全 文 ：No.9.2007
江蓠属是大型底栖海藻,味甘性寒,有软坚化
痰、清热利水的功效。近年来,江蓠受到了广泛关
注,在养殖与海洋修复、药效成分的提取、生物工
程应用等方面得到了不断的研究和应用[1]。对于江蓠
的研究发现,江蓠含有的琼脂、藻红蛋白、藻蓝蛋
白、前列腺素、水溶性多糖等具有一定的生物活性[2]。
特别是江蓠中所含有多糖,可能具有海藻多糖所
具有的一些特异性生物活性,如降血脂、提高免疫
力等[3]。
1 实验材料、仪器、试剂
1.1 材料
江蓠:宁波近海采集。
1.2 仪器
紫外可见分光光度计(22pc):LangguangTech;离
心机(80-1):上海手术器械厂。
江蓠多糖除蛋白的方法研究
徐 敏,裴文武,王 平,何荣军
(浙江工业大学药学院,杭州 310014)
摘要:采用水提醇沉法提取江蓠粗多糖,用苯酚-硫酸法测定江蓠中总多糖的含量,测得江蓠中总多
糖含量为42.5%。分别采用Sevage法、冻融-Sevage联合法、TCA法 3种方法进行除蛋白。Sevage法
操作复杂,需进行多次操作,且多糖损失大;冻融-Sevage联合法蛋白清除率高,但多糖损失较大;
TCA法操作简便,蛋白清除率高,多糖损失相对较小,为江蓠多糖除蛋白的最佳方法。
关键词:江蓠多糖;含量测定;除蛋白
中图分类号:TS201.1 文献标志码:A 编号:1005-9989(2007)09-0119-02
Researchonthemethodsofremovingproteinabout
polysaccharidefromgracilaria
XUMin,PEIWen-wu,WANGPing,HERong-jun
(ColegeofPharmaceuticalSciences,ZhejiangUniversityof
Technology,Hangzhou310014)
Abstract:Extractingpolysaccharidewiththemethodofdecoctionandalcoholsedimentation,determinationthe
contentofalpolysaccharidefromgracilariawiththemethodofphenol-sulfuricacid,andtheresultis42.5%.
RemovingproteinwithmethodsofSevage,freezing-SevageandTCArespectibvely.Astheoperationofthe
Sevagearecomplexwhichshouldoperaterepeatedly,andpolysaccharidearerelativelylargelylost,andthe
clearanceratioofproteinarehigherusingfreezing-Sevagewithsimilarlylargeamountoflost, whilethe
operationofTCAaremostsimpleamongthethreeandthelostofpolysaccharidearelest.SotheTCAisthe
bestmethodofremovingproteinfrompolysaccharideingracilaria.
Keywords:polysaccharidefromgracilaria;determination;removingprotein
收稿日期:2007-02-19
基金项目:浙江省经贸委中药现代化专项资助项目(20040383)。
作者简介:徐敏(1973—),女,硕士研究生,助理研究员,主要从事中药提取分离研究工作。
工艺技术
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DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2007.09.010
No.9.2007
表2除蛋白后多糖含量和回收率
