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赶黄草总黄酮对小鼠肝损伤的保护作用



全 文 :河南农业科学,2015,44( 6) : 142-146
Journal of Henan Agricultural Sciences doi: 10. 15933 / j. cnki. 1004-3268. 2015. 06. 031
收稿日期:2014 - 12 - 30
基金项目:四川农业大学教改项目(X2014006);四川省富民强县项目(20130720)
作者简介:舒 刚(1978 -),男,重庆人,副教授,硕士,主要从事中药药理学研究。E - mail:cndyx2005@ 163. com
* 通讯作者:汪开毓(1955 -),男,四川荥经人,教授,博士,主要从事药理与毒理学研究。E - mail:ky-wang@ sicau. edu. cn
赶黄草总黄酮对小鼠肝损伤的保护作用
舒 刚,张 露,赵 谨,郑艺蕾,古小云,汪开毓*
(四川农业大学 动物医学院,四川 成都 611130)
摘要: 为研究赶黄草总黄酮对脂多糖( LPS) 诱发的肝损伤的保护作用,将 50 只昆明种小鼠随机分
为空白组、模型组、联苯双酯阳性对照组及赶黄草总黄酮高、低剂量组,每组 10 只。赶黄草总黄酮
高、低剂量组分别按照 10 mg /kg、2 mg /kg 的剂量灌服;联苯双酯阳性对照组按照 5 mg /kg 的剂量
灌服;空白组和模型组分别灌胃等容积的生理盐水。连续给药 14 d,观察小鼠生长状况,末次给药
之后 2 h,空白组尾静脉注射生理盐水 2 mL /kg,其余各组尾静脉注射 5 mg /kg LPS,12 h 后眼球取
血处死小鼠,测定小鼠血清中谷丙转氨酶( ALT) 和谷草转氨酶( AST) 活性以及肝匀浆中的超氧化
物歧化酶( SOD) 活性和丙二醛( MDA) 含量。同时将肝脏进行 HE染色,观察小鼠肝脏组织病理学
变化。结果显示,赶黄草总黄酮对小鼠生长有抑制作用。与模型组比较,赶黄草总黄酮高、低剂量
组血清中 ALT活性分别降低 26. 53% ( P < 0. 01) 、16. 74% ( P < 0. 05) ,AST 活性分别降低 12. 50%
( P < 0. 05) 、9. 88% ( P < 0. 05) ,SOD活性分别升高 26. 46% ( P < 0. 05) 、21. 77% ( P < 0. 05) ,MDA
含量分别降低 48. 73% ( P < 0. 05 ) 、59. 80% ( P < 0. 01 ) ; 小鼠肝脏指数分别降低 10. 36% ( P <
0. 05) 、3. 80% ( P > 0. 05) ;赶黄草总黄酮各剂量组肝组织病变程度明显减轻。以上结果表明,赶黄
草总黄酮对 LPS诱导的小鼠肝损伤有保护作用。
关键词: 赶黄草总黄酮; 脂多糖; 肝损伤; 保肝作用
中图分类号:S859. 3;R285. 5 文献标志码:A 文章编号:1004 - 3268(2015)06 - 0142 - 05
Protective Effect of Total Flavonoid of Penthorum chinense Pursh
on Experimental Liver Injuries in Mice
SHU Gang,ZHANG Lu,ZHAO Jin,ZHEN Yilei,GU Xiaoyun,WANG Kaiyu*
(College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China)
Abstract:To investigate the role of total flavone in Penthorum chinese Pursh in protection of LPS-induced
liver injury in mice.Fifty Kunming mice were randomly divided into five groups,including a control group,
