全 文 ：超临界 CO2 萃取赶黄草中黄酮类化合物的工艺研究
张诗静， 史书龙， 孙 琴* ， 任 琳， 姜 黎， 罗 颖， 税丕先
(泸州医学院药学院，四川 泸州 646000)
收稿日期:2012-09-12
基金项目:四川省教育厅重点课题基金 (2007ZA041) ;泸州医学院自然科学基金重点项目 ( ［2010］ 108-9)。
作者简介:张诗静 (1988—) ，硕士生，主要从事中药制剂与质量分析研究。E-mail:zhangsj76@ 163. com
* 通信作者:孙 琴 (1976—) ，副教授，博士，硕士生导师，主要从事中药品质评价与中药制剂等学科方向的教学、科研工作。Tel:
(0830)3162291，E-mail:sdy-0502@ 126. com
摘要:目的 优选超临界 CO2 流体萃取赶黄草中黄酮类化合物的最佳工艺条件。方法 采用超临界 CO2 流体萃取技
术，以总黄酮、槲皮素的量为指标，运用 L9(3
4)正交表研究了萃取压力、萃取温度、萃取时间对萃取效果的影响，
并与回流、超声提取法进行比较。结果 最佳超临界萃取工艺为 100 g原料，以 70%乙醇溶液作夹带剂，萃取压力 30
MPa、萃取时间 120 min、萃取温度 40 ℃时，提取率为 9. 12%，总黄酮、槲皮素的量最高，分别为 47. 26 mg /g、5. 79
mg /g，均高于回流、超声提取法。结论 利用超临界 CO2 萃取技术萃取赶黄草中黄酮类化合物，较回流、超声提取
法具有样品纯度高、时间短等特点，是一种值得推广应用的提取赶黄草中黄酮类化合物的新方法。
关键词:赶黄草;总黄酮;槲皮素;超临界 CO2 萃取;正交试验
中图分类号:R284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2013)09-2043-04
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2013. 09. 054
赶黄草，在民间又名水泽兰、水杨柳等，学名扯根菜，
为虎耳草科扯根菜属植物扯根菜 Penthorum chinense Pursh
的干燥地上部分，始载于明代 《救荒本草》，现收载于
《中华人民共和国卫生部部颁标准》中药成方制剂十三册
附录［1］，其性味甘、温，具有利水除湿，祛瘀止痛之功效，
主治黄疸、水肿、跌打损伤等，以其为原料制成的肝苏颗
粒对于急慢性肝病及各种并发症均有确切的疗效。现代研
究发现黄酮类化合物是赶黄草中主要的化学成分，槲皮素
为赶黄草中的含量较高的一种黄酮类化合物，具有抗乙肝
病毒和保肝作用［2-4］。
超临界二氧化碳流体技术是近年发展迅速的中草药提
取新技术，其通过改变二氧化碳的温度和压力使之处于超
临界状态，利用二氧化碳在此状态下对化合物的溶解度差
异来实现提取分离，具有产品纯度高、有效成分破坏少和
无重金属残留等优点。采用超临界 CO2 技术萃取赶黄草中
黄酮类化合物的研究尚未见报道。因此，本实验以总黄酮
和槲皮素的量为评价指标，对赶黄草中黄酮类化合物的超
临界 CO2 萃取工艺进行了优化。
1 仪器与材料
Agilent 1260 型高效液相色谱仪 (包括在线脱气机、自
动进样器、DAD检测器、柱温箱、Agilent ChemStation 色谱
工作站) (美国 Agilent) ;SFE120-50-01 型超临界 CO2 萃取
装置 (南通华兴石油仪器有限公司) ，配有萃取釜、分离
器、净化器、携带剂罐、流量计、CO2 泵、制冷装置、温
度和压力控显系统等;CO2 气瓶 (泸州气体公司，纯度 ＞
99%) ;KQ—300GDV超声清洗器 (北京恒奥生物科技有
限公司) ;QE—200 粉碎机 (武义县屹立工具有限公司) ;
UV1700PC型紫外-可见分光光度计 (上海凤凰光学科仪有
限公司) ;电子天平 BSA124S—CW (北京赛多利斯科学仪
器有限公司)。
槲皮素对照品 (批号 MUST-10092801，质量分数≥
98%)、芦丁对照品 (批号 MUST-11040302，质量分数≥
98%)均购于成都曼思特生物科技有限公司;乙腈、甲醇
为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯;赶黄草药
材购于泸州百草堂中药饮片有限公司，经泸州医学院生药
教研室税丕先教授鉴定均为虎耳草科植物扯根菜 Penthorum
chinense Pursh的干燥全草。
2 方法与结果
2. 1 超临界 CO2 制备赶黄草粗提样品 精密称取干燥至恒
重的赶黄草药材粉末 (过四号筛)100g，投入萃取釜，设
定实验所需萃取温度、分离釜Ⅰ温度为 50 ℃、分离釜Ⅱ温
度为 40 ℃。当制冷机温度降至 3 ℃左右时，加入夹带剂，
