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收稿日期：## $#%$ &%
作者简介：刘伟民，’% 岁，男，副教授，硕士，主要从事食品、化工、农产品加工及贮藏等方向研究。
##’，()*+ ,，-)+ ’!工艺技术
灰树花深层发酵培养基优化研究
刘伟民，黄达明，陈庶来，陈力宏，蔡 蕾
（江苏大学生物与环境工程学院，镇江 &#&’）
摘 要：灰树花是药食两用真菌，富含多糖、氨基酸和矿物元素，可用液体深层发酵大规模生产。本试验研究分析了文
献报导的营养因子对灰树花发酵的影响，并选择得到各因子及水平。以菌丝干重作为试验指标，通过四因素四水平的
正交试验得到了优化培养基的组成为：马铃薯 .#/ 0葡萄糖 ’#/，麸皮 # 1 ’./，酵母膏 &+ # 1 + ./，磷酸二氢钾取 1
./，硫酸镁取 #+ . 1 /，水 &2，菌丝生物量干重为 &!+ 3/ 0 2。方差分析表明混合碳源的浓度比对试验指标有显著影响。与
文献结论进行了对比，得到不同结论。
关键词：灰树花；发酵；培养基；优化
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灰树花 W !#$%&’$%()%*’ X 是一种珍奇药食两用真
菌。其子实体脆嫩鲜美，干菇具有独特香气。文献 Y& Z对灰
树花浸膏粉的化学成分进行了分析，得到灰树花浸膏粉
中的水分、粗蛋白、粗脂肪、总糖、粗多糖和灰分等的含
量分别为 3+ V,[、’+ !V[、#+ 3[、,%+ #.[、,+ ..[
和 V+ !.[，而粗纤维含量小于 #+ ,[。灰树花浸膏粉含
有丰富的矿质元素磷 + &V（B/ 0 /），钙、镁、锌、铁、锰、铜
等人体必需营养素分别为 ,’#、!3#、.V、%’+ &、3+ ’和
!+ 3!/ 0 /，其 &%种氨基酸总量为每百克含 &+ VVB/，其
中必需氨基酸约占全氨基酸含量的 ,&[，此外还含有
每百克 VV+ %’B/的牛磺酸。文献 Y Z对灰树花富集微量
元素的作用进行了研究，得出添加硒 （.##B/ 0 \/）、锌
（V##B/ 0 \/）元素时灰树花富集硒 （&%,+ .!/ 0 /）和锌
（’!%+ #!/ 0 /），添加稀土元素干菌丝体中矿物元素铁、
锌、钙的含量分别为 V!+ .、’!+ %、,3!+ . B/ 0 &##/，与
对照组相比有大幅度提高。灰树花中的多糖、氨基酸和
矿物质具有潜在的医药价值，文献 Y& 1 V Z均提及灰树花具
有增强肌体免疫力、抑制肿瘤及病毒、降低血压等功
效。灰树花甚至能阻止 M](病毒对 R淋巴细胞的破坏作
用，给爱滋病 WU]^QX的治疗带来希望。
食用菌液体深层培养与固体培养相比，具有原料
来源广泛、周期短、产量高、可进行工厂化生产等优
点。用深层发酵法生产灰树花的菌丝体并开发各种产
品，既可以采用廉价的农副产品作原料进行工业化生
产，又无需砍伐木材，从而保护环境。深层发酵的发酵
液还可用于提取多种代谢产物如氨基酸、多肽、真菌多
糖等。参考文献 Y & 1 V Z给出了不同的培养基配方和不同
的试验结论，本文将在分析这些结论的基础上，针对中
国农科院菌种保藏中心提供的 .#,V菌株，进行液体
深层发酵培养基的优化试验。
Y V Z 张和俊 + 麦饭石矿泉水酿造“红粮酒”的研究 Y _ Z + 酿酒，
&!%!A W X：&V $&3+ Y3 Z 施安辉 + 山渣麦饭石醋的研制技术报告 Y _ Z + 中国酿造， &!!.A W X：&$ 3+
Y% Z 王银叶 + 对麦饭石吸附性能机理的探讨 Y _ Z + 现代化工，
&!!,，&,（%）：, $.+ ! ! 材料及方法 !# ! 菌种 菌种为中国农科院菌种保藏中心提供的$%&’菌
株。
!# % 培养基
种子斜面培养基 参照文献 (% )、($)，选用 *+,麸 皮培养基：*+,培养基!-，麸皮$.，磷酸二氢钾/# .，硫
酸镁!# .；摇瓶发酵培养基组成 土豆，葡萄糖，酵母
膏，麸皮，磷酸二氢钾，硫酸镁，按试验要求的浓度配制。
!# / 培养方法
培养基常规灭菌，发酵试验取 !01发酵培养基
装于 /01三角瓶，接种量为每瓶 %.左右斜面菌种，
!’ 2 3 045、%$6培养约 !周，瓶中就可长满菌丝。 !# & 分析方法 生物量测定 采用干重法测定。发酵液与菌丝体 采用抽滤的方法分离，菌丝 ’6烘至恒重，用电子天 平称重。 % 结果与讨论 %# ! 培养基因子及水平的确定 文献 ( % 7 ’ )针对各自选用的不同灰树花菌种，研 究了营养因子的影响，得到了不尽相同的结论。为了 验证各文献结论的差异和得到灰树花菌种$%&’深层
