全 文 ：［收稿日期］ 20100522(003)
［基金项目］ 广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻 0322024-5E);广西研究生教育创新计划资助项目(2006105981007D14)
［第一作者］ 张士军，博士，副教授，研究方向:抗肝纤维化药物研究，Tel:0771-5358272，E-mail:gxykdxzsj@ 163. com
［通讯作者］ * 黄仁彬，博士，教授，博士生导师，研究方向:抗肝纤维化和心血管药物研究，Tel:13807713926，E-mail:huangrenbin518@
163. com
复方六月青对肝纤维化大鼠肝脏Ⅰ型胶原合成的抑制作用
张士军1，陈兆霓1，张志伟2，刘曦1，付书婕1，黄仁彬 *
(1. 广西医科大学药理学教研室，南宁 530021;2. 广西中医学院附属瑞康医院，南宁 530011)
［摘要］ 目的:研究复方六月青(CLYQ)对四氯化碳(CCl4)致肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ型胶原(Col I)合成的抑制作用。方
法:SD 大鼠 sc CCl4 建立肝纤维化模型，随机分为 5 组:模型对照组、秋水仙碱组、CLYQ 高剂量组、中剂量组、低剂量组，并设正
常 SD 大鼠为空白对照组。模型组和空白对照组 ig 生理盐水，其他组 ig 相应的药物，连续 4 周。采用实时荧光定量 PCR 法检
测各组肝组织 Col I mRNA 表达情况，采用免疫组织化学法检测各组肝组织 Col I 蛋白表达情况。结果:与模型对照组比，CLYQ
各剂量组大鼠肝组织 Col I mRNA 的表达均下调(P < 0. 01)，且表现一定的剂量依赖性;CLYQ 各剂量组大鼠肝组织 Col I 蛋白
阳性表达面积和强度显著减少和减弱(P < 0. 01 或 P < 0. 05)，且呈明显的剂量依赖性。结论:CLYQ 可下调肝纤维化大鼠肝组
织 Col I mRNA 表达及其蛋白质合成以抑制细胞外基质的沉积，从而发挥其抗肝纤维化的作用。
［关键词］ 复方六月青;肝纤维化;Ⅰ型胶原;实时荧光定量 PCR;免疫组织化学法
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2010)17-0140-04
Inhibitory Effect of Compound Liuyueqing on Synthesis of Collagen Type I in
Hepatic Tissues in Rats with Hepatic Fibrosis
ZHANG Shi-jun1，CHEN Zhao-ni1，ZHANG Zhi-wei2，LIU Xi1，FU Shu-jie1，HUANG Ren-bin1*
(1 . Department of Pharmacology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China;
2 . Affiliated Ruikang Hospital，Guangxi Traditional Chinese Medicine University，Nanning 530011，China)
［Abstract］ Objective:To study the inhibitory effect of Compound Liuyueqing(CLYQ)on the synthesis of
Collagen type I (Col I)in hepatic tissues in rats with hepatic fibrosis. Method:Hepatic fibrosis model of SD rats
was induced by subcutaneous injection (sc)of CCl4 . Hepatic fibrosis SD rats were divided into 5 groups randomly:
model control group，colchicina-group，high dose，middle dose and low dose of CLYQ groups，and normal SD rats
were the blank contol group. Model control group and blank contol group were treated with normal saline，and the
other groups were treated with corresponding drugs for four consecutive weeks by intragastric administration (ig).
The relative quantification of Col I mRNA expression in hepatic tissues was detected by real time fluorescence
quantitative PCR，and the quantification of Col I protein expression was detected by immunohistochemistry. Result:
Compared with the model group，the various dosage groups of CLYQ could down regulate significantly Col I mRNA
expression (P < 0. 01)and showed a dose-dependent relationship according to the results of real time fluorescence
quantitative PCR. The results of immunohistochemistry showed that after treamented with CLYQ the area and the
intensity of Col I protein expression in hepatic tissues were reduced and weakened significantly (P < 0. 05，or P <
0. 01)compared with that of the model group. Col I protein expression was reduced obviously in a dose = dependent
manner. Conclusion:CLYQ can down-regulate the expression of Col I mRNA and protein synthesis in hepatic
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2010 年 12 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 16，No. 17
Dec.，2010
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2010.17.048
tissues of hepatic fibrosis rats. The results suggest that CLYQ can reduce the collagen， thus suppressing the
deposition of ECM. Hence CLYQ has the marked effect of anti-hepatic fibrosis.