并对系统进行加压，CO2 由气瓶进入冷凝器变为液态，由
高压泵计量注入萃取釜中，升温进入超临界状态进行萃取。
当达到所选压力时，关闭 CO2 气瓶，开始循环萃取，并保
持恒温恒压。携带有赶黄草萃取物的 CO2 流体依次进入分
离斧Ⅰ和Ⅱ，由节流阀控制逐级降压并改变温度，赶黄草
萃取物与 CO2 自行分离。当达所选定的时间后，从分离
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Ⅰ、分离Ⅱ出料口出料，减压浓缩萃取液，真空干燥，
即得。
2. 2 槲皮素的测定
2. 2. 1 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素对照品适量，
加甲醇溶解并稀释制成质量浓度为 0. 64 mg /mL 的溶
液，即得。
2. 2. 2 供试品溶液的制备 取萃取工艺所得浸膏粉末 1. 0
g，精密称定，加甲醇使其溶解并定容至 50 mL，0. 45 μm
微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2. 2. 3 色谱条件 Waters Sun—Fire C18色谱柱 (250 mm ×
4. 6 mm，5 μm) ;流动相为乙腈 － 0. 02%磷酸水，线性梯
度洗脱，洗脱程序:0 ～ 6 min，8%乙腈;6 ～ 9 min，8% ～
30%乙腈;9 ～ 30 min，30%乙腈;体积流量 1. 0 mL /min;
柱温 30 ℃;进样量 20 μL;检测波长 272 nm。
2. 2. 4 线性关系的考察 按上述色谱条件，分别精密吸取
槲皮素对照品溶液 2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、10. 0、12. 0 μL依
次进样，测定峰面积，以进样质量 (X)为横坐标，峰面
积 (Y)为纵坐标进行线性回归分析，得回归方程为 Y =
2 812. 5X +13. 873，r = 0. 999 5，结果表明槲皮素在 1. 28 ～
7. 68 μg /μL与峰面积呈良好的线性关系。
2. 2. 5 精密度试验 精密吸取质量浓度为 0. 64 mg /mL 的
槲皮素对照品溶液，按 2. 2. 3 项色谱条件项下色谱条件进
样 10 μL，重复进样 6 次，以槲皮素峰面积进行计算，RSD
为 0. 92%，表明仪器精密度良好。
2. 2. 6 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于制备后 0、
4、8、12、24 h进样，测定槲皮素峰面积，按峰面积计算
得 RSD为 1. 05%，表明供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 2. 7 重复性试验 取同一样品，平行制备 6 份供试品溶
液，按 2. 2. 3 项色谱条件下色谱条件测定槲皮素峰面积，
以峰面积计算得 RSD为 0. 81%，表明该方法重复性良好。
2. 2. 8 加样回收率试验 精密称取已知量槲皮素 (质量分
数为 0. 573%)的赶黄草超临界 CO2 萃取物样品约 0. 5g，
共 6 份，分别精密加入 1 mL槲皮素对照品溶液 (质量浓度
为 2. 86 mg /mL) ，按 2. 2. 2 项下方法制备供试品溶液，并
在上述色谱条件下测定槲皮素的量，计算加样回收率，结
果平均加样回收率为 101. 73%，RSD为 1. 52%。
2. 2. 9 样品测定 按 2. 2. 2 项下方法制备供试品溶液，精
密吸取供试品溶液 20 μL，注入高效液相色谱仪进行测定，
并以外标法计算槲皮素量。槲皮素对照品与供试品溶液的
HPLC图谱，见图 1。
2. 3 总黄酮的测定［5-6］
2. 3. 1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒定质量的芦
丁对照品 5. 0 mg于 25 mL 量瓶中，加入 70%乙醇至刻度，
摇匀，即得 0. 2 mg /mL的芦丁对照品溶液。
2. 3. 2 供试品溶液的制备 取超临界 CO2 萃取工艺所得浸
膏粉末 0. 1 g，精密称定，用 70%乙醇定容至 50 mL，摇
匀，得供试品溶液。
2. 3. 3 芦丁标准曲线的绘制 用移液管准确量取 1. 0、
A. 对照品 B. 供试品 S. 槲皮素
图 1 高效液相色谱图
2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0 mL 的芦丁标准液分别置于 25
mL的量瓶中，用 70%的乙醇溶液补充至约 5 mL，先加 5%