and a model group that were both administrated with equal volume of physiological saline,a high-dose
treating group and a low-dose treating group(administrated with 10 mg /kg and 2 mg /kg doses of total
flavone in Penthorum chinese Pursh),and a positive control group (administrated with 5 mg /kg
bifendate). 14 days later,two hours after the last administration,the control group was injected with
2 mL /kg physiological saline via tail vein while other groups were injected with 5 mg /kg LPS. 12 hours
later,we measured ALT & AST activities of serum,SOD & MDA activities and levels of liver homogenate
in mice. Neither high-dose nor low-dose treating group administrated with total flavone in Penthorum chinese
Pursh had a positive effect in mice. Compared to the model group,it reduced the ALT activity by 26. 53%
(P <0. 01),16. 74%(P < 0. 05),the AST activity by 12. 50%(P < 0. 05),9. 98%(P < 0. 05),the MDA
concentration by 48. 73%(P < 0. 05),59. 80%(P < 0. 01),the liver index 10. 36%(P < 0. 05),3. 80%
(P >0. 05),and increased the SOD activity by 26. 46%(P < 0. 05),21. 77%(P < 0. 05). Those groups
第 6 期 舒 刚等:赶黄草总黄酮对小鼠肝损伤的保护作用
that were administrated with total flavone in Penthorum chinese Pursh had been shown to alleviate liver
injury and inflammatory cells infiltration through H. E staining. Total flavone in Penthorum chinese Pursh
had a protective effect on LPS-induced liver injury in mice.
Key words:total flavonoid of Penthorum chinense Pursh;LPS;liver injuries;liver protection
现代养殖业以集约化、规模化、高密度、周期短
为特点,由于疫病的压力巨大,养殖企业往往在动物
日粮和疾病防治中大量使用抗生素等化学药品[1]。
但化学药品的过度使用往往对肝脏造成过度伤害,
影响肝脏的正常机能,进而影响畜禽的生长性
能[2]。赶黄草(Penthorum chinense Pursh)能活血化
瘀,抑制肝纤维化、肝硬化,其中的没食子酸和槲皮
