全 文 ：基金项目：衡水学院大学生创新课题（编号：２０１００５８）
作者简介：孙金旭（１９７５－），男，衡水学院讲师，博士研究生。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｄｓｕｎｊｉｎｘｕ＠１６３．ｃｏｍ
收稿日期：２０１０－０５－１１
第２６卷第５期
２ ０ １ ０年９月
Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２ ０ １ ０
１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－５７８８．２０１０．０５．０３８
响应面法提取灰树花多糖研究
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ
ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ
孙金旭
ＳＵＮ Ｊｉｎ－ｘｕ
朱会霞
ＺＨＵ Ｈｕｉ－ｘｉａ
高小宽
ＧＡＯ Ｘｉａｏ－ｋｕａｎ
李书珍
ＬＩ Ｓｈｕ－ｚｈｅｎ
陈 尧
ＣＨＥＮ Ｙａｏ
林高强
ＬＩＮ Ｇａｏ－ｑｉａｎｇ
周成铭
ＺＨＯＵ Ｃｈｅｎｇ－ｍｉｎｇ
（衡水学院，河北 衡水 ０５３０００）
（Ｈｅｎｇｓｈｕｉ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｅｎｇｓｈｕｉ，Ｈｅｂｅｉ ０５３０００，Ｃｈｉｎａ）
摘要：利用试验设计软件Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ，通过二次回归设计得
到灰树花多糖提取量与提取温度、提取时间、乙醇浓度关系的
回归模型，该模型能够较好地预测灰树花多糖提取量。在对
影响多糖提取量的关键因素及其相互作用进行探讨后，得到
的优化提取工艺参数为：提取温度１１℃、提取时间１０．３５ｈ、
乙醇浓度９６％，此条件下，多糖的提取量为１．７２ｇ／Ｌ。
关键词：灰树花；响应面；提取；多糖
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ，ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｇｒｉｆｏｌａ
ｆｒａｎｄｏｓｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｅｘｔｒａｃ－
ｔｉｎｇ ｔｉｍｅ，ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘ－
ｐｅｒｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｑｕａｄｒｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｓｉｇｎ．
Ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｆａｉｒｌｙ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｆｏｒｅｃａｓｔ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒａｎｄｏｓｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐａ－
ｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｏｗｓ：ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ １１℃，ｅｘ－
ｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ １０．３５ｈ，ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ９６％．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉ－
ｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒａｎｄｏｓｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｉｎ
ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｙ ｒｅａｃｈｅｄ １．７０ｇ／Ｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ；ＲＥＰＳ
灰树花多糖是灰树花中的重要活性物质之一。药理研
究［１］证明，灰树花多糖有明显的抗肿瘤、抗肝炎、降低血压，
免疫调节之功效。目前已经开发了多种灰树花多糖保健
品［２］。采用生物技术方法利用液体发酵培养灰树花真菌菌