发酵所要求的培养基，本文将根据这些结论，进行综合
选择，设计培养基营养因子及其用量范围8而不再进行
单因子试验。
对碳源而言，文献 (/)认为灰树花能利用多种碳源，
如葡萄糖、番薯粉、马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉、麦芽
汁、大米粉、果糖和蔗糖等。经生物量测定，葡萄糖是最
佳的单一碳源，马铃薯与葡萄糖组成的复合碳源菌丝干
重最高。文献 (’)则认为灰树花能利用多种碳源，但差异
很大。菌丝生长以葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉最佳，而这 /
种及其等量组合碳源在液态发酵时无论是生物量还是
粗多糖均以玉米淀粉最为有利。文献 (&)认为灰树花对
碳源的利用能力从大到小顺序依次为玉米粉、葡萄糖、
淀粉、乳糖、麦芽糖、蔗糖、乙醇和马铃薯汁。文献 (%)、
($)则认为马铃薯为理想碳源。综合这些结论，由于复合 碳源具有复杂的成分，更适合灰树花的生长，本文采用 马铃薯和葡萄糖组成的复合碳源，综合各种文献给出的 碳源浓度范围，马铃薯为 !$ 7 /. 3 -，葡萄糖为 % 7
$. 3 -。文献中没有涉及马铃薯与葡萄糖的质量比对试 验指标的影响，本文在所述浓度范围内选用四种水平马 铃薯与葡萄糖质量比，分别为 !$、9# /、$和 /进行试 验。对应的马铃薯和葡萄糖的质量浓度比分别为 /: 3 %:、%$: 3 /:、%: 3 &:和 !$: 3$:。
对氮源而言，文献 (/)认为麸皮、花生粉、蚕蛹粉、蛋
白胨和豆饼粉是较佳氮源，并以麸皮最好。文献 (&)认为
灰树花对氮源的利用能力从大到小顺序依次为玉米浆、
酵母粉、牛肉膏、玉米粉、豆饼粉、麸皮、蛋白胨、硫酸铵、
硝酸铵和尿素。灰树花对有机氮源的利用要优于无机氮
源。文献 (%)则认为有机氮源蛋白胨和牛肉膏较好。考虑
来源和经济性，本文选用麸皮作为氮源。根据文献 (%)的
试验，本文麸皮添加量在 % 7 /# $. 3 -内变化。 对无机盐而言，文献 ( % )通过试验确定灰树花所需 的无机盐为磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸镁、硫酸铁、硫酸 锌和硫酸铜。文献 ( & )、($ ) 则采用了磷酸二氢钾和硫
酸镁。本文选用复合无机盐磷酸二氢钾和硫酸镁进行
添加，试验浓度磷酸二氢钾取 % 7 $. 3 -，硫酸镁取 #$ 7 %. 3 -，并按照磷酸二氢钾与硫酸镁质量比分别
为 !、%、&、!取四种水平的配比，对应磷酸二氢钾与硫
酸镁质量浓度比分别为 # %: 3 # %: 、 # /: 3
# !$:，# &: 3 # !:和 #$: 3 # $:。 对生长促进剂而言，文献 ( / )认为板栗壳煮汁、酵 母膏和棉子壳煮汁较好。本文采用酵母膏作为生长促 进剂，参照文献的试验情况，分别取 !、!#$、%、%# $. 3 - 四个水平进行试验。 文献 ( ’ )认为碳氮比的影响小，碳、氮没有交互作 用，而碳氮源浓度影响大。根据着这一试验结论，本文 对交互作用不予考虑。 %# % 正交试验设计及结果 根据前述培养基因子及水平的选择，选定正交试 验的因素和水平，见表 !。 %/，;<1# %&，=<# / !工艺技术 表 ! 试验因素和水平 水平 ! % / & ,混合碳源 !$
9> //
$/ 因 ?氮源麸皮 @ . 3 - A % %$
/
/$素 B无机盐 ! % & ! +生长促进剂 酵母膏 @ . 3 - A !> !>$
%>
%> $注：（!）混合碳源马铃薯与葡萄糖的质量比分别为 !$、9# /、$和 /。对应的马铃薯和葡萄糖的质量浓度比分别为 /: 3 %:、%$: 3
/:、%: 3 &:和 !$: 3$:；（%）磷酸二氢钾与硫酸镁质量比分别
为 !、%、&、!，对应磷酸二氢钾与硫酸镁质量浓度比分别为
# %: 3 # %:、# /: 3 # !$:，# &: 3 # !:和 #$: 3 # $:。 !!#$，%&’( #)，*&( $!工艺技术 表 # 正交试验安排及试验结果 试验号 ! #$
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试验指标
菌丝体干重
4 5 6 7 8
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+9
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#)9 .
