全 文 ：广枣总黄酮对大鼠心室肌细胞 ICa 、I to和细胞[ Ca2+] i的影响
杨玉梅1 , 覃建民1 , 徐继辉1 , 周尔凤2 , 冯国庆2 , 白音夫2 , 宋一亭2 , 李增曦1
(1.内蒙古科技大学医学部心血管研究室 , 内蒙古 包头　014010;2.内蒙古中蒙医研究所 , 内蒙古 呼和浩特　010020)
收稿日期:2003-11-17收稿 , 修回日期:2004-02-02
基金项目:国家自然科学基金资助项目 , No 39760083
作者简介:杨玉梅(1959-),女 ,教授。 研究方向:中(蒙)药药理学 ,
T el:0472-5991217 , E-mail:kedouxiansheng@sina.com
中国图分类号:R-332;R 284.1;R 329.24;R 541.705
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2004)07-0784-05
摘要:目的　观察广枣总黄酮对大鼠心室肌细胞 L-型钙通
道电流(I Ca)和瞬时外向钾通道电流(I to)以及对心肌细胞内
游离钙浓度([ Ca2+] i)的影响 , 探讨其抗心律失常作用机制。
方法　全细胞膜片钳记录大鼠心室肌细胞 I Ca 、I to ,激光共聚
焦显微镜观察细胞[ Ca2+] i 的变化。 结果　在钳制电压
-40 mV , 实验电压-40 ～ +50 mV 时 , 广枣总黄酮100 mg·
L-1对心室肌细胞 I Ca无显著影响;在钳制电压-60 mV , 实
验电压-40 ～ +50 mV 时显著抑制瞬时外向钾通道 I to(P<
0.05);而激光共聚焦显微镜结果显示广枣总黄酮在 50 、
100 、200 mg·L-1却降低缺氧复氧心肌细胞收缩期和静息期
[ Ca2+] i的浓度。结论　广枣总黄酮对心肌细胞 ICa无显著
影响 ,可显著抑制瞬时外向钾通道 I to ,并可明显降低心肌细
胞收缩期和静息期细胞[ Ca2+] i浓度。这可能是其抗心律失
常和保护缺血心肌的主要作用机制。
关键词:　广枣总黄酮;L-型钙通道电流;瞬时外向钾通道电
流;细胞内游离钙浓度
　　广枣系蒙医传统用药 , 《四部医典》对其功效已
有记载[ 1] 。广枣总黄酮(total flavones of Cho-
erospondias Axillaris Fructus , TFC)是由漆树科南酸
枣属植物南酸枣 Choerospondias Ax illaris (Roxb.)
Burrt et Hill 的干燥成熟果实广枣中分离出的活性
成分 。前期实验结果表明 TFC 具有良好的抗心律
失常作用[ 2] 。为进一步探讨 TFC 抗心律失常的作
用机制 ,我们应用全细胞膜片钳和激光共聚焦显微
镜观察 TFC 对大鼠心室肌细胞 I Ca 、I to和细胞
[ Ca2+] i的影响。
1　材料与方法
1.1　动物　SD大鼠 ,由第四军医大学实验动物中
心提供。
1.2　药品和试剂　TFC 由内蒙古中蒙医研究所国
家蒙药制剂中心提供 ,批号 981203。CdCl2 、EGTA 、
Fluo-3/AM 、Na2ATP 、胶原酶-Ⅰ 、氯化胆碱为 Sigma
公司产品;DMEM 培养基为 Gibco 公司产品;HEP-
ES 、CsCl、CsOH 为 Biomol 公司产品;L-g lutamic
acid 、Taurine、小牛血清均为国产 ,购自北京化学试
剂公司 。
1.3　仪器　膜片钳放大器(CEZ-2300 ,日本光电公
司),共聚焦显微镜(MRC-1024 ,BIO-RAD)。
1.4　电生理实验
1.4.1　电生理实验液体配制(mmol·L-1)　无钙 Ty-
rodes液:NaCl 143 ,KCl 5.4 ,MgCl2 0.5 ,NaH2PO4 0.33 ,
HEPES 5 , Glucose 5.5 , 用 NaOH 调节 pH7.35;Tyrodes
液:为上述无钙 Tyrodes液中加入 1.8 mmol·L-1的 Ca-
Cl2;KB 液:L-glutamic acid 70 , KCl 25 , Taurine 20 ,
KH2PO4 10 ,MgCl2 3 ,HEPES 10 ,Glucose 10 ,EGTA 0.5 ,
用 KOH调节 pH7.35;含CsCl细胞外液:NaCl 135 ,CsCl
4.6 , MgCl2 0.5 , CaCl2 1.8 , HEPES 5 , Glucose 10 , 用
NaOH调节 pH7.35;氯化胆碱液:Choline chloride 137 ,
KCl 5.4 ,CaCl2 1.8 ,MgCl2 1 ,HEPES 10 ,Glucose 10 , 用
KOH调节 pH7.4;电极内液(ICa):CsCl 140 ,MgCl2 0.5 ,
Na2ATP 4 ,EGTA 1 ,HEPES 5 ,Glucose 5.5 ,用 CsOH 调
节pH7.2;电极内液(Ito):KCl 150 ,MgCl2 1 ,Na2ATP 5 ,
EGTA 10 ,HEPES 5 ,用 KOH调节 pH7.2。
1.4.2　大鼠心室肌细胞分离　SD大鼠 , ♀♂不限 ,
