全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2007, 19:841-843
文章编号:1001-6880(2007)05-0841-03
　
　
　收稿日期:2007-01-17　　　接受日期:2007-04-19
＊通讯作者 Tel:86-28-85237395;E-mail:cscdtcm@126.com
RP-HPLC法测定葫芦巴中葫芦巴皂苷 B的含量
陈　帅＊ ,罗　森 ,杨　红 ,王　笳 ,徐学民
四川省中医药科学院 , 成都 610041
摘　要:本文采用 KromasilC18(250×4.6 mm, 5 μm),乙腈-0.2%磷酸溶液(83:17)为流动相 , 流速 1.0 mL/min,
DAD检测器 , 检测波长 203nm, 对葫芦巴中葫芦巴皂苷 B含量进行测定 , 能将葫芦巴皂苷 B与杂质分开 ,葫芦巴
皂苷 B在 1.60～ 11.20 μg范围内峰面积与其浓度线性关系良好(R= 0.99996), 样品的平均加样回收率为
99.83%, RSD为 1.47% (n= 6)。该法测定样品快速准确 ,重现性好。
关键词:葫芦巴;葫芦巴皂苷 B;反相高效液相色谱
中图分类号:R284.2;Q949.95 文献标识码:A
DeterminationofHulubaSaponinBinHulubabyRP-HPLC
CHENShuai＊ , LUOSen, YANGHong, WANGJia, XUXue-min
SichuanAcademyofScienceofChineseMateriaMedica, Chengdu610041 , China
Abstract:AmethodfortheseparationanddeterminationofHulubasaponinBinHulubabyreversed-phasehighper-
formanceliquidchromatographywasdeveloped.ThechromatographicconditionswereKromasilC18 column(250×4.6
mm, 5 μm), acetonitrile-0.2% phosphateacidsolution(83:17)astheflowphase, theflowratewas1.0 mL/minand
DADdetectorat203nm.Thelinearityofthecalibrationcurewasgoodintherangof1.60-11.20μgforHulubasaponin
B(R=0.99996).TheaveragerecoveryandRSDofHulubasaponinBwere99.83%and1.47% (n=6)respectively.
Themethodisaccurateandreproducibletodeterminethesample.
Keywords:Huluba;HulubasaponinB;RP-HPLC
　　中药葫芦巴系豆科植物葫芦巴(Trigonelafoe-
num-graecumL.)的干燥成熟种子 ,具有温肾 ,驱寒 ,
止痛等功效 。常用于肾脏虚弱 ,小腹冷痛 ,小肠疝
气 ,寒湿脚冷等病症 。葫芦巴皂苷 B为其中主要活
性成分 。葫芦巴皂苷 B[ 1]属于薯蓣皂苷元的四糖
苷 ,白色粒状结晶(甲醇-丙酮),熔点 196 ～ 197 ℃,
分子式 C51H82O21 ,分子量为 1031.21,文献 [ 2]曾报道
用薄层层析 -比色法测定葫芦巴皂苷 B的含量 ,但实
验时间长 ,操作繁琐 ,重现性差 ,回收率低。本文采
用反相高效液相色谱法对中药葫芦巴中葫芦巴皂苷
B的含量进行测定 [ 3] 。操作简便快速 ,重现性好 ,结
果准确可靠 ,为葫芦巴及其制剂质量标准的制定提
供参考 。
1　仪器及试药
　　高效液相色谱仪:美国 Agilent1100系列 , DAD
检测器 ,色谱柱:KromasilC18柱 (250 ×4.6 mm, 5
