全 文 ：云 南 中 医 中 药 杂 志
* 基金项目:辽宁省博士启动基金项目:黑参抗肿瘤药效物质基础研究(NO:20121135)
作者简介:袁媛(1980 －)，女，汉，博士后，副研究员，研究方向:生药学，E － mail:yuanyuanvictory@ 163. com。
实时荧光定量 PCＲ检测黑参对 S180 荷瘤小鼠 TNF － α mＲNA表达的影响*
袁 媛，黄 赫，甘 雨，王 菲
(辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)
摘要:目的 实时荧光定量 PCＲ检测黑参对 S180 肿瘤模型小鼠 TNF － α mＲNA表达的影响，应用分子生物学手段分析黑参
抑制肿瘤的机制。方法 采取腋下注射 S180肿瘤细胞制得小鼠肿瘤模型，随机分成空白对照组、环磷酰胺组、消癌平组、红参高剂
量组、红参中剂量组、红参低剂量组、黑参高剂量组、黑参中剂量组和黑参低剂量组。除空白对照组外，其他实验组均采取同时灌
胃给药。测定小鼠给药前后体重、给药后瘤重，计算抑瘤率，利用 IDTDNA设计引物，应用实时荧光定量 PCＲ检测不同组TNF － α
表达丰度。结果 与空白对照组相比，所有实验组肿瘤质量都有所减少。除消癌平和环磷酰胺外，使用高剂量黑参和低、中剂量
红参对肿瘤重量的抑制较为显著(P ＜ 0. 01)。实时荧光定量 PCＲ显示，同对照组及其他实验组相比，高剂量黑参组和低剂量红参
组 TNF － α表达量上调(P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05)。结论 综上，使用高剂量黑参和低剂量红参能够提高小鼠 TNF － α转录表达水平并
减少肿瘤重量，其中高剂量黑参组效果更明显。
关键词:黑参;抗肿瘤;荧光实时定量;TNF － α
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标志码:A 文章编号:1007 － 2349(2015)09 － 0055 － 03
Detection of the Effect ofBlack Ginseng on TNF －α mＲNA Presentation of S180
Tumor － bearing Mice by Ｒeal － Time Fluorescence Quantitative PCＲ
YUAN Yuan，HUANG He，GAN Yu，WANG Fei
(Liaoning Institute of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110034，Liaoning)
【Abstract】Objective:To detect the effect ofBlack Ginseng on TNF － α mＲNA presentation of S180 tumor － bearing mice by real －
time fluorescence quantitative PCＲ and analyze the tumor inhibition effect ofBlack Ginseng by molecular biological method． Methods:
Tumor － bearing mice models were made by armpit injection of S180 tumor cells and were randomly divided into a control group，a cyclo-
phosphamide group，aXiaoaiping group，high，medium and low dose groups ofＲed Ginseng and high，medium and low dose groups ofBlack
Ginseng． Except the control group，the other experimental groups were given intragatric administration． The mice weight in the pre － ad-
ministration and the mice tumor weight in the post － administration were measured． Anti － tumor rate was calculated and IDTDNA primers
were used． Ｒeal － time fluorescence quantitative PCＲ was used to detect different TNF － α presentations． Ｒesults:Compared with the con-
trol group，the tumor mass in the experimental groups declined． Except theXiaoaiping group and the cyclophosphamide group，the high －