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#+( $> ? ##)( + 2> ?$!+(
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A0 ? #.+( !
A1 ? !( $A2 ? .,( , A3 ? ,.( . AB ? !-( + A> ? +)/($
方差
来源
0
1!
2!
3!
误差 C
误差 C!
总和
偏差
平方和
#.+9 !
!9 $.,9 , ,.9 . !-9 + #,)9 # +)/9$
自由
度


$!# !+ 方差 /+9 9 ) #.9 / ##9 /$+9 .
##9
D值
)9 $D D( + 4$E !# 8 ? $( )/ D( ! 4$E !# 8 ? +( /+
显著性
1
表 $指标方差分析表 不考虑交互作用，选用 7!,（)+）正交表安排试验。 试验结果见表 #。 #($ 正交试验分析
#9 $9 ! 极差分析用极差分析法对试验结果进行分 析，由表 #的 =值可知：因素 0、1、2、3对试验指标的 影响顺序从大到小依次为 0、2、3、1，比较各 :值，得 到优水平分别 0#、2)、3)和 1)，最优培养基配方组合为 0#1#2)3)。最优培养基组成为：马铃薯 #+5 6葡萄糖$5，麸皮 #+5，磷酸二氢钾 +5 6硫酸镁 ( +5，酵母膏
#( +5，水 !7。混合碳源的影响最为重要。
#( $( # 方差分析 上述极差分析法不能把试验中由于试验条件的改 变引起的数据波动同试验误差引起的数据波动区分开 来，也就是说，不能区分因素各水平间对应的试验结果 的差异究竟是由于因素水平不同引起的，还是由于试 验误差引起的。因此不能知道试验的精度。同时，各因 素对试验结果影响的重要程度，不能给予精确的数量 估计，也不能提出一个标准，用来判断所考察的因素的 作用是否显著。因此，下面对正交试验的结果进行方差 分析。方差分析所需要的有关计算数据见表 #。指标方 差分析结果见表$。
从表 $中的分析结果知道：对菌丝干重试验指标 !# 而言，因素$显著，因素 %、&、’没有显著影响。$的优 水平为$#。故培养基的优化组成为：马铃薯 #() *葡萄
糖 +)，麸皮 # , +()，酵母膏 !- , #- ()，磷酸二氢钾
取 # , () * .，硫酸镁取 - ( , #) * .，并按照磷酸二氢钾
与硫酸镁质量浓度比分别为 - #/ * - #/、- +/ *
- !(/，- 0/ * - !/和 - (/ * - (/之一任取，水
!.。由于混合碳源是唯一的显著影响因素，故最优试
验包含在 ( , 1号试验中，取其平均值作为最优试验结
果，所得灰树花菌丝干重为 !2- 3) * .。
#- 0 讨论
#4 04 ! 试验结果表明，对灰树花 (#05而言，最佳培
养基组成为：马铃薯 #() *葡萄糖 +)，麸皮 # , +()，
酵母膏 !- , #- ()，磷酸二氢钾与硫酸镁质量浓度比任
取 - #/ * - #/ 、 - +/ * - !(/ ， - 0/ * - !/ 和
- (/ * - (/之一，水 !.。!.培养基可得灰树花菌丝
!2- 3)。文献 6+ 7的最佳培养基为 5/葡萄糖、+/的麸
皮、!(/板栗壳煮汁，生物量干重为 !5- () * .。文献 65 7
在最优配方玉米淀粉 () * .、酵母粉 - () * .时菌体生
物量为 !+- 5) * .。文献 6# 7在最优组合葡萄糖 #) * .、豆
粉 +) * .、磷酸二氢钾 !- () * .和有机物 3) * .时，得到
的最大菌丝生物量为 !(- 31) * .。可见，本文对灰树花