μm,瑞典), CQX25-06超声波清洗器 (上海必能信
超声有限公司), Sartorius电子天平 BP211D型(美
国 ,十万分之一)。
葫芦巴皂苷 B对照品 ,葫芦巴皂苷 A对照品 ,
葫芦巴皂苷 C对照品 (本所自制 ,含量均 >98%),
中药葫芦巴种子(分别购于四川 、河南 、甘肃 、安徽 、
广东 、新疆 、湖北 、贵州 、陕西 、云南 ,经本院生药室苏
光明教授鉴别为正品)。
甲醇(分析纯 , 成都化学试剂厂),乙腈(色谱
纯 ,美国 TEDIA),磷酸(AR,成都化学试剂厂),重
蒸馏水(自制)。
2　方法与结果
2.1　供试品溶液的制备
取适量葫芦巴种子 ,粉碎 , 60 ℃干燥至重量不
再减失后 ,过 20目筛 ,精密称定 1.00 g于 100 mL
圆底烧瓶中 ,每次加入 30mL甲醇 ,回流 1.5h,共提
取 3次 ,合并提取液后 ,过滤 , 回收溶剂。加入 50
mL甲醇溶解残留物 ,精密量取溶液 25mL于蒸发皿
DOI :10.16333/j.1001-6880.2007.05.029
中 , 60 ℃水浴蒸干 ,残渣用适量水溶解 ,溶液转入 10
mL容量瓶中 ,超声振荡 10min,用流动相定容 , 0.45
μm微孔滤膜过滤 ,备用。
2.2　对照品溶液的制备
精密称定葫芦巴皂苷 B对照品 8.00 mg于 10
mL容量瓶中 ,用流动相溶液溶解 ,定容 ,备用 。浓度
为 0.80 mg/mL。
2.3　色谱条件的选择和系统适应性试验
2.3.1　色谱条件的选择
实验时比较了 3根不同厂家类型的色谱柱(1)
AgilentODS250×4.6 mm, 5μm;(2)DimakC18 150
×4.6 mm, 5μm;(3)KromasilC18 250×4.6 mm, 5
μm,从色谱峰分离度 ,理论塔板数 ,峰形等方面比
较 ,选择(3)为试验色谱柱;比较了甲醇-水 , 甲醇-
0.2%磷酸溶液 ,乙腈-水 ,乙腈-0.2%磷酸溶液 ,不
同比例 ,通过多次试验 ,选择了乙腈-0.2%磷酸溶液
(83:17)作流动相 ,分离效果良好;比较了 20、30、40
℃,柱温达到 40℃时 ,样品才能很好的分离 。所以
确定色谱条件如下:色谱柱:KromasilC18柱(250 ×
4.6 mm, 5 μm);柱温:40 ℃, DAD检测器 ,检测波
长:203 nm;流动相:乙腈 -0.2%磷酸溶液(83:17),
流速 1 mL/min。
2.3.2　色谱系统适应性试验
按 2.3.1项下色谱条件分别进样 10 μL对照品
溶液和样品溶液进行分析(谱图 A、谱图 B),在本试
验条件下 ,样品中的葫芦巴皂苷 B保留时间与对照
品一致 ,其分离度 >1.5,符合分析要求 ,按葫芦巴皂
苷 B计算 ,理论塔板数 7000以上。结果见图 1。
图 1　葫芦巴皂苷 B色谱图
Fig.1　ChromatogramofHulubasaponinB
＊葫芦巴皂苷 BHulubasaponinB
2.4　线性关系考察
分别吸取 2、4、6、8、10、12、14 μL对照品溶液进
样 ,记录峰面积 ,以葫芦巴皂苷 B峰面积(mau)为纵
坐标 Y,对照品进样量 (μg)为横坐标 X进行线性
回归 ,其直线回归方程为 Y=269.23735X-19.06667(R
=0.99996),线形范围为 1.60 ～ 11.20 μg。
2.5　精密度考察
精密吸取 0.80mg/mL的葫芦巴皂苷 B对照品
溶液 10 μL,重复进样 5次 ,测定其峰面积积分值 ,
其 RSD=0.65%(n=5),表明此方法具有很好的精
密度 。
2.6　稳定性考察
精密吸取供试品溶液 10 μL,测定 5次 ,每次间
隔 3h,以 5次供试品中葫芦巴皂苷 B峰面积分值计
算其 RSD=0.84%(n=5),表明样品溶液在 15h内
稳定 。
2.7　重现性考察
精密称取同一批次的药材 ,按 2.1项下方法制
备 5份供试品溶液 ,分别测定 ,以 5次供试品中葫芦
巴皂苷 B峰面积分值计算其 RSD=0.98%(n=5),