［Key words］ Compound Liuyueqing;hepatic fibrosis;collagen type I;real time fluorescence quantitative
PCR;immunohistochemistry
六月青系爵床科(Acanthaceae)肖鸡笼属植物
肖鸡笼 (顶花马兰)Taraphochlamys affinis (Giff)
Bremekhu 的干燥地上部分［1］，为广西民间草药。它
与白花蛇舌草、栀子花根等组成复方六月青(CLYQ，
又称复方六月雪)。CLYQ 是根据长时期的临床观
察而拟定的治疗急慢性乙型肝炎的验方，用于治疗
急性黄疸性肝炎的湿热黄疸等证。试验研究发现，
CLYQ 对鸭乙型肝炎病毒 DNA 具有抑制作用［2］，
CLYQ 有效地抑制 HepG2. 2. 15 细胞 HBV DNA 的复
制［3］。本试验采用 CCl4 诱导大鼠肝纤维化模型，研
究 CLYQ 对肝纤维化大鼠肝脏Ⅰ型胶原 mRNA 表达
和蛋白合成的抑制作用，为开发 CLYQ 用于肝纤维
化治疗提供试验依据。
1 材料
1. 1 动物 SPF 级 SD(Sprague-Dawley)大鼠，雄
性，体重(230 ± 30)g;由广西医科大学试验动物中
心提供。试验动物生产许可证 SCXKG(桂)2003-
0003，试验动物使用许可证 SYKG(桂)2003-0005。
1. 2 药品与试剂 CLYQ:由广西医科大学药理学
教研室采用醇水双提的最佳工艺提取［4］;秋水仙碱:
云南昊邦制药有限公司，批号 20061109。Trizol 试
剂，美国 Invitrogen 公司，批号 1382739;cDNA 逆转
录试剂盒，美国 MBI 公司，批号 00041427;TaqDNA
聚 合 酶:美 国 MBI 公 司，批 号 0023191;
RealMasterMix(SYBR Green):天根生化科技(北京)
有限 公 司，批 号 J8204;一 抗 RAB ANTI RAT
COLLAGEN Ⅰ:Biogenesis Morphosys，批号 080606;
二抗 Super PictureTM-HRP Polymer (广谱):天津津
脉，批号 87-8963。
1. 3 仪器 iCycler iQ 实时荧光定量 PCR 仪，美国
Bio-Rad 公司;76002 凝胶电泳成像分析系统，英国
UVitec 公司;核酸蛋白测定仪，美国 Bio-Rad;4590
型 包 埋 机，日 本 SAKURA FINETECHNICAL
CO. LTD;RM 2235 型病理组织切片机，德国 Leica 公
司;DMR + 550 型病理图像分析仪:德国 Leica 公司。
2 方法
2. 1 CCl4 诱发 SD 大鼠肝纤维化动物模型的建立
SD 雄性大鼠按体重随机分为 2 组:空白对照组及
肝纤维化模型组。肝纤维化模型组 100 只，背部 sc
CCl4 造模，剂量 0. 3 mL·100 g
－ 1，每周 2 次。空白对
照组 10 只，采用生理盐水背部 sc，剂量同肝纤维化
模型组，每周 2 次。分别于造模后第 4 周、第 5 周及
第 6 周抽取 2 只肝纤维化大鼠及 1 只正常对照组大
鼠，进行病理学检查，监测肝纤维化形成的情况。
2. 2 分组及用药 选择肝纤维化大鼠 50 只，随机
分为以下 5 组，每组 10 只。①模型对照组:等量的
生理盐水;②阳性对照组:秋水仙碱，0. 2 mg·kg － 1·
d － 1;③CLYQ 高剂量组:30 mg·kg － 1·d － 1;④ CLYQ
中剂量组:15 mg·kg － 1·d － 1;⑤CLYQ 低剂量组:7. 5
mg·kg － 1·d － 1。未注射 CCl4 造模的空白对照组给予