的 NaNO2 溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min，再各加 10%的
Al(NO3)3溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min，加入 1 mol /L 的
NaOH溶液 10 mL，用水稀释至刻度，放置 20 min，在 510
nm处测定吸光度 A，其结果用最小二乘法进行线性回归，
得芦丁质量浓度 C (μg /mL)与吸光度 A 的关系为 A =
0. 013 4C + 0. 018 8 (r = 0. 999 6) ，线性范围为 8 ～ 48
μg /mL。
2. 3. 4 系统方法学考察试验
2. 3. 4. 1 精密度试验 取芦丁对照品溶液 (0. 2 mg /mL) ，
连续测定 6 次，结果 RSD 为 1. 58%，表明仪器精密度
良好。
2. 3. 4. 2 稳定性试验 取同一供试品溶液，每隔 30 min测
1 次，连续测定 6 次，结果 RSD 为 1. 42%，表明稳定性
良好。
2. 3. 4. 3 重复性试验 取同一份样品，按 2. 2. 2 项下方法
平行制备 6 份供试品溶液，依法测定，结果 RSD 为
1. 71%，表明该方法重复性良好。
2. 3. 4. 4 加样回收率试验 取已知总黄酮量 (质量分数为
4. 725%)的赶黄草粗提样品 6 份，每份 0. 05 g，精密称
定，分别精密加入 1 mL 芦丁对照品溶液 (质量浓度为
2. 36 mg /mL) ，按 2. 3. 2 项下方法制备供试品溶液，并在
510 nm处测定吸光度，计算加样回收率，平均加样回收率
为 98. 57%，RSD为 2. 07%。
2. 3. 5 样品测定 精密吸取供试品溶液 5. 0 mL，按 2. 3. 3
项芦丁标准曲线的绘制方法测出吸光度 A，并带入标准曲
线方程计算总黄酮量。
2. 4 正交试验优选超临界 CO2 流体萃取工艺
2. 4. 1 萃取溶剂的选择 在不加夹带剂的条件下，超临界
CO2 流体萃取只能得到少量易挥发性小分子物质，黄酮类
化合物得率极低［7］。由于黄酮类物质一般极性较大，可溶
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于一定质量分数的醇溶液，而不同质量分数的乙醇或甲醇
作夹带剂时对总黄酮的提取率有一定影响，鉴于实验过程
中安全性问题，故选用乙醇作为夹带剂［7］。在预选试验条
件下不同质量分数的乙醇作夹带剂对总黄酮的提取率的影
响见图 2。由图 2 可知，当乙醇的质量分数为 70%时，总
黄酮的提取率最高，约为 1. 59%;降低或升高乙醇质量分
数均会使提取率降低，且当乙醇质量分数很低时 (小于
30%) ，萃取釜内容易板结，堵塞管道，损坏设备。故本实
验选择 70%乙醇作为萃取溶剂。
图 2 不同质量分数的乙醇作夹带剂对赶黄
草黄酮提取率的影响 (n =5)
2. 4. 2 正交试验法［8］ 称取赶黄草粗粉 (过四号筛)100
g，共 9 份，根据预试结果，选择萃取压力、萃取温度、萃
取时间作为考察因素，每个因素 3 个水平，按 L9(3
4)正
交表进行试验，并对结果进行方差分析。萃取效果通过萃
取物中赶黄草总黄酮量、槲皮素量为试验考察指标，按照
槲皮素量为 0. 7，总黄酮量为 0. 3 的权重系数其进行综合加
权评分，从而综合考察并确定超临界 CO2 萃取赶黄草中黄
酮类化合物的最佳工艺条件。各因素水平见表 1，正交试
验结果见表 2。运用 SPSS 13. 0 软件对正交实验结果进行方
差分析，结果见表 3。
表 1 各因素水平
水平
因素
A萃取压力 /MPa B萃取时间 /min C萃取温度 /℃
1 25 90 40
2 30 120 45
3 35 150 50
表 2 正交试验方案及结果
试验编号
因素
A B C D
总黄酮 /
(mg·g － 1)
槲皮素 /
(mg·g － 1) 综合评分
1 1 1 1 1 29. 73 3. 41 61. 9
2 1 2 2 2 32. 51 3. 82 68. 2
3 1 3 3 3 30. 63 4. 37 68. 3
4 2 1 2 3 39. 24 4. 89 83. 7
5 2 2 3 1 47. 25 5. 38 98. 2
6 2 3 1 2 44. 10 5. 73 95. 3
7 3 1 3 2 35. 86 4. 68 77. 6
8 3 2 1 3 38. 29 5. 21 84. 0
9 3 3 2 1 34. 07 4. 75 75. 3
K1 66. 133 74. 400 80. 400 78. 467
K2 92. 400 83. 467 75. 733 80. 367
K3 78. 967 79. 633 81. 367 78. 667