素等成分均被证明具有抗肝炎病毒和保护肝组织的
作用[3]。前人研究[4]表明,赶黄草的水提取物有一
定的利胆退黄作用。但目前关于赶黄草在畜牧业生
产中的应用研究较少。为此,研究赶黄草总黄酮对
细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱发的小鼠肝
损伤的影响,旨在为赶黄草的开发及其在畜牧业生
产中的应用提供参考。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试动物 健康成年昆明种小鼠(由成都
中医药大学实验动物中心提供)50 只,雌雄各半,
体质量 18 ~ 22 g。在 25 ~ 28 ℃正常环境中适应性
喂养 3 d后,随机分为 5 个组,每组各 10 只。
1. 1. 2 药物 赶黄草购于四川省古蔺县赶黄草合
作社,提取总黄酮,具体步骤如下:称取赶黄草
200 g,粉碎,加入 70%乙醇 4 000 mL,浸泡 4 h,然后
回流提取 90 min,过滤得提取液。滤渣再次加入同
样体积乙醇,重复操作 2 次。以上滤液经 80 ℃水浴
旋转蒸发回收乙醇后,减压浓缩干燥得赶黄草总黄
酮,4 ℃备用。应用时加数滴吐温 - 80,用生理盐水
配至所需质量浓度:药液每毫升含粗提取物干物质
分别为 0. 10、0. 05 g。
联苯双酯 (批号 H11020979)购自北京协
和药厂。
1. 1. 3 试剂 脂多糖(批号 20130625)购于 Sigma
公司;谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒(批号 C009 -
1)、谷 草 转 氨 酶 (AST)测 定 试 剂 盒 (批 号
20130421)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA 法,批
号 20130325)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒
(批号 20130512)、蛋白质测定试剂盒(考马斯亮蓝
法,批号 20130725)均购自南京建成生物工程研究
所。多聚甲醛、乙醇均为分析纯。
1. 1. 4 仪器与设备 台式低速离心机、电热恒温水
浴锅、索式提取器、紫外分光光度计。
1. 2 方法
1. 2. 1 动物分组与处理 将供试动物随机分为
5 组,分别为空白组、模型组、联苯双酯阳性对照组
及赶黄草总黄酮高剂量组(0. 10 g /mL)、低剂量组
(0. 05 g /mL),每组 10 只。赶黄草总黄酮高、低剂
量组分别按照 10 mg /kg、2 mg /kg 灌服;联苯双酯阳
性对照组按照 5 mg /kg 灌服;空白组和模型组分别
灌胃等容积的生理盐水。参照文献[5-6]的方法并
做适当修改,药物组采用灌胃受试药法 14 d,末次给
药后 2 h,空白组按 2 mL /kg的剂量尾静脉注射生理
盐水,其余各组按 5 mg /kg 的剂量尾静脉注射 LPS
进行造模。尾静脉注射后禁食,自由饮水 12 h 后测
体质量并摘除眼球取血,分离血清,处死小鼠,摘取
肝脏等进行有关指标的测定。
1. 2. 2 测定项目
1. 2. 2. 1 小鼠日常观察 试验过程中观察小鼠状
态、食欲、皮毛、精神等情况,并于 1 d、7 d、14 d时称
体质量,记录体质量变化情况。
1. 2. 2. 2 血清酶活性 取分离后的血清 0. 2 mL,
按试剂盒所述方法测定血清中的 ALT、AST活性。
1. 2. 2. 3 组织中的 SOD 活性与 MDA 含量 取约
0. 5 g的肝脏组织,用冰冷生理盐水漂洗,除去血液,
滤纸拭干,称质量,在冰浴盒上剪碎,用生理盐水配
成 10%肝组织液,使用匀浆器制备肝组织匀浆,低
温离心取上清液,按试剂盒说明书所述方法用紫外
可见分光光度计测定肝匀浆中 SOD 活性及 MDA
含量。
1. 2. 2. 4 脏器指数 剖取各组小鼠的肝脏、脾脏、
胸腺、心脏、肺脏及肾脏,称质量,计算脏器指数,公