等量的生理盐水。试验期间各组动物饲标准饲料，
在同样条件下饲养，均以每天 1 次 ig 连续给药 4 周。
每天观察大鼠一般状况、饮食变化、行为变化、毛发
变化。末次给药 24 h 后，戊巴比妥钠麻醉，打开腹
腔，迅速称取约 50 ～ 100 mg 肝组织放入液氮中迅速
冷冻后，转移放置于 － 80 ℃超低温冰箱保存，用于
抽提肝组织总 RNA。于肝左叶同一部位取肝组织
约 1 cm × 1 cm × 1 cm 大小，固定于 10%中性福尔马
林溶液，做免疫组化用。
2. 3 CLYQ 对肝纤维化大鼠肝脏 Col I mRNA 表达
的影响 采用 Trizol 法抽提细胞中总 RNA。用核酸
蛋白测定仪测定 RNA 含量及纯度，A260 / A280 均在
1. 8 ～ 2. 0。取 cDNA 5 μg，采用 M-MuLV 逆转录酶
将其逆转录成 cDNA。根据 Gene Bank 查找基因序
列，利用 Primer 5. 0 自行设计引物。引物序列为:
Col I:FP:5′-CAACCTCAAGAAGTCCCTGC-3′，RP:5′-
AGGTGAATCGACTGTTGCCT-3′; GAPDH: FP:5′-
ATGATTCTACCCACGGCAAG-3′， RP: 5′-
CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3′。Genebank 号分别
为 Z78279. 1 和 NM-017008. 3。由上海生工生物工
程技术服务有限公司合成。将 FQ-PCR 反应体系各
成分充分混匀后，按以下条件进行:95 ℃预变性，5
min;94 ℃变性，10 s;55 ℃退火，20 s;72 ℃延伸，20
s。共反应 40 个循环。72 ℃延伸，5 min。扩增过程
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及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及自
带的软件自动完成。
2. 4 CLYQ 对肝纤维化大鼠肝脏 Col I 蛋白的影响
严格按试剂盒说明依次操作，用 PBS 代替一抗作
为阴性对照。选取阳性部位明显的区域采图，Col I
蛋白表达的定量结果分析使用图像分析系统计算阳
性面积百分比(%)。
2. 5 统计方法 数据均以 珋x ± s 表示，以 SPSS13. 0
统计学软件统计。组间比较采用 t 检验。P < 0. 05
有统计学意义。
3 结果
图 1 CLYQ 对肝纤维化大鼠肝组织 Col I 蛋白合成的影响(200 ×)
A.空白对照组;B.模型对照组;C.秋水仙碱 0. 2 mg·kg － 1组;D. CLYQ 30 mg·kg － 1组;E. CLYQ 15
mg·kg － 1组;F. CLYQ 7. 5 mg·kg － 1组
3. 1 CLYQ 对肝纤维化大鼠肝脏 Col I mRNA 表达
的影响 与模型对照组相比较，CLYQ 各浓度组均
可显著下调 Col I mRNA 的表达(P < 0. 01)，且表现
一定的剂量依赖性。结果见表 1。
表 1 CLYQ 对肝纤维化大鼠肝组织 Col I mRNA
相对表达量的影响
组别 剂量 /mg·kg － 1 相对表达量
空白对照 － 0. 48 ± 0. 09
模型对照 － 2. 40 ± 0. 32
秋水仙碱 0. 2 0. 92 ± 0. 142)
CLYQ 30 0. 84 ± 0. 102)
15 1. 61 ± 0. 242)
7. 5 1. 97 ± 0. 172)
注:与模型对照组比较1)P < 0. 05，2)P < 0. 01(表 2 同)。