R 26. 267 9. 067 5. 634 1. 900
注:槲皮素量和总黄酮量的权重系数分别为 0. 7 和 0. 3;综合评分 = (槲皮素量 /5. 73)× 70 +(总黄酮量 /47. 25)× 30
表 3 正交试验结果方差分析
方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F值 P
A (萃取压力) 1 035. 087 2 517. 544 158. 270 ＊＊P ＜ 0. 01
B (萃取时间) 124. 287 2 62. 144 19. 004 * P ＜ 0. 05
C (萃取温度) 54. 447 2 27. 224 8. 325 P ＞ 0. 05
D (误差) 6. 540 2
注:F0. 01(2，2) = 99. 000，F0. 05(2，2) = 19. 000
从表 2 和表 3 分析结果可知:超临界 CO2 萃取赶黄草
中黄酮类化合物的最佳工艺条件为 A2B2C3，即萃取压力 30
MPa，萃取时间 120 min，萃取温度 50 ℃;各因素对赶黄草
黄酮类化合物的提取率影响大小程度依次为 A ＞ B ＞ C，即
萃取因素中 A因素 (萃取压力)对赶黄草黄酮类成分提取
工艺的影响极显著 (P ＜ 0. 01) ，B 因素 (萃取时间)对提
取的效果具有显著性差异 (P ＜ 0. 05) ，而 C因素 (萃取温
度)的影响无显著性差异。由于因素 C 即萃取温度对萃取
无显著性差异，故可将萃取温度设为 40 ℃。因此，超临界
CO2 萃取赶黄草黄酮类化合物最佳工艺条件定为萃取压力
30 MPa、萃取时间 120 min、萃取温度 40 ℃、70%乙醇溶
液作夹带剂。
2. 4. 3 最佳萃取工艺的验证试验 为进一步考察优选工艺
的可靠性及稳定性，称取赶黄草药材 (过四号筛)3 份，
每份 100 g，按上述最佳工艺萃取并制备相应的样品。试验
结果表明，在最佳萃取工艺条件下，萃取的总黄酮平均量
为 47. 26 mg /g，槲皮素的平均量为 5. 79 mg /g，RSD分别为
1. 35%、2. 04%。说明实验条件下筛选的最佳萃取工艺稳
定、可行。
2. 5 不同提取方法的比较 文献报道，尚远宏等［9］以甲醇
－ 25%盐酸 (4 ∶ 1)作为提取溶剂，固液比为 1 ∶ 40 的条
件下，置 60 ℃水浴回流 1 h;汪洪武等［10］、余昕等［11］采用
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超声提取法在 70%乙醇、固液体积比为 1 ∶ 20 的条件下超
声 (功率:1 000 W)2 次，每次 40 min，故精密称取同一
批干燥至恒定质量的赶黄草粗粉 100 g，按照上述文献样品
提取方法进行处理，进行总黄酮、槲皮素的测定，并与超
临界 CO2 萃取法的结果进行比较，结果见表 4。
表 4 不同提取方法的结果比较
提取
方法
总黄酮 /
(mg·g － 1)
槲皮素 /
(mg·g － 1)
提取
率 /%
回流法 34. 57 3. 85 18. 34
超声提取法 41. 02 4. 83 16. 85
超临界 CO2 萃取法 47. 26 5. 79 9. 12
3 讨论
萃取压力是影响超临界 CO2 萃取赶黄草中黄酮类化合
物的关键因素之一。超临界流体对有效成分溶解度与超临
界流体密度密切相关，而萃取压力是改变超临界流体对物
质溶解能力的重要参数，通过改变压力可使超临界流体密
度发生变化，从而增大或减少其对物质的溶解能力［12］。试
验结果表明:当萃取压力较小 (≤25 MPa)时，CO2 的单
位体积质量比较小，相应其溶解能力也比较小，所以超临
界流体对赶黄草黄酮的萃取率较低;随着萃取压力的升高，
达到30 MPa时，流体单位体积质量显著增加，其对黄酮的
溶解也相应增加，黄酮萃取得率也随着上升;当萃取压力
达到35 MPa时，有效成分萃取得率随压力的升高变化不明
显，同时萃取压力增加会导致高压设备的安全性隐患增大。
超临界 CO2 萃取赶黄草中黄酮类化合物的提取率为
9. 12%，与回流法和超声提取法相比，虽然其提取率相对
较低，但其所得粗提物 (每克)中总黄酮、槲皮素量、纯
度均高于回流法、超声提取法;且具有有机溶剂不易残留，
后处理过程简洁及处理成本低等优点。充分显示了超临界
CO2 萃取技术用于中药提取的优势。
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2013 年 9 月
第 35 卷 第 9 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
September 2013
Vol． 35 No． 9