糖（摩尔比为 6.66: 4.63:
0.28: 0.12: 0.087: 0.022），硫酸根质量浓度为 21.5
mg/L±1.2 mg/L。
1.4 肿瘤细胞、正常细胞的培养
细胞生长的培养基为 RPMI-1640（含 10％的小牛
血清，链霉素 100 mg/L，青霉素 100单位/mL），置
于 5％CO2、37 ℃的培养箱中培养至对数生长期。
1.5 测定半抑制浓度
取对数生长期的人正常胚肝 LO-2细胞（稀释为
8×103个/mL），按每孔 100 µL接种到 96孔培养板中，
设不加多糖的对照组（加 100 µL 1640培养液）和 6
种多糖质量浓度的实验组（各加 100 µL不同质量浓
度药液），6个实验组中多糖的终浓度分别为 320，80，
20，5，1.25，0.312 mg/L。每组各设 12个平行孔，
培养 72h后MTT法检测每孔的吸光度（A值）。按下
式计算各多糖浓度的抑制率，选出抑制率为 50％的
多糖浓度即半抑制浓度，作为 IPSⅠ体外抗肿瘤细胞
的实验浓度。以相同方法测得 IPSⅡA的半抑制浓度。
抑制率＝（A 实验组－A 对照组）/ A 对照组×100％
1.6 IPSⅠ对肿瘤细胞生长的影响
分别取对数生长期的 SMMC7721，A549，HeLa，
U251 细胞（2×104个/mL）按每孔 100µL 接种到 96
孔培养板中，设不加多糖的对照组（加 100µL 1640
培养液）和多糖终质量浓度为 80 mg/L的实验组。每
组各设 12个平行孔，培养 72 h后，用MTT法检测。
1.7 IPSⅠ对 SMMC7721细胞生长的影响
取对数生长期的 SMMC7721细胞（2×104个/mL）
按每孔 1mL接种到 5个 24孔培养板中，设一个对照
组和一个 IPSⅠ质量浓度为 80 mg/L实验组，每组各
设 12个平行孔。细胞培养 2 d后开始，每隔 2d取出
一个 24孔板，用 SRB法检测直至第 10天。
1.8 IPSⅡA和 IPSⅡB分别对 SMMC7721
细胞生长的影响
取对数生长期的 SMMC7721细胞（8×103个/mL）
100 µL 接种到 96孔培养板中，设不加多糖的对照组
（加 100 µL 1640培养液）和分别加 IPSⅡA（100 µL，
终质量浓度 5 mg/L）和 IPSⅡB（100 µL，终质量浓度 5
mg/L）的实验组。细胞培养 48，72 h时观察。
1.9 细胞凋亡检测法
1.9.1 琼脂糖凝胶电泳法
将对数生长期的 SMMC7721细胞接种在 4个直
径为 90 cm的培养皿内，其中一个作为对照（加 1640
培养液）其余 3 个加胞内多糖精品 IPSⅡA（终质量
浓度为 5 mg/L）；24，48，60，72 h后取出培养皿，
收集 DNA；取制备好的样品 20 µL，用 1.5％琼脂糖
凝胶，36V电泳 3h，拍照。
1.9.2 细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻荧光显示分析法（An-
nexin V法）
对数期的 SMMC7721 细胞调整使其密度达到 4
×104 个/mL，转移至加有无菌盖玻片的 6 孔板中培
养，培养细胞密度达 50％左右加入多糖精品 IPSⅡA
（终质量浓度为 5 mg/L），培养 48，60，72 h后，取
出盖玻片加上染色剂 Annexin-V-Fluos 与 PS 双染细
胞，荧光观察。
2 结果
2.1 半抑制浓度的测定
表 1，2结果表明，IPSⅠ，IPSⅡA对正常胚肝
细胞 LO-2生长的半抑制浓度分别约为 80，5 mg/L。

表 1 MTT法检测 IPSⅠ对 LO-2细胞生长的影响（A值，n=12）
Tab.1 . The effect of IPSⅠon the growth of LO-2 by MTT
method(A value，n=12）
IPSⅠ质量浓度(mg/L) A490nm 抑制率（％）
0 0.860±0.085
320 0.334±0.024 61.21
80 0.447±0.024 48.07
20 0.605±0.029 29.63
5 0.762±0.038 11.63
1.25 0.853±0.032
0.312 0.951±0.025