体重(215±32)g 。3%戊巴比妥钠腹腔麻醉 ,肝素
抗凝 ,开胸 ,迅速摘取心脏 ,置冰冷 Tyrodes液;Lan-
gendorff装置主动脉逆行灌流 ,保持温度 37℃,换用
无钙 Tyrodes 液灌流 5 min后 ,用含 0.1%胶原酶的
无钙 Ty rodes液循环灌流 ,至心脏出现透明或变白
后 ,停止消化 ,用 KB 液洗去消化液 ,并在 KB 液中
剪碎心脏 ,过滤后置室温保存。
1.4.3　心肌细胞钙负载　吸取约 0.5 ml细胞悬液
于灌流池中 ,倒置显微镜下观察 ,待细胞贴壁后用
Ty rodes液恒速灌流 ,流速 2 min·ml-1 。负载钙后 ,
可见心肌细胞出现跳动 ,部分细胞变圆死亡。约 60
min后大部分细胞停止跳动。选取杆状 、横纹清晰
的细胞进行电生理研究 ,本消化法可获得 60%状态
良好的杆状细胞。
·784· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2004 Jul;20(7):784 ～ 8
1.4.4　电流记录　实验由计算机 、pCLAMP 7.0软
件和膜片钳放大器组成的系统控制完成 。全细胞膜
片钳记录心肌细胞 ICa和 I to ,电极电阻 3 ～ 5 MΨ。
全细胞记录形成后 ,用含 CsCl细胞外液灌流细胞 ,
钳制电压 -40 mV ,以失活 INa , 去极化脉冲以 10
mV递增至不同水平(-40 ～ +50 mV), 脉宽 300
ms ,频率 1 Hz ,记录全细胞 ICa 。记录 Ito时 ,用氯化
胆碱液灌流细胞 ,用 CdCl2 阻断 ICa ,钳制电压-60
mV ,去极化脉冲以 10 mV 递增至不同水平(-40 ～
+50 mV),脉宽 300 ms ,频率 0.2 Hz。实验结果采
用 t 检验进行统计分析。
1.5　激光共聚焦显微镜实验
1.5.1　大鼠心室肌细胞培养　新生 1 ～ 3 d SD 大
鼠 ,无菌条件下摘取心脏 ,置于 Hanks液中冲洗 ,去
除心房 ,将心室剪成 1 mm ×1 mm 的碎块;0.1%胶
原酶 37℃消化 8 min ,收集细胞悬液 , 500 r·min-1离
心 5 min ,取上清 ,用含体积分数为 10%小牛血清的
DMEM 培养基重悬细胞;将未消化完的心肌 ,按上
述步骤重复消化 5 ～ 6次;将收集细胞悬液 180目滤
网过滤 ,37℃贴壁 90 min ,以去除非心肌细胞 ,小心吸
取未贴壁的心肌细胞 ,按 1×104 的密度种植于特制的
培养皿中;24 h后换为无血清 DMEM培养基继续培养
24 h。实验前将细胞移入含 95%N2+5%O2 的密闭
干燥箱中培养 6 h ,然后在正常条件下继续培养 1 h ,复
制缺氧复氧细胞模型 ,然后进行实验。
1.5.2　细胞内[ Ca2+] i的测定 　Fluo-3/AM 用 D-
Hanks液稀释至 5 μmol·L-1 , 37℃避光条件下负载
细胞 30 min ,于荧光显微镜下观察负载情况 ,如荧
光强度较低 , 可适当延长 10 ～ 20 min , 然后用
DMEM 液洗去细胞外残余染料 。将 Fluo-3/AM 负
载的心肌细胞 ,按不同的实验要求 ,于共聚焦显微镜
下连续动态扫描 ,与 Ca2+结合的 Fluo-3 可被 488
nm的氩离子激光激发 ,发射波长 526 nm , 细胞内
荧光强度(f luo rescent intensity , FI)变化可指示细胞
内[ Ca2+] i 浓度的相对变化 ,与背景基础强度相减
后得出相对荧光强度 ,代表[ Ca2+] i 浓度变化。实
验结果采用 t 检验进行统计分析 。
2　结果
2.1　TFC对大鼠心室肌细胞 ICa和 I to的影响　于
室温条件下 ,选取杆状 、横纹清晰的心肌细胞进行实
验 ,本实验条件下获得的心肌细胞静息电位为(-72
±11)mV ,膜电容(145±23)pF。在钳制电压-40
mV ,实验电压-40 ～ +50 mV ,记录正常条件下全
细胞 ICa 。在灌流液中加入 TFC 100 mg·L-1 ,5 min
后在同一细胞上观察药物的作用 。未加 TFC 时 I Ca
的电流密度为 8.09±1.79 ,加入 TFC 后 I Ca的电流
密度为 8.61±2.16 ,二者差异无显著性(P>0.05),
结果表明 TFC 对心室肌细胞 ICa无显著影响(n =
8),见 Fig 1。
　　在钳制电压 -60 mV , 实验电压 -40 ～ +50
mV ,未加 TFC 时 It o的电流密度为 28.48±1.45 ,加
入TFC 100 mg·L-1后 I to的电流密度为 22.03±
Fig 1　Effect of TFC on ventricular myocytes ICa in rats
A:before medication;B:TFC 100 mg·L -1;C:curve of peak current-voltage
·785·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2004 Jul;20(7)
Fig 2　Effect of TFC on ventricular myocytes I to in rats