式如下:小鼠脏器指数 =内脏质量量(mg)/体质量
(g)。
1. 2. 2. 5 肝组织病理学观察 选取每组小鼠肝右
叶组织进行石蜡切片。采用 HE 染色法染色,光镜
下观察各组肝脏病理组织学的变化情况。
1. 3 数据处理
采用 SPSS 17. 0 软件进行统计分析,差异显著
时进行 LSD多重比较,以 P < 0. 01(差异极显著)和
P < 0. 05(差异显著)作为差异显著性判断标准,数
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河南农业科学 第 44 卷
据以平均值 ±标准差表示。
2 结果与分析
2. 1 LPS诱发的肝损伤小鼠日常观察
空白组小鼠,各项生命表征活动正常,体质量稳
步增长;模型组小鼠造模前与空白组表现一致,造模
后精神食欲不振,活动也明显减少;赶黄草总黄酮
高、低剂量组小鼠造模前活动情况接近空白组,但饮
食较少,体质量增长缓慢,造模后精神、采食下降;阳
性对照组造模前与空白组保持一致,饮食及活动情
况均正常,精神状态良好,但体质量增长稍缓慢,造
模后也出现精神萎靡、活动减少。
从表 1 可以看出,在 1—7 d 阶段,空白组体质
量增加显著高于赶黄草总黄酮高剂量组;在 7—14 d
阶段,低剂量、高剂量组体质量增加均极显著低于其
他组;全程增质量比较,赶黄草总黄酮低、高剂量组
体质量增加均显著低于空白组、模型组、阳性对照
组。表明赶黄草总黄酮对小鼠生长有一定抑制
作用。
表 1 各处理组小鼠体质量变化的情况 g
组别 初质量 1—7 d增质量 7—14 d增质量 全程增质量
空白组 19. 23 ± 1. 58a 2. 59 ± 2. 42Aa 2. 83 ± 1. 15Aa 5. 43 ± 3. 19ABa
模型组 19. 97 ± 1. 00a 2. 20 ± 0. 82Aab 3. 92 ± 1. 94Aa 6. 12 ± 1. 38Aa
高剂量组 19. 88 ± 1. 21a 0. 45 ± 2. 63Ab 0. 52 ± 0. 17Bb 0. 97 ± 0. 25Cbc
低剂量组 19. 55 ± 1. 44a 1. 55 ± 1. 38Aab 0. 82 ± 0. 27Bb 2. 37 ± 1. 59BCc
阳性对照组 20. 10 ± 1. 21a 1. 38 ± 1. 72Aab 2. 92 ± 0. 31Aa 4. 30 ± 2. 69ABa
注:同列肩标不同大写字母表示差异极显著 (P < 0. 01),不同小写字母表示差异显著 (P < 0. 05),下表同。
2. 2 赶黄草总黄酮对 LPS诱发的肝损伤小鼠血清
ALT、AST活性的影响
由表 2 可知,与空白组相比,模型组小鼠的
ALT、AST 活性分别升高 91. 25% (P < 0. 01)、
35. 60%(P < 0. 05),表明 LPS对小鼠肝细胞造成了
严重的损伤,造模成功。与模型组相比,赶黄草总黄
酮高、低剂量组的 ALT 活性分别降低26. 53%(P <
0. 01)、16. 74%(P < 0. 05)。赶黄草总黄酮高、低剂
量组 AST活性与空白组差异不显著(P > 0. 05),分
别低于模型组 12. 50% (P < 0. 05)、9. 88% (P <
0. 05)。与阳性对照组相比,赶黄草总黄酮高、低剂
量组的 AST 活性分别升高 59. 22% (P < 0. 01)、
63. 99%(P < 0. 01)。
表 2 赶黄草总黄酮对 LPS肝损伤小鼠血清
ALT、AST活性的影响 U/L
组别 ALT活性 AST活性
空白组 15. 65 ± 2. 26Bb 42. 19 ± 7. 76ABb
模型组 29. 93 ± 5. 07Aa 57. 21 ± 3. 90Aa
高剂量组 21. 99 ± 4. 60Bb 50. 06 ± 1. 87ABb
低剂量组 24. 92 ± 2. 82Ab 51. 56 ± 2. 93ABb
阳性对照组 16. 91 ± 3. 17Bb 31. 44 ± 8. 45Cc