丝体，并利用发酵液提取灰树花多糖是目前最经济，最符合
环保的方法［３］。但发酵培养后，由于发酵液成分复杂，灰树
花多糖的分离提取存在很大困难。目前，对灰树花多糖的提
取主要使用醇沉法，对醇沉条件的优化仅限于使用正交法，
而对灰树花多糖醇沉法进行响应面优化的未见报道，正交法
得到的工艺条件并非真实意义的最佳条件，只是理想条件，
不能给出整个区域上的最优值。响应面分析法（ＲＳＭ）是一
种寻找多因素中最佳条件的统计方法，本试验利用醇沉法对
灰树花发酵液中的灰树花胞外多糖进行分离提取，并对灰树
花多糖的醇提条件进行响应面法优化研究，以期提高灰树花
多糖的提取量。
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
灰树花菌种：本实验室保藏；
离心机：ＤＴ５－３Ｂ，北京时代北利离心机有限公司；
发酵罐（７Ｌ）：ＴＹ４２４６，上海保兴生物设备工程有限公司。
１．２ 试验方法
１．２．１ 灰树花多糖提取工艺
灰树花真菌７Ｌ发酵罐培养（培养温度２８ ℃、转速
２００ｒ／ｍｉｎ、通气量１００Ｌ／ｈ、培养时间１０ｄ）→灰树花发酵培
养液→离心沉淀除菌体（３ ０００ｒ／ｍｉｎ）→灰树花发酵液→醇
沉→灰树花粗多糖
１．２．２ 灰树花多糖醇沉条件单因素试验设计
（１）醇沉温度的影响：经离心处理后的灰树花菌体发酵
上清液，在乙醇浓度９５％，ｐＨ值７．０，时间８ｈ的条件下，分
别设定－４，４，１０，２０，３０，４０℃的醇沉温度，进行醇沉试验，测
定其多糖提取量。
（２）醇沉时间的影响：经离心处理后的灰树花菌体发酵
上清液，在乙醇浓度９５％，醇沉温度１０℃，ｐＨ值７．０的条件
下，分别设定２，４，６，８，１０，１２ｈ的醇沉时间，进行醇沉试验，
测定其多糖提取量。
１３１
（３）乙醇浓度的影响：经离心处理后的灰树花菌体发酵
上清液，在醇沉温度１０℃，醇沉时间１０ｈ，ｐＨ值７．０的条件
下，分别设定７０％，７５％，８０％，８５％，９０％，９５％，１００％的乙
醇浓度，进行醇沉试验，测定其多糖提取量。
１．２．３ 灰树花多糖提取工艺的响应面分析 采用Ｂｏｘ－Ｂｅ－
ｈｎｋｅｎ试验设计方案［６］，根据单因素试验结果进行响应面分
析试验，运用ＳＡＳ软件的ＲＳＲＥＧ（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｇｒｅｓ－
ｓｉｏｎ）程序对试验点的响应值进行分析。
１．２．４ 灰树花多糖的测定 通过发酵罐液体培养获得灰树
花真菌发酵液，发酵液３ ０００ｒ／ｍ离心处理得到发酵上清液，
将得到的发酵上清液用乙醇进行醇沉，采用苯酚－硫酸法测
定总糖及还原糖的含量。多糖含量按式（１）计算：
多糖含量（ｇ／Ｌ）＝总糖含量－还原糖含量 （１）
２ 结果与讨论
２．１ 灰树花真菌多糖提取单因素试验
２．１．１ 醇沉温度对灰树花多糖提取量的影响 由图１可
知，随着醇沉温度的升高，灰树花多糖提取量也逐渐上升。
当醇沉温度达１０℃时，多糖提取量达到最高（１．４５ｇ／Ｌ），醇
沉温度继续升高时，多糖提取量反而有所减少。分析原因可
能为低温不利于灰树花多糖的溶出，温度过高，其他杂质溶
出过多，影响到灰树花多糖溶出的缘故。故１０℃为灰树花
多糖提取的最佳温度。
灰
树
花
真
菌
多
糖
提
取
量
Th
e
ex
tra
ct
in
g
fo
rG
rif
ol
a
fro
nd
os
a
po
ly
sa
cc
ha
rid
es
/（
g·
L-
1 ）
提取温度
Extracting temperature/℃
1.50
1.45
1.40
1.35
1.30
1.25
1.20
1.15
-4 4 10 20 30 40
图１ 醇沉温度对灰树花真菌多糖提取量的影响
Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｍｐａｃｔ ｆｏｒ Ｇｒｉｆｏｌａ
ｆｒｏｎｄｏｓａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ
２．１．２ 醇沉时间对灰树花多糖提取量的影响 由图２可
知，随着醇沉时间的延长，灰树花真菌多糖提取量也依次增
加，到１０ｈ时多糖提取量达到最高（１．５０ｇ／Ｌ），高于１０ｈ提
取，多糖量下降。故１０ｈ醇沉时间为灰树花多糖提取的最
佳时间。
２．１．３ 乙醇浓度对灰树花真菌多糖提取量的影响 由图３
可知，随乙醇浓度的上升，灰树花多糖的提取量也逐渐上升，
当乙 醇 浓 度 达 到 ９５％ 时，灰 树 花 多 糖 的 提 取 量 最 高
（１．６４ｇ／Ｌ），乙醇浓度继续升高，多糖量有所下降，故９５％
的乙醇浓度为灰树花多糖提取的最佳浓度。
灰
树
花
真
菌
多
糖
提
取
量
Th
e
ex
tra
ct
in
g
fo
rG
rif
ol
a
fro
nd
os
a
po
ly
sa
cc
ha
rid
es
/（
g·
L-
1 ）
提取时间
Extracting time/h