2.2 IPSⅠ对肿瘤细胞生长的影响
2.2.1 IPSⅠ对不同肿瘤细胞生长的抑制率
由表 3可见，半抑制浓度（80 mg/L）的 IPSⅠ对
SMMC7721，A549，HeLa，U251 4种肿瘤细胞的生
长抑制率分别为 64.97％、46.1％、43.3％、27.02％，
其中对 SMMC7721 抑制率最高，所以选择
SMMC7721 作为实验细胞株， 进一步研究 IPSⅠ抑
制肿瘤细胞生长的机制。
2.2.2 IPSⅠ对 SMMC7721细胞生长的影响
设立多糖作用时间的梯度为 2，4，6，8，10 d。用
Marine Sciences/Vol.31,No.1/2007 3
SRB法检测 IPSⅠ对 SMMC7721细胞生长的影响（A
值）。由表 4可以看出终质量浓度为 80 mg/L的 PSⅠ
能有效地抑制 SMMC7721细胞的生长，具体表现为：
起始浓度相同的情况下，对照组 A值增大较快，第 8
天已达到 1.072，第 10天有所下降，而实验组 A值增
加较慢，第 8 天才达到 0.395，第 10 天稍有增加到
0.426；抑制率在第 4天时，达到最大值 72.54％，然
后逐渐下降。由此可见，IPSⅠ对 SMMC7721细胞生
长抑制作用在前 4天逐渐增强，然后逐渐减弱。
2.3 IPSⅡA和 IPSⅡB分别对 SMMC7721形
态和生长密度的影响
由表 5可见,与对照组相比，终质量浓度为 5mg/L
的 IPSⅡA和 IPSⅡB对 SMMC7721的生长有明显的
抑制作用，且随着时间的延长抑制作用愈明显，而且
可以明显看出 IPSⅡA的抑制作用比 IPSⅡB强。具体
表 2 MTT法检测 IPSⅡA对 LO-2细胞生长的影响（A值，
n=12）
Tab.2 Tthe effect of IPSⅡA on the growth of LO-2 by MTT
method(A value，n=12）
IPSⅡA质量浓度(mg/L) A490nm 抑制率（％）
0 1.083±0.061
320 0.125±0.014 88.45
80 0.364±0.016 66.39
20 0.401±0.029 62.97
5 0.539±0.042 50.23
1.25 0.732±0.038 32.41
0.312 0.865±0.044 20.13


表 3 用MTT法检测 IPSⅠ对 SMMC7721，A549， HeLa，U251 细胞生长的影响（A值，n =12)
Tab.3 The effect of IPSⅠon the growths of SMMC7721, A549,Hela,U251 by MTT method(A value，n =12)
A
IPSⅠ质量浓度（mg/L）
细胞
0 80
IPS I 80 mg/L
的抑制率(%)
SMMC7721 1.199±0.086 0.420±0.027 64.97
A549 0.935±0.039 0.504±0.016 46.1
HeLa 0.993±0.041 0.563±0.035 43.3
U251 1.088±0.021 0.749±0.039 27.02

表 4 用 SRB法检测 IPS对 SMMC7721细胞生长的影响（A值，n =12)
Tab.4 The effect of IPSon the growth of SMMC7721 by SRB method(A value，n =12)
A
IPSⅠ质量浓度（mg/L）
时间（d）
0 80
IPS I 80 mg/L
的抑制率(%)
2 0.381±0.015 0.172±0.009 54.86
4 0.743±0.023 0.204±0.014 72.54
6 0.959±0.036 0.287±0.017 70.07
8 1.072±0.041 0.395±0.022 63.15
10 0.993±0.031 0.426±0.019 57.10

表现为：IPSⅡA作用 48 h后，与对照组相比，细胞
密度明显减小，从形态上看部分细胞变圆；作用 72 h
后，与对照组相比，细胞密度减小得更加明显，从形
态上看绝大部分细胞变圆。IPSⅡB作用 48 h后，与
对照组相比，细胞密度略小，从形态上看个别细胞变
圆；作用 72 h 后，与对照组相比，细胞密度减小得
较为明显，从形态上看大部分细胞变圆（图未显示）。
2.4 细胞凋亡的检测
2.4.1 琼脂糖凝胶电泳法
图 1 显示,SMMC7721 细胞在终浓度为 5mg/L 的
海洋科学/2007年/第 31卷/第 1期 4
IPSⅡA作用下，37 ℃培养 72 h后，才有明显的显示
细胞凋亡过程中 DNA 降解的特征性“梯状”条带，而
在培养 24，48，60 h时“梯状”条带不明显。由此可见,
终浓度为 5 mg/L 的 IPSⅡA 作用约 72 h 左右，
SMMC7721细胞呈现凋亡状态。

表 5 IPSⅡA、IPSⅡB对 SMMC7721生长的影响
Tab.5 The effects of IPSⅡA and IPSⅡB on the growth of SMMC7721
作用时间 细胞密度（×104个/mL）
（h） 对照 IPSⅡA IPSⅡB
0 2.22±1.05 2.25±1.23 2.19±1.09
24 4.73±2.51 2.96±1.85 3.38±1.83
48 8.45±3.46 3.04±1.71 5.46±2.14
72 15.68±6.32 2.12±0.94 4.13±1.73














图 1 IPSⅡA对 SMMC7721作用后的 Ladder电泳图
Fig.1 Ladder electrophoses results of SMMC7721 after
adding IPSⅡA
M： 标样；1：对照；2：24 h；3：48 h ; 4: 60 h ; 5: 72 h