2. 3 赶黄草总黄酮对 LPS诱发的肝损伤小鼠肝脏
组织 SOD活性和MDA含量的影响
由表 3 可知,与模型组比较,空白组、阳性对照
组及赶黄草总黄酮高、低剂量组小鼠肝匀浆 SOD 活
性分别升高 24. 66% (P < 0. 05)、36. 14% (P <
0. 01)、26. 46%(P < 0. 05)、21. 77%(P < 0. 05) ,小
鼠肝匀浆 MDA含量分别降低 42. 51%(P < 0. 01)、
54. 03%(P < 0. 01)、48. 73%(P < 0. 01)、59. 80%
(P < 0. 01),且除模型组外,其余各组间 SOD 活性
和 MDA含量差异均不显著。表明,赶黄草总黄酮
能提高肝脏抗氧化的能力。
表 3 赶黄草总黄酮对 LPS肝损伤小鼠肝脏
组织MDA含量和 SOD活性的影响
组别
SOD活性 /
(U /mg)
MDA含量 /
(nmol /mg)
空白组 115. 36 ± 6. 29ABa 12. 47 ± 1. 42Bb
模型组 92. 54 ± 5. 64Bb 21. 69 ± 4. 42Aa
高剂量组 117. 03 ± 10. 16ABa 11. 12 ± 2. 52Bb
低剂量组 112. 69 ± 2. 99ABa 8. 72 ± 4. 02Bb
阳性对照组 125. 98 ± 16. 61Aa 9. 97 ± 4. 38Bb
2. 4 赶黄草总黄酮对 LPS诱发的肝损伤小鼠脏器
指数的影响
病理剖检发现,模型组肝脏肿大、瘀血,肺脏充
血、瘀血严重;而空白组各器官正常;阳性对照组、赶
黄草总黄酮高剂量组外观基本正常;赶黄草总黄酮
低剂量组肝脏轻微肿大,肺部有瘀血。从表 4 可以
看出,与模型组相比,空白组、阳性对照组及赶黄草
总黄酮高、低剂量组小鼠的肝脏指数分别降低
12. 69%(P < 0. 05)、20. 69%(P < 0. 05)、10. 36%
(P < 0. 05)、3. 80%(P > 0. 05);与模型组相比,阳
性对照组及赶黄草总黄酮高、低剂量组小鼠的脾脏
指数分别升高10. 92% (P < 0. 05)、9. 66% (P <
0. 05)、9. 45% (P > 0. 05),肺脏指数分别降低
21. 98%(P > 0. 05)、19. 63% (P > 0. 05)、8. 89%
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第 6 期 舒 刚等:赶黄草总黄酮对小鼠肝损伤的保护作用
(P > 0. 05)胸腺指数、心脏指数及肾脏指数各组间 差异均不显著。
表 4 赶黄草总黄酮对 LPS肝损伤小鼠脏器指数的影响 mg /g
组别 肝脏指数 脾脏指数 胸腺指数 心脏指数 肺脏指数 肾脏指数
空白组 49. 13 ± 3. 70Ab 4. 22 ± 1. 24Ab 1. 42 ± 0. 82a 5. 79 ± 1. 11a 4. 34 ± 0. 113Ab 7. 38 ± 1. 15a
模型组 56. 27 ± 4. 57Aa 4. 76 ± 1. 20Ab 1. 45 ± 0. 17a 5. 96 ± 2. 13a 5. 96 ± 0. 19Aa 7. 31 ± 2. 22a
高剂量组 50. 44 ± 2. 75Ab 5. 22 ± 2. 28Aa 1. 42 ± 0. 14a 6. 49 ± 1. 13a 4. 79 ± 0. 21Aab 7. 74 ± 1. 70a
低剂量组 54. 13 ± 4. 85Aab 5. 21 ± 3. 47Aab 1. 47 ± 0. 01a 5. 83 ± 2. 13a 5. 43 ± 0. 31Aa 7. 55 ± 2. 21a
阳性对照组 44. 63 ± 3. 32Ab 5. 28 ± 2. 31Aa 1. 43 ± 0. 16a 6. 30 ± 1. 11a 4. 65 ± 0. 23Aab 7. 21 ± 2. 26a
2. 5 小鼠肝脏病理学观察结果