doseBlack Ginseng group and low and medium － doseＲed Ginseng groups showed more obvious inhibition effect on tumor weight (P ＜ 0．
01)． Ｒeal － time PCＲ showed that when compared with the control group and other groups，the high － doseBlack Ginseng group and the
low doseＲed Ginseng group upregulated TNF － α presentation (P ＜ 0． 01，P ＜ 0． 05)． Conclusion:The high － doseBlack Ginseng group
and the low － doseＲed Ginseng group can improve the TNF － α transcriptional presentation in mice and reduce tumor weight，among which
the high － doseBlack Ginsenggroup is more effective．
【Key words】Black Ginseng，antitumor，real － time fluorescence quantitative PCＲ，TNF － α
人参(Panax ginseng C. A. Meyer)为五加科植物人参的干
燥根，是亚洲常见药材，具有很高的药用价值和历史文化价
值，被誉为“草药之王”，在科学研究领域和国际市场一直占有
极其重要的地位，已经被传统医学乃至全世界广泛应用。其
性平，味甘、微苦，微温，用于大补元气、复脉固脱、补脾益肺、
生津止渴、安神益智。现代临床医学和药理学研究表明，人参
具有提高机体免疫力、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖以及抗炎等多
种活性，因此在医学及养生方面具有可观的价值。近年来，各
种各样的人参炮制品作为功能食品用于饮食文化中，其中包
括白参、红参、黑参等。黑参是利用传统的九蒸九曝炮制方法
将人参反复蒸制烘干而得到的一种人参深加工品，是继红参
后的又一新人参商品［1］。有文献报道，黑参比白参和红参有
552015 年第 36 卷第 9 期
DOI:10.16254/j.cnki.53-1120/r.2015.09.027
云 南 中 医 中 药 杂 志
更强的抗肿瘤、抗炎、提高免疫力等生物活性。黑参具有很好
的开发前景。
当人体受到某些外界不利因素影响，局部的细胞会发生
失控性增殖而形成的新生物即肿瘤，常伴有肿块。肿瘤有良
性和恶性之分，良性肿瘤通常可通过手术切除，而恶性肿瘤往
往会导致癌症的发生。由于恶性肿瘤难以治疗和较高的死亡
率，已成为 21 世纪人类的第一大杀手。正是因为如此，新的
有效的抗肿瘤药物的研发势在必行。黑参的炮制方法各不相
同，但大多是将鲜人参经过多次蒸晒而成的外观和化学成分
发生改变的一类人参新炮制品。研究显示黑参除了具有提高
免疫力、对抗炎症反应、防氧化、保护神经等功能，在抗肿瘤方
面也发挥重要作用［2 － 5］。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor
－ α，TNF － α)由单核细胞和巨噬细胞分泌，对肿瘤细胞有抑
制和杀伤的功效，可被用来研究肿瘤的发生、发展［6］。本研究
利用实时荧光定量 PCＲ 检测黑参对 S180肿瘤模型小鼠TNF －
α mＲNA表达，从分子水平探讨黑参抗肿瘤机制。
1 实验材料
1. 1 肿瘤细胞和实验动物 S180肿瘤细胞购自上海;SPF 级
实验小鼠 90 只，(21 ± 3)g，购自辽宁长生生物技术有限公司，
许可证号:SCXK(辽)2010 － 0001。
1. 2 实验药物 实验所用黑参和红参溶液为辽宁省中医药
研究院科研制备。消癌平(南京圣和药业有限公司，批号:
201304241)，刮去糖衣研成粉末待用;环磷酰胺(通化茂祥制
药有限公司，批号:130201)，刮去糖衣研成粉末待用;红参购
自辽宁省中医药研究院中药局;黑参按以往研究自制得到［2］。
1. 3 实验仪器 罗氏 MPLC 2. 0 全自动核酸分离纯化系统
(德国罗氏公司);罗氏 LC480 实时荧光定量 PCＲ 仪(德国罗
氏公司);罗氏组织匀浆仪(德国罗氏公司)。
1. 4 实验试剂 罗氏 ＲNA 纯化试剂盒(组织用)货号
03330591001;罗氏反转录第一链 cDNA 合成试剂盒货号
04896866001;罗氏组织匀浆仪用锣盖管货号 03358941001、罗
氏 SYBＲ GＲEEN 染料货号 04707516001;引物由本研究组设
计，并由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
2 实验方法
2. 1 构建 S180荷瘤小鼠模型和给药 分组前称重，将 90 只小