A:before medication;B:TFC 100 mg·L -1;C:curve of peak current-voltage
Fig 3　Fluorescent intensi ty dynamic process of intracellular free Ca2+ in myocardial cell s
A:f luorescent intensi ty of myocardial cells in varying t ime;B:“ cake” picture of int racellular free Ca2+ varying
2.12 ,二者间差异有显著性(P <0.05), 结果表明
TFC可显著抑制瞬时外向钾通道 I to(n =8),见 Fig
2。
2.2　TFC对乳鼠心室肌细胞[ Ca2+] i的影响
2.2.1　胞内游离的 Ca2+浓度随时间变化的荧光图
像　实验中 Fluo-3/AM 负载的心肌细胞荧光图像
清晰 , 强弱变化显著 , 可较好地显示细胞内游离
Ca2+浓度的动态变化过程 。如 Fig 3照片 A所示为
加入 TFC 引起的细胞在不同时刻的荧光强度 ,从左
至右 ,从下至上 ,每秒记录一幅细胞图像 ,可见细胞
荧光强度逐渐减弱 。照片 B 所示“蛋糕”图像的峰
值为 4 s和 8 s时心肌细胞收缩期[ Ca2+] i 。
2.2.2　TFC 对乳鼠心肌细胞[ Ca2+] i 的影响　在
Fig 4中 ,曲线的升降表示荧光强度的变化 ,最下面
的红线表示背景基础强度 , 其余不同颜色的曲线每
一条表示一个心肌细胞在连续扫描时荧光强度的变
化情况 ,曲线上的尖峰为细胞正处于收缩期 ,代表收
缩期细胞[ Ca2+] i浓度 。Fig 4所示为 , 依次加入
TFC 50 、100 、200 mg·L-1后 , TFC可浓度依赖性降
低心肌细胞静息期[ Ca2+] i的浓度 ,并降低处于收
·786· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2004 Jul;20(7)
Fig 4　Fluorescent intensity dynamic process of intracellular free Ca2+ in myocardial cel l by different concentration TFC
Arrow f rom left to right:Arrow 1:TFC 50 mg·L -1;Arrow 2:TFC 100 mg·L-1;Arrow 3:TFC 200 mg·L -1
缩期的心肌细胞[ Ca2+] i 峰值浓度 ,降低心肌细胞
自主收缩频率(Tab 1)。本图共观察 2个细胞 ,可见
细胞对药物的反应完全一致。
Tab 1　Effect of TFC on fluorescent intensity of
intracellular free Ca2+ and contractil ity in myocardial
cel ls under ischemia and hypoxia condi tion( x±s , n=6)
Group
Dose
/mg·L-1
Fluorescent intensity
Resting during Systole during
Heart rate
/ Beat·min-1
Before
medication
5.5±1.3 5.6±0.9 25±4　　
TFC 50 3.2±1.4＊ 4.3±0.2＊ 18±4＊　
100 2.3±0.7＊＊ 3.2±0.4＊＊ 15±7＊　
200 1.7±0.8＊＊ 2.8±0.8＊＊ 12±5＊＊
　　＊P <0.05 , ＊＊P<0.01 vs before medication
3　讨论
已证实 TFC对多种房性和室性心律失常模型
及培养大鼠心肌细胞团自发性搏动节律失常均有明
显保护和对抗作用[ 2 , 3] ,使正常灌流的大白鼠离体
心脏心电图的 P-R间期延长 ,心率减慢 ,心肌收缩
力增强;可明显对抗大鼠离体心脏缺氧性心律失常 ,
显著提高心脏室颤阈值[ 4] 。本实验发现 TFC 可显
著抑制心室肌细胞 I to ,对电压依赖性 ICa无显著影
响。 I to为心肌细胞动作电位 1 期快速复极化的主
要成分 ,决定心肌细胞动作电位时程(APD)的长
短[ 5] 。据此推测 , TFC可能具有类似 Ⅲ类抗心律失
常药物的作用特点 ,对 APD有明显的延长作用 ,这
可能是 TFC 对多种房性和室性心律失常具有良好
治疗作用的电生理基础 。
在缺氧复氧或缺血再灌注时 ,心肌细胞的损伤
或功能异常与心肌细胞内钙离子浓度过高(钙超载)
有非常密切的关系 。钙超载可抑制心肌细胞能量代
谢;并在动作电位早期和晚期复极化由钙振荡而引
起触发活动 ,导致快速性心律失常的发生[ 6] 。TFC
50 、100 、200 mg·L-1可浓度依赖性降低缺氧复氧心
肌细胞静息期[ Ca2+] i的浓度 ,并降低处于收缩期
的心肌细胞[ Ca2+] i 峰值浓度 ,提示 TFC 还可抑制
由钙超载引起的心肌细胞损伤 ,从而改善心肌细胞