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0
2 4 6 8 10 12
0.2
图２ 醇沉时间对灰树花真菌多糖提取量的影响
Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｉｍｐａｃｔ ｆｏｒ Ｇｒｉｆｏｌａ
ｆｒｏｎｄｏｓａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ
灰
树
花
真
菌
多
糖
提
取
量
Th
e
ex
tra
ct
in
g
fo
rG
rif
ol
a
fro
nd
os
a
po
ly
sa
cc
ha
rid
es
/（
g·
L-
1 ）
乙醇浓度
Ethanol concentration/%
1.8
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0
70
0.2
1.6
75 80 85 90 95 100
图３ 乙醇浓度对灰树花真菌多糖提取量的影响
Ｆｉｇｕｒｅ ３ Ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｉｍｐａｃｔ
ｆｏｒ Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ ｃａｍｐｈｏｒａｔａ
ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ
２．２ 响应面法优化灰树花多糖提取条件
根据单因素试验结果，对提取温度、提取时间、乙醇浓度
３因素３水平共１５个试验点（３个中心点）进行响应面分析
试验，响应面试验因素水平设计见表１。
表１ 响应面法灰树花真菌多糖提取因素水平
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒ Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ
水平 Ｘ１提取温度／℃ Ｘ２提取时间／ｈ Ｘ３乙醇浓度／％
－１ ４ ８ ９０
０ １０ １０ ９５
１ ２０ １２ １００
运用ＳＡＳ软件的 ＲＳＲＥＧ程序对１５个响应值进行分
析。１５个试验点可分为两类：一是析因点，自变量取值构成
的三维顶点，共有１２个析因点；二是零点，区域的中心点，零
点试验重复３次，用以估计试验误差，以多糖提取量（Ｙ１）为
响应值，经回归拟合后，确定函数表达式。试验结果见表２。
２．３ 模型的建立与显著性检验
用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ软件对表２中的数据进行多元回归拟
合，选择对响应值显著的各项，可得提取温度、提取时间、乙醇
２３１
开发应用 ２０１０年第５期
浓度与灰树花多糖提取量之间的多项回归方程，回归方程为：
Ｙ１＝１．６８６ ６６７＋０．０６７ ５ Ｘ１＋０．０５２ ５ Ｘ２＋０．０８２ ５ Ｘ３
－０．５５５ ８３３ Ｘ２１－０．０２ Ｘ１Ｘ２＋０．０７ Ｘ１Ｘ３－０．１６０ ８３３ Ｘ２２－
０．０３ Ｘ２Ｘ３－０．２１０ ８３３ Ｘ２３
回归方程显著性检验、方差分析及最佳点值分析，结果
见表３。
表２ 响应面数据方案及试验结果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｄａｔａ ｐｌａｎ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔ ｆｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ
水平 Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３ 多糖提取量Ｙ１／（ｇ·Ｌ－１）
１ －１ －１ ０ ０．８０
２ －１ １ ０ ０．９５
３ １ －１ ０ １．０３
４ １ １ ０ １．０８
５ ０ －１ －１ １．１５
６ ０ －１ １ １．３６
７ ０ １ －１ １．３３
８ ０ １ １ １．４２
９ －１ ０ －１ ０．８５
１０ １ ０ －１ ０．８１
１１ －１ ０ １ ０．８９
１２ １ ０ １ １．１３
１３ ０ ０ ０ １．７１
１４ ０ ０ ０ １．６６
１５ ０ ０ ０ １．６９
表３ 三因素三水平中心组和参数估计
Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ
ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ ｆａｃｔｅｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ
方差来源 自由度 平方和 均方 Ｆ Ｐｒ＞Ｆ
Ｘ１ １ ０．０３６ ４５ ０．０３６ ４５ ３９．４７６ ５３ ０．００１ ５０１