2.4.2 细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻荧光显示分析法
（Annexin V法）
SMMC7721 细胞在终浓度为 5mg/L 的 IPSⅡA
作用下，37 ℃培养 48 h，细胞膜 PS 外翻结合
Annexin-V-Fluos 发出绿色荧光，细胞核未见红色荧
光，可见 PI 未能进入细胞，所以细胞处于早期凋亡
状态；培养 60 h，细胞膜发出绿色荧光，细胞核发出
红色荧光，可见 PI 已能进入细胞，细胞处于中期凋
亡状态；培养 72 h，可见细胞形态变圆，红色荧光范
围扩大，细胞处于晚期凋亡状态。
3 讨论
由于实验条件和时间的限制，测定半抑制率时，
作者选用的正常细胞不是通过原代培养得到的正常
人体细胞，而是作者所在的实验室多次传代后的人胚
胎肝细胞 LO-2，这种细胞与正常人体肝细胞有一定
的差异，主要表现为增殖能力较强。所以测得的半抑
制浓度仅仅是一个参考浓度，IPSⅠ，IPSⅡA对正常
人体细胞的生长是否有影响还有待于进一步实验才
能确定。
通过体外肿瘤细胞药物敏感性实验，用 MTT 法
进行检测，发现 IPSⅠ能直接抑制离体培养的多种肿
瘤细胞生长，同时发现 IPSⅠ对肿瘤细胞生长的抑制
作用具有选择性，其中对肝癌细胞 SMMC7721 的抑
制作用最强，抑制率达到 64.97％。在研究 IPSⅠ对
SMMC7721生长曲线影响时，作者运用了 SRB检测
法，与 MTT 检测法相比， SRB 法对活细胞的染色
更敏感，操作也较为简便，从实验结果来看，第 4天
的抑制率达到72.54％，与MTT法检测结果基本一致，
表明实验结果比较可靠。IPSⅠ对 SMMC7721细胞生
长抑制作用，随着时间的延长逐渐减弱，其作用机制
还有待于进一步研究。
IPSⅠ经过 DE-52 柱，分离出 2 个组分 IPSⅡA
和 IPSⅡB，这两个组分成分有差异（另文发表），对
SMMC7721细胞的抑制作用也有差异，且 IPSⅡA作
用更明显；琼脂糖凝胶电泳和 Annexin V荧光分析两
个实验都证实了 IPSⅡA能引起肿瘤细胞凋亡。但具
体的凋亡机制还有待于进一步研究。

Marine Sciences/Vol.31,No.1/2007 5
参考文献:
[1] Gitte S, Donald I, Christian D ,et al. Blue-green algae as an
immuno-enhancer and biomodulator[J].Canada Winter,
2001,3(4):24-30.
[2] Misako M, Kaoru H, Yoshiko S, et al. Activation of the
human innate immune system by Spirulina: augmentation of
interferon production and NK cytotoxicity by oral
administration of hot water extract of Spirulina platensis[J].
International Immunopharmacology, 2002,2(1):423-434.
[3] Mishima T,Murata J,Toyoshima M,et al.Inhibition of tumor
invasion and metastasis by calcium spirulan(Ca-SP),a novel
sulfated polysaccharide derived from a blue-green alga,
Spirulina platensis[J]. Clin Exp Metastasis, 1998,16(6):541
-550.
[4] Patier P. Anticancer activity of polysaccharide of Spirulina
platensis [J].Appl Phycol,1993,5(5):343-348.
[5] 刘宇峰,张成武,沈海雁,等.极大螺旋藻胞内多糖对人血癌
细胞的影响[J].中草药,1999，30(2):115-119.
[6] Liu Y,Xu L,Cheng N,et al. Inhibitory effect of phycocyanin
from Spirulina platensis on the growth of human leukemia
K562 cells[J]. J Appl Phycol, 2001,22(12):1121-1124.


Effect of polysaccharides from Spirulina maxima on the
growth of human tumor cell lines
ZHU Jin-hua1, ZHANG Wei1,WANG Min2, LI Chao-jun2, ZHANG Cheng-wu2
（1. Jiangsu Staff Medical College, Nanjing 210029, China; 2. Molecular & Medical Biotechnology Laboratory,
Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China）
Received:Jul.,10,2004
Key words: Spirulina maxima ;intracellular polysaccharides; apoptosis

Abstract: We observed the effect of inopolysaccharide of Spirulina maxima(IPS)on the growth and apoptosis of
SMMC7721,A549,HeLa,U251 tumor cell lines.In vitro,human tumor cells were cultured in IPSⅠand IPSⅡwith
concentrations of 80 mg/L and 5 mg/L, the result of which was determined by MTT , SRB cell morphology,annexin Ⅴ
apoptosis assay and DNA fragmentation. IPSⅠ(80 mg/L)displayed strong growth inhibitory effects on SMMC7721,
A549,HeLa,U251human cancer cell lines with 64.97%,46.1%,43.3%,27.02% of inhibition rate,respectively. IPSⅡ(5
mg/L) inducing the apoptosis of SMMC7721.IPS can significantly restrain the growth of human tumor cell lines and
induce apoptosis.


（本文编辑：张培新）