鼠按体重分为 9 组，即正常对照组、环磷酰胺组、消癌平组、红
参低剂量组、红参中剂量组、红参高剂量组、黑参低剂量组、黑
参中剂量组、黑参高剂量组。注射 S180瘤株前外科手术器械高
压灭菌。S180瘤株经生理盐水洗涤和活细胞计数后，在超净工
作台中经小鼠腋下注射接种。正常对照组只构建肿瘤模型但
不给药，消癌平组和环磷酰胺组给药量均为 25 mg /kg(按成人
每天服用量换算)，每天 1 次，连续 10 天。红参低、中和高剂
量组小鼠给药量分别为 13. 6 g /kg 生药量、27. 2 g /kg 生药量
和 40. 8 g /kg生药量，每天 1 次，连续 10 天;黑参低、中和高剂
量组小鼠给药量分别为 13. 6 g /kg 生药量、27. 2 g /kg 生药量
和 40. 8 g /kg生药量，每天 1 次，连续 10 天。
2. 2 抑瘤率计算 小鼠给药第 10 天，禁食不禁水，第 11 天
称量体重，用颈椎脱臼法处死小鼠，打开胸腔，完整剥离腋下
肿瘤块、称取瘤块重量、拍照后将其冻存于 － 80℃冰箱待检。
根据称得的重量，计算抑瘤率(inhibitory rate，IＲ)。计算公式
为 IＲ =(1 －实验组平均瘤重 /对照组平均瘤重 × 100%。
2. 4 提取瘤块总 ＲNA 及 cDNA 的获得 首先启动全自动核
酸分离纯化系统，进行自动涂油脂(每次实验前)和漏液检测
(每个月一次)。检查无故障后，选取小鼠新鲜瘤块组织，每组
选 3 个，在电子天平上分别称取等质量(0. 01 g)的瘤块并加
到放有 450μl组织裂解液的锣盖管中。使用罗氏组织匀浆仪
6500 rpm，50s 重复裂解 2 次。样品室温培育 30 min。13000
rpm，2 min，吸取裂解匀浆 350 μL加入到 MPLC 2. 0 系统的样
本槽中。将样本槽放到 MPLC 2. 0 系统中，同时放置好洗脱
槽、储存槽、加工槽、吸头站和反应吸头、废物袋等。依据
“ＲNA Tissue Fresh － Frozen”程序选择样本量为 200μl 并按要
求加注试剂桶，一切就绪后运行程序。
取 5μl的各样本 ＲNA，用罗氏 LC480 完成 cDNA 合成反
应，按罗氏 cDNA 合成试剂盒说明依次添加 Oligo(dT)18 1
μL，ＲNase free ddH2O 7 μL，混匀离心，65℃热变性 10 min，然
后加 Protector ＲNase Inhibitor 0. 5 μL，Ｒeverse Transcriptase
Buffer 4 μL，Deoxynucleotide Mix 2 μL，Ｒeverse Transcriptase
0. 5 μL，混匀离心，55℃ 30min，85℃ 5min，37℃ + ∞。
2. 5 实时荧光定量 PCＲ检测 TNF － α 基因的表达丰度 利
用 NCBI上 OＲF Finder找到小鼠 TNF － α 基因(GeneBank 登
录号:BC137720)的翻译区和非翻译区，并使用在线软件
IDTDNA在其 3’非翻译区设计基因特异性引物(GSP 引物)，
内参基因选择 β － Actin。上游 GSP 引物 F:5’－ GGGTGT-
TCATCCATTCTCTACC － 3’;下游 GSP引物 Ｒ:5’－ GTCCCAG-
CATCTTGTGTTTC － 3’。内参基因 β － Actin － F:5’－ GGC-
CGTGATCTCCTTCTG － 3’;内参基因 β － Actin － Ｒ:GGGACCT-
GACCGACTACCT。反应使用 SYBＲ GＲEEN 染料，在罗氏
LC480 实时荧光定量 PCＲ仪上进行。每个样本三次实验学重
复，反应体系包括罗氏 SYBＲ GＲEEN Master Mix 10μl，上下游
引物各 1μl，cDNA 模板 2μl，ＲNase － free ddH2O 6μl。反应程
序设置如下:95℃ 10min，然后 95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 20s，
50cycles。本研究使用相对定量方法，应用 2 － ΔΔCt 分析
数据。
2. 6 统计学分析 利用 SPSS 17. 0 统计软件处理数据，各组
所得数据以平均值 ±标准差表示，不同组间的均值比较采用 t
检验，当 P ＜ 0. 05 即两组的差异有统计学意义，当 P ＜ 0. 01 则
两组有显著性差异。
65 2015 年第 36 卷第 9 期
云 南 中 医 中 药 杂 志
3 结果
3. 1 各组小鼠 S180实体瘤瘤重和抑瘤率 黑参高剂量组瘤
重、环磷酰胺组瘤重、红参高剂量组瘤重与空白组相比有统计
学意义(P ＜ 0. 05)，抑瘤率方面也是这三组有统计学意义
(P ＜ 0. 05)，结果见表 1。
表 1 各组小鼠 S180实体瘤瘤重和抑瘤率
分组 n 实体瘤瘤重(g) 抑瘤率(IＲ，%)
空白对照组
消癌平组
环磷酰胺组
黑参高剂量组
黑参中剂量组
黑参低剂量组
红参高剂量组
红参中剂量组
红参低剂量组
8
9
9
10
10
10
9
9
10