Ｘ２ １ ０．０２２ ０５ ０．０２２ ０５ ２３．８８０ ８７ ０．００４ ５２６
Ｘ３ １ ０．０５４ ４５ ０．０５４ ４５ ５８．９７１ １２ ０．０００ ５９７
Ｘ２１ １ １．１４０ ７４１ １．１４０ ７４１ １ ２３５．４６ ０．０００ １
Ｘ１Ｘ２ １ ０．００１ ６ ０．００１ ６ １．７３２ ８５２ ０．２４５ １５９
Ｘ１Ｘ３ １ ０．０１９ ６ ０．０１９ ６ ２１．２２７ ４４ ０．００５ ８０２
Ｘ２２ １ ０．０９５ ５１ ０．０９５ ５１ １０３．４４０ ７ ０．０００ １５８
Ｘ２Ｘ３ １ ０．００３ ６ ０．００３ ６ ３．８９８ ９１７ ０．１０５ ３０７
Ｘ２３ １ ０．１６４ １２６ ０．１６４ １２６ １７７．７５３ ４ ０．０００ １
模型
９ １．４２５ ４２３ ０．１５８ ３８ １７１．５３１ １ ０．０００ １
线性回归 ３ ０．１１２ ９５ ０．０３７ ６５ ４０．７７６ １７ ０．０００ ６１４
平方项 ３ １．２８７ ６７３ ０．４２９ ２２４ ４６４．８６４ ０．０００ １
交互项 ３ ０．０２４ ８ ０．００８ ２６７ ８．９５３ ０６９ ０．０１８ ７２７
误差 ５ ０．００４ ６１７ ０．０００ ９２３
失拟项 ３ ０．００３ ３５ ０．００１ １１７ １．７６３ １５８ ０．３８１ ８７８
纯误差 ２ ０．００１ ２６７ ０．０００ ６３３
总和 １４ １．４３０ ０４
对表３数据惊醒回归分析，结果显著，模型相关系数的
平方即Ｒ２＝９９．３２％，回归方程拟合程度良好，失拟性较小，
可用该方程代替真实试验点进行分析。由Ｐ值可知，方程的
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ１Ｘ１、Ｘ２Ｘ２和Ｘ３Ｘ３对Ｙ值影响极显著，表明该
方程并非简单的线性关系，方程二次项对响应值影响也很
大，交互项影响不显著，因此交互作用影响较小。失拟项ｐ
＝０．３８１ ８，无显著性影响，表明数据没有异常点，不需要分
析更高次数的项，模型适当。
通过软件分析，当灰树花多糖产量最高时：Ｘ１ ＝
０．０７７ ５８；Ｘ２ ＝０．１７３ ２０８；Ｘ３ ＝０．２３２ ３３６，计算后最佳工
艺为：提取温度１１℃、提取时间１０．３５ｈ、乙醇浓度９６％。此
条件下，多糖理论提取量为１．７０ｇ／Ｌ。为了检验所得结果的
可靠性，采用优化条件进行提取试验，实 际 测 得 值 为
１．７２ｇ／Ｌ，与理论值相比，０．１％以内的相对误差，因此，响应
曲面法所得的优化条件，灰树花真菌多糖提取工艺参数准确
可靠，具有实用价值。
３ 结论
在单因素试验设计的基础上，对灰树花多糖的醇沉条件
进行了三因素三水平的响应面法设计，从而建立了响应值和
各个因素之间的数学模型，依据此数学模型可以预测理论提
取量。根据回归模型确定了灰树花多糖醇沉的最佳工艺参
数：提取温度１１℃、提取时间１０．３５ｈ、乙醇浓度９６％。此条
件下，多糖的理论提取量为１．７０ｇ／Ｌ。采用上述优化提取条
件进行３次提取试验，实际测得的平均值为１．７２ｇ／Ｌ，与理
论预测值相比，其相对误差在０．１％以内。因此，利用响应面
分析方法对灰树花多糖提取工艺进行优化，可获得最优的工
艺参数。
参考文献
１ Ｍａｙｅｌ Ｍ．Ｍａｉｔａｋｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ［Ｊ］．
Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．，２００２（６）：６．
２ 马青，陈石良．灰树花保健饮料加工工艺研的究［Ｊ］．食品与机械，
２００３（３）：２２．
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品与机械，２００９，２５（６）：１３１～１３３．
４ Ａｈｕｊａ Ｓ Ｋ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ Ｇ Ｍ，Ｍｏｒｅｉｒａ Ａ Ｒ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｃｋｅｔｔ－
Ｂｕｒｍａｎ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｅｘ－
ｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆｏｒ ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ ｓｈｉｐｗｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ［Ｊ］．Ｂｉｏ－
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００４（８５）：６６６～６７５．
３３１
第２６卷第５期 孙金旭等：响应面法提取灰树花多糖研究