样品编号 多糖含量/% 回收率/%
粗多糖 30.4 -
Sevage1 43.6 82.5
Sevage2 52.4 75.5
Sevage3 66.6 55.0
TCA1 72.8 61.0
TCA2 88.6 52.5
冻融-Sevage 84.2 26.0
表1 江蓠总多糖的含量
样品编号 质量/g
平均吸
收度
含量/% RSD/%
平均含
量/%
1 2.51 0.632 42.8 0.15
2 2.51 0.628 42.6 0.18 42.5
3 2.52 0.641 43.2 0.12
1.3 试剂
D-葡萄糖:分析纯,上海化学试剂站;硫酸、
正丁醇、氯仿、三氯醋酸:分析纯;95%乙醇:工业
级;6%苯酚:自制。
2 实验方法
2.1 江蓠多糖的提取[4]
取干江蓠,粉碎,烘干后称取 100g,加入 95%
乙醇,加热回流1.5h,趁热抽滤,用95%乙醇洗涤,
挥干,待残渣无乙醇味,加入蒸馏水,加热回流 2h
(3次),趁热抽滤,加热水洗涤,合并滤液,减压蒸
发浓缩至 1/5体积,加入乙醇,使乙醇浓度达到
80%,静置过夜,抽滤,得絮状粗多糖,分别用
95%乙醇、乙醚、丙酮洗涤,冷冻干燥,得江蓠粗
多糖。
2.2 苯酚-硫酸法[5]测定江蓠多糖的含量
2.2.1 标准曲线的绘制与换算因子的测算 以葡萄
糖为标准对照品绘制标准曲线方程得 A=0.0075x-
0.0539,R2=0.9987;同时测定葡萄糖相对江蓠多糖
的换算因子f=1.88。
2.2.2 江蓠多糖含量的测定 精确称取干燥江蓠
2.50g,按 2.1项方法提取得多糖溶液,移至 250mL
的容量瓶中,蒸馏水稀释至刻度,摇匀定容,取该
溶 液 1.00mL移 入 25mL容 量 瓶 中 加 水 补 足 为
2.00mL,按绘制标准曲线的方法测定吸收度。
根据标准曲线方程计算供养品溶液中葡萄糖含
量,再按下式计算样品中多糖的含量。多糖含量(%)=
(C×D×f)/W×100。C为多糖供试液中以葡萄糖计的浓
度(μg/mL);D为多糖的稀释因素;f为换算因子;W为
江蓠的质量。结果见表1。
2.3 江蓠多糖的除蛋白
2.3.1 Sevage法[6] 称取粗多糖5g,加水溶解,Sevage
法除蛋白,离心取水相;取上层水溶液,真空冷冻干
燥,得Sevage1(Sevage法去除蛋白1次);按同样方法重
复以上的操作,得粗多糖 Sevage2、Sevage3(Sevage法
去除蛋白分别为2、3次),分别计算回收率。
2.3.2 冻融-Sevage联合法[7] 称取江蓠粗多糖 2g,
加水溶解,置于-80℃冰箱过夜,第2天晨取出融解,
3000r/min离心 15min取上清液,用 Sevage法除蛋
白,取上清液,真空冷冻干燥,计算回收率。
2.3.3 三氯乙酸法(TCA法)[8] 称取粗多糖 2g,加蒸
馏水溶解,1∶1等体积加入 5%三氯乙酸溶液,静置
4h,离心取上清液,真空冷冻干燥,计算回收率。
分别取除蛋白多糖 100mg,移入 100mL容量瓶
中,加水定容,按绘制标准曲线方法
测定各自多糖含量,结果见表2。
3 结果与讨论
利用水提醇沉法提取江蓠多糖方法所得多糖,
传统的Sevage法除蛋白操作复杂,需进行多次操作,
且多糖损失大,效果不佳;采用冻融-Sevage联合法
除蛋白,蛋白清除率最高,但超低温使蛋白质变性的
同时,大部分糖肽类物质也会变性,使得多糖损失过
大;而采用三氯醋酸法(TCA法)蛋白清除率较高,同
时更为快捷,回收率也相对更高,为最佳除去江蓠多
糖中的蛋白质的最佳方法。
江蓠多糖的除蛋白研究为江蓠多糖的进一步
纯化、分离奠定了基础,在随后的纯化、分离过
程中我们得到了有关纯多糖,同时还开展了有关
江蓠多糖的水解实验,初步确定了水解和寡糖分
离条件,得到了相关寡糖,发现通过水解江蓠多
糖得到的寡糖片断具有一定的降血脂药理活性。
另外,我们对江蓠多糖的组成及结构也进行了一
定的研究。
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