1. 516 ± 0. 217
0. 666 ± 0. 242
0. 230 ± 0. 093*
0. 574 ± 0. 190*
0. 903 ± 0. 325
1. 073 ± 0. 510
1. 270 ± 0. 139
0. 744 ± 0. 162
0. 721 ± 0. 189*
0
56. 06
84. 83*
62. 16*
40. 48
29. 27
16. 24
50. 95
52. 43*
注:与空白对照组相比，* P ＜ 0. 05
3. 2 各组实体瘤 TNF － α 基因的实时荧光定量 PCＲ 检测
如图 1 为所有实验组实体瘤 TNF － α基因和内参 β － Actin基
因以 Ct值为横坐标，以基因相对荧光强度为纵坐标的扩增曲
线。该曲线显示目的基因和内参基因的指数增长期和平台期
较为明显，在 15 － 35 个循环数范围内可检测到 Ct 值，扩增曲
线正常，实验数据可靠，可用于相对定量分析。
图 1 实验组 TNF － α基因和内参 β － Actin基因实时荧光定量
PCＲ的扩增曲线，横坐标为 Ct值，纵坐标为基因相对荧光强度
不同实验组 TNF － α mＲNA 相对表达量的分析结果见图
2 和表 2。消癌平组、红参低剂量组的 TNF － α mＲNA 相对表
达量与空白对照组相比具统计学意义(P ＜ 0. 05)，黑参高剂量
组具有显著性差异(P ＜ 0. 05)。
图 2 各实验组 TNF － α mＲNA相对表达量(ＲQ)的柱形图，
纵坐标为相对表达量，空白对照组 ＲQ设置为 1
表 2 各组小鼠 TNF － α mＲNA相对表达量(ＲQ)
分组 相对表达量(ＲQ) 分组 相对表达量(ＲQ)
空白对照组 1. 00 ± 0. 68 红参高剂量组 0. 69 ± 0. 23
消癌平组 3. 38 ± 0. 61* 黑参低剂量组 0. 38 ± 0. 58
环磷酰胺组 1. 23 ± 0. 37 黑参中剂量组 0. 82 ± 0. 48
红参低剂量组 3. 67 ± 0. 44* 黑参高剂量组 6. 24 ± 0. 25＊＊
红参中剂量组 1. 74 ± 1. 35
注:与空白对照组相比，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
4 讨论
人类社会迅猛发展随着而来的是自然环境污染、人口老
龄化和不良生活习惯的产生，进而导致浊邪滋生和肿瘤化生。
体内肿瘤坏死因子 TNF － α 有能够增强机体免疫功能、抗肿
瘤等作用［7］，因此，未来我们可将 TNF － α与黑参结合观察抗
肿瘤疗效，为新药研发提供基础。
本实验使用 S180荷瘤小鼠作为动物模型，TNF － α 为检测
基因，对黑参抗肿瘤分子机制进行研究。研究结果显示，使用
黑参和红参对肿瘤重量都有抑制作用，以黑参高剂量组和红
参低剂量组抑制作用较好，且高剂量黑参组抑瘤率高于已上
市中药对照消癌平组，说明将黑参开发成抗肿瘤中药或保健
品具有广阔前景。实时荧光定量 PCＲ显示，黑参高剂量组、红
参低剂量组和消癌平组同空白对照组相比 TNF － α mＲNA 表
达量上调，提示服用红参和黑参均能上调小鼠 TNF － α mＲNA
的表达丰度且黑参高剂量组更明显，说明黑参可能通过上调
TNF － α mＲNA的表达丰度来发挥其抗肿瘤功效，而西药对照
环磷酰胺组可能通过其他途径抑制肿瘤。
参考文献:
［1］袁媛，徐荣培 . 人参新炮制品—黑参的研究进展［J］. 中华中医药
学刊，2013，31(11):2379 － 2381.
［2］袁媛，于艳，徐荣培 . HPLC法测定 19 个人参新炮制品—黑参样品
中的人参皂苷含量［J］. 辽宁中医杂志，2013，40 (10):
1993 － 1995.
［3］Seo YB. High value － added health food of black ginseng［M］. Korea，
2008:35 － 36.
［4］Kang KS，Kim HY，Pyo JS，et al. Increase in the free radical scavenging
activity of ginseng by heat － processing［J］. Biological and Pharmaceu-
tical Bulletin，2006，29:750 － 754.
［5］Kim KT，Yoo KM，Lee JW，et al. Protective effect of steamed American
ginseng on V79 － 4 cells induced by oxidative stress［J］. Journal of
Ethnopharmacology，2007b，111:443 － 450.
［6］丁凯宏 . 肿瘤坏死因子在肿瘤研究中的进展［J］. 吉林医学，
2012，33(4):823 － 824.
［7］崔力方，郭晓静，付丽 . TNF － α 与肿瘤发生发展关系的研究
进展［J］. 中华乳腺病杂志(电子版)，2007，1(6)
(收稿日期:2015 － 06 － 22)
752015 年第 36 卷第 9 期