3. 2 CLYQ 对肝纤维化大鼠肝脏 Col I 蛋白的影响
正常对照组 Col I 蛋白在正常大鼠肝脏呈低水平
表达，表达部位局限于汇管区和肝窦的结缔组织、血
管壁及胆管壁，在肝实质内沿肝窦壁形成的丝状着
色，肝细胞浆内没有表达。模型对照组 Col I 蛋白表
达广泛，呈弥漫性，主要表达在中央静脉周围及纤维
组织增生的汇管区纤维间隔、肝窦壁、血管内皮细胞
和胆管上皮细胞，形成宽而粗大的纤维条索，肝细胞
浆可见有表达，免疫组化染色呈强阳性。CLYQ 各
剂量组 Col I 蛋白表达特点同模型组，但表达面积和
强度显著减少和减弱(P < 0. 05 或 P < 0. 01)，中央
静脉周围及汇管区，着色减少且浅，呈细丝状，肝细
胞浆内表达呈明显的剂量依赖性降低。结果见图 1
和表 2。
表 2 CLYQ 对肝纤维化大鼠肝组织
Col I 蛋白合成的影响(珋x ± s，n = 10)
组别 剂量 /mg·kg － 1 阳性面积比 /%
空白对照 － 1. 55 ± 0. 46
模型对照 － 18. 11 ± 1. 54
秋水仙碱 0. 2 8. 37 ± 1. 032)
CLYQ 30 5. 46 ± 1. 072)
15 9. 83 ± 1. 362)
7. 5 16. 24 ± 1. 331)
4 讨论
肝纤维化是多种慢性肝病发展的共同病理基
础，也是慢性肝炎、肝硬化等进一步发展、恶化的重
要环节，是肝脏纤维组织的过度沉积，是细胞外基质
的合成大于降解的结果，其中心环节是肝星状细胞
的活化和向肌成纤维样细胞和成纤维细胞的转化，
导致大量细胞外基质(ECM)的合成，另一方面 ECM
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的降解减少导致其合成与降解的不平衡促进了肝纤
维化形成。肝纤维化是肝硬化的早期阶段和必经阶
段，若病因持续存在，肝纤维化逐渐加重，肝小叶及
血管等逐渐被改建，肝脏的正常结构遭到破坏，中心
静脉区和汇管区出现间隔、假小叶形成，即发展为不
可逆转的肝硬化［5-7］。近年来大量试验及临床研究
表明在此时如果病因消除并经适当治疗，纤维化可
被逐渐吸收，肝纤维化是可以逆转的［8］。目前除病
因治疗(通过作用于肝纤维化始动因子，间接发挥改
善纤维化的功能)外，阻抑、逆转肝纤维化进程成为
非常重要的治疗对策。
肝脏有多种胶原，其中以 Col I 为主，测定 Col I
mRNA 的表达和蛋白合成可以从分子水平最先反映
出肝脏胶原合成的变化，单一的反映药物对胶原合
成的影响，而与胶原的降解无关。
本试验运用实时荧光定量 PCR 方法对肝组织
Col I mRNA 表达进行相对定量和免疫组织化学法
检测肝组织 Col I 蛋白表达。试验结果表明，CLYQ
各浓度组均可显著下调肝组织 Col I mRNA 的表达
(P < 0. 01)，且表现一定的剂量依赖性。CLYQ 作用
后的大鼠肝纤维化组织 Col I 蛋白表达面积和强度
显著减少和减弱(P < 0. 05 或 P < 0. 01)，呈明显的
剂量依赖性降低，表明肝组织中Ⅰ型胶原含量明显
减少。试验结果提示，CLYQ 通过下调肝组织 Col I
mRNA 的表达和蛋白合成，抑制胶原的合成，减少
ECM 的沉积，从而逆转肝纤维化。
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毒 DNA 的抑制作用［J］.中药材，2007，30(2):191.
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［责任编辑 聂淑琴］
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