表明此方法重现性良好 。
2.8　加样回收率试验
精密称定已知葫芦巴皂苷 B含量的葫芦巴种
子(葫芦巴皂苷 B含量 0.892%)0.4 ～ 1.2 g,共 6
份 ,分别加入葫芦巴皂苷 B对照品 4 ～ 12 mg。按
2.1项下方法制备 6份供试品溶液 ,分别测定 ,计算
得出加样回收率及试验结果的 RSD,平均加样回收
率为 99.83%, RSD为 1.47%。结果见表 1。
表 1　葫芦巴皂苷 B加样回收率测定(n=6)
Table1　RecoveriesofHulubasaponinB(n=6)
样品
Sample
(g)
含量
Content
(mg)
实际加入葫
芦巴皂苷 B
Actual
Added
Huluba
saponinB
(mg)
检测结果
Found
(mg)
测定加入葫
芦巴皂苷 B
Determination
added
Huluba
saponinB
(mg)
加样回收率
Recovery
(%)
0.396 3.532 4.004 7.590 4.058 101.35
0.415 3.702 3.882 7.641 3.939 101.47
0.723 6.449 8.023 14.438 7.989 99.58
0.702 6.262 8.121 14.403 8.141 100.25
1.015 9.017 12.018 20.798 11.781 98.03
0.992 8.849 11.918 20.565 11.717 98.31
3　样品的含量测定
　　将 10个不同产地的葫芦巴 ,按 2.1项下方法制
备 10份供试品溶液 ,按照 2.3.1项下色谱条件测得
葫芦巴皂苷 B峰面积 ,计算得含量 ,结果见表 2。
4　葫芦巴皂苷类成分分析
　　葫芦巴种子中主要含三糖皂苷 A[ 4] 和四糖皂
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苷 B、C[ 1] ,皂苷 A的化学结构为:rha1※ 4glc1※
4glc1※3 diosgenin;皂苷 B的化学结构为 rha1※ 3
rha1※4glc1※4glc1※3diosgenin;皂苷 C的化学
表 2　不同产地的葫芦巴皂苷 B含量测定(n=3)
Table2　ContentofHulubasaponinBinsamplesfromdifferent
sources(n=3)
样品编号
Samplenumber
产地
Producingarea
平均含量
Averagecontent(mg/g)
1 河南 Henan 7.87
2 安徽 Anhui 8.92
3 甘肃 Gansu 8.86
4 四川 Sichuan 9.45
5 广东 Guangdong 5.24
6 新疆 Xinjiang 8.98
7 贵州 Guizhou 7.45
8 云南 Yunnan 6.63
9 湖北 Hebei 9.12
10 陕西 Shanxi 6.95
结构为:glc1※4rha1※4 glc1※4 glc1※3diosge-
nin。皂苷 B、C结构相近 ,极性差异小 ,使用薄层色
谱法难以分离 。使用本方法分离皂苷 B、C达到很
好效果 ,分离度远远大于 1.5,色谱峰对称性好 ,理
论塔板数高 。皂苷 A的分离也达到很好的效果 。
　　将这 3个由葫芦巴种子中提取分离纯化得到的
皂苷类成分混合 ,按照 2.3.1项下色谱条件考察相
对位置 。葫芦巴皂苷 C保留时间在 12min左右 ,葫
芦巴皂苷 B保留时间在 17.5min左右 ,葫芦巴皂苷
A保留时间在 22.5min左右 ,结果见图 2。
图 2　葫芦巴 3种皂苷类成分的色谱图
Fig.2　ChromatogramofthreesaponinsinHuluba
1.葫芦巴皂苷 C;2.葫芦巴皂苷 B;3.葫芦巴皂苷 A
1.HulubasaponinC;2.HulubasaponinB;3.HulubasaponinA
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