液体深层发酵影响因子及其水平的选择基本合理，并
在此基础上通过优化试验得到了最优培养基组成。
#4 04 # 培养基组成中混合碳源的组成对灰树花生物
量有显著影响。该结论不支持文献 6 + 7 得到的葡萄糖
与葡萄糖加马铃薯对产量影响不大的结论。文献 6 5 7认
为液体培养中复杂碳源的存在对菌丝生长和多糖形成
有利，这与次级代谢及糖类生化原理相符。本文的试验
结果验证了这种解释。与文献 6 5 7最优培养基组成玉米
淀粉 () * .、酵母粉 - () * .不同，本文的试验说明，强
调混合碳源中缓释碳源和直接利用碳源的比例，对生
物量有显著影响。
#4 04 + 试验结果与文献的比较说明，针对不同的灰
树花菌株，深层发酵的培养基不尽相同，但可以参照现
有的文献进行选择，如果在试验或生产中出现某些不
同情况，也属正常。
参考文献：
6 ! 7 徐洁等 - 灰树花浸膏粉的生产及其化学成分分析 6 8 7 - 江
西农业大学学报9 #，##（+）：0#1 : 0+-
6# 7 汪维云 - 灰树花液体深层培养及微量元素富集作用研究
6’ 7 - 江苏理工大学博士论文9 !222-
6+ 7 裘娟萍等 - 灰树花深层发酵培养基的研究 6 8 7 - 微生物学
通报9 #，#3（0）：#3( : #31-
60 7 孙希雯等 - 灰树花深层发酵培养基及一种胞外粗多糖快
速测定方法的建立 6 8 7 - 天津轻工业学院学报 9 !2229
（+）：#( : #1-
6( 7 暴增海等 - 灰树花母种培养基的筛选试验初报 6 8 7 - 中国
食用菌9 !( ;+ < = !2-
65 7 方维明等 - 营养因子对灰树花多糖发酵的影响 6 8 7 - 江苏
农业研究，!222，#（0）：5( : 514
收稿日期：## : 3 : !1
基金项目：安徽省自然科学基金资助项目 ; !0!+# <
作者简介：郑志 ; !23! : <，男，讲师，在职博士研究生，研究方向为微生物工程。
#+，>?@- #0，A?- + !工艺技术
摘 要= B’C$定钙法是目前测定发酵液中乳酸含量的主要方法。本文采用对照乳酸结合高效液相色谱法对该方法的 测定条件进行了研究。结果表明，发酵液中的乳酸必须预先用过量的 &D&E+中和，再用 ADEF调节 GF至 !#- 以上，以 钙黄绿素为指示剂时，测定结果的重复性和回收率较好。FH.&法与 B’C$定钙法测定结果比较，发现 B’C$定钙法测 定的乳酸含量偏大，但可通过适当校正用于生产过程检测。 关键词=乳酸I B’C$滴定I高效液相色谱法
!#$%&’$( B’C$JKJLDJK?M KN D ODKM OPJQ?R S?L JQP RPJPLOKMDJK?M ?S @DTJKT DTKR KM SPLOPMJPR UL?JQ- VM JQKN GDGPL， SDTJ?LN KMS@WPMTKM) RPJPLOKMDJK?M ?S @DTJKT DTKR XPLP NJWRKPR XKJQ T?MJL?@ PYGPLKOPMJ DMR QK)Q GPLS?LODMTP @KZWKR TQL?ODJ?)LDGQ[ ;FH.&< - CQP LPNW@JN KMRKTDJPR JQDJ @DTJKT DTKR KM SPLOPMJPR9 UL?JQ OWNJ UP MPWJLD@K\PR XKJQ PYTPNNK]P &D&E+ UPS?LP JKJLDJK?M，JQPM JQP GF ]D@WP ?S N?@WJK?M XDN DR^WNJPR J? PYTPPR !#- XKJQ ADEF XKJQ !#$定钙法测定发酵液中乳酸含量的探讨
郑 志9姜绍通9潘丽军
;合肥工业大学生物与食品工程学院9合肥 #+2 <