图 1A、图 1B为显微镜下观察正常小鼠的肝组
织,可见结构清晰,肝索排列整齐,肝小叶无肿胀和
坏死,无炎性细胞浸润和纤维结缔组织增生。图
2A、图 2B为显微镜下观察 LPS模型组小鼠肝组织,
可见肝细胞索离断,肝小叶结构紊乱,其间大片肝细
胞坏死消失伴大量淋巴细胞浸润,并出现明显肿胀,
这说明造模成功。图 3A、图 3B 为显微镜下观察高
剂量组小鼠肝组织,可见肝细胞坏死、变形程度有所
改善,炎性浸润也减少,破坏程度较模型组减轻,肝
索排列紊乱。图 4A、图 4B 为显微镜下低剂量组小
鼠肝组织,主要表现为不同程度细胞变形和炎性浸
润,部分组织可见坏死细胞及正常细胞交错现象,肝
细胞排列紊乱。图 5A、图 5B 为显微镜下阳性对照
组小鼠肝组织,可见再生现象,再生结节较模型组明
显增多,炎性浸润减少,可见肝索结构,肝细胞损伤
明显减轻。
A、B分别为 HE 200 ×、HE 400 ×下观察的结果,下同
图 1 空白组肝脏结构
图 2 模型组肝脏结构
图 3 赶黄草高剂量组肝脏结构
图 4 赶黄草低剂量组肝脏结构
图 5 阳性对照组肝脏结构
根据以上组织病理观察的结果,赶黄草总黄酮
各剂量组均有一定疗效,低、高剂量组疗效比较,高
剂量组肝细胞修复现象较为明显,残存的肝组织内
坏死区域明显减少。
3 结论与讨论
朱晓梅等[7]研究表明,大豆黄酮在动物体内如
果含量高时会抑制睾酮和生长激素的生成和释放,
从而使动物的生长受到抑制。张勇等[8]研究发现,
高浓度红三叶草异黄酮提取物对小鼠生长同样具有
抑制作用。本试验表明,赶黄草总黄酮对小鼠生长
性能有抑制作用且作用大小与剂量有关,对小鼠的
体质量增加效果随药物剂量升高而降低,剂量增大
有抑制作用。
植物中黄酮类有效成分在消除自由基、抑菌等
方面有显著效果[9]。机体在严重应激状态下,外源
性细菌侵入或肠源性细菌及 LPS 移位入血导致炎
性反应细胞活化,形成内毒血症,并时常伴有肝功能
严重受损[10-11]。而血清中转氨酶、SOD活性及 MDA
含量是反映肝细胞损害程度及细胞氧化损伤的重要
检测指标。本试验中小鼠尾注射 LPS 12 h 后,模型
组血清内 AST活性和 ALT活性均显著增高,与栗福
星等[12]报道的一致。本试验证实,小鼠肝脏受损会
541
河南农业科学 第 44 卷
导致转氨酶释放到血液中,使血清中的 AST 和 ALT
活性升高;而赶黄草总黄酮高、低剂量组 ALT、AST
活性均比模型组低,说明赶黄草总黄酮能保护肝细
胞,减少肝细胞损伤后酶的逸出,在一定程度上起到
了保护肝脏的作用。肝、肺脏器指数的变化也说明
了 LPS 可以引起全身多个器官的炎症以及形态变
化;同时自由基与脂质过氧化作用在肝损伤与肝病
发生发展中也起着重要作用。大量动物试验也证
实,自由基清除系统损伤是引起肝细胞损伤的重要
环节,机体血清或血浆中脂质过氧化终产物 MDA
含量升高的同时,自由基清除剂如 SOD严重减少或
缺乏,说明 LPS诱导的肝损伤存在严重的自由基代
谢紊乱[13-14]。本试验结果显示,模型组小鼠肝组织
MDA含量明显升高,而发挥清除自由基作用的 SOD
活性水平明显降低,同时给予赶黄草总黄酮的小鼠
肝组织匀浆 MDA 含量较模型组明显降低,SOD 活
性水平明显升高,说明赶黄草总黄酮对 LPS 诱导的
小鼠肝损伤的防治机制可能与其提高机体抗脂质过
氧化能力有关。
通过对实质器官的病理学观察和器官指数测定
表明,LPS 主要损害肝脏和肺脏,这与郭凡溪等[15]
的报道一致。同时,病理观察结果显示,模型组肝细
胞肿胀、坏死、炎细胞浸润,表明 LPS 诱导小鼠急性
肝损伤模型成功;而赶黄草总黄酮各剂量组较模型
组肝细胞坏死、变形程度有所改善,炎性浸润也减
少,破坏程度减轻,对小鼠的肝脏和肺脏有一定的保
护作用。
本试验结果表明,赶黄草总黄酮能降低 LPS 导
致的小鼠急性肝损伤酶活性,提高抗氧化能力,改善
肝组织病变,发挥护肝作用。
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