收缩功能 ,有益于治疗心律失常 。
参考文献:
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·787·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2004 Jul;20(7)
Effects of total flavones of choerospondias axillaris fructus on
L-type Ca2+ current , transient outward K+ and intracellular
free Ca
2+
of ventricular myocytes in rats
YANG Yu-mei , QIN Jian-min ,XU Ji-hui ,ZHOU Er-feng ,FENG Guo-qing ,BAI Yin-fu ,SONG Yi-ting , LI Zeng-xi
(Medical College , Inner Mongolia University of Science and Technology , Baotou　014010 , China)
Abstract:Aim　To study the ef fects of to tal f lavones
of choerospondias ax iaris fructus (TFC)on L-ty pe
Ca2+ current , t ransient outw ard K+ and int racellular
free Ca of vent ricular myocy tes in rats and its mecha-
nism of antiarrhy thmia.Methods　L-type Ca2+ cur-
rent and transient outw ard K+ were reco rded by
pach-clamp whole cell reco rding technique.Int racel-
lular f ree Ca2+ was measured by calcium f luo rescent
probe Fluo-3/AM and laser confocal microscope.Re-
sults　L-type Ca2+ current had not markedly changed
by TFC 100 mg·L-1 at pach voltage -40 mV and
experiment voltage -40 ～ +50 mV.Ttransient out-
ward K
+
was markedly inhibited by TFC 100 mg·
L-1 at pach voltage -60 mV and experiment voltage
-40 ～ +50 mV.Observations under laser confocal
microscope indicated that Int racellular free Ca2+ of
resting phase and systole phase w as decreased
markedly by TFC 50 , 100 , 200 mg·L-1 in myocar-
dia cells under ischemia and hypoxia condition.Con-
clusions　TFC could markedly prolongate the act ion
potential phase because of the reduction of transient
outward K
+ , but TFC has no ef fecte on L-type Ca2+
current.TFC also could markedly decrease intracellu-
lar f ree Ca2+of resting phase and sy stole phase in my-
ocardia cells.The act ions of antiarrhythmia and anti-
myocardia-ischemia are concerned w ith the above
mechanism of TFC.
Key words:total f lavones of choerospondias axillaris
Fructus;L-type Ca2+ current;transient outw ard
K+;int racellular f ree Ca2+
青藤碱对核转录因子κB及其抑制因子 IκB的影响
金晓琨 , 李卫东 , 滕慧玲 , 林志彬
(北京大学医学部基础医学院药理系 , 北京　100083)
中国图书分类号:R-332;R 284.1;R 341.31;R 392.11;
R 394;R 593.220.53;R 971.1
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2004)07-0788-04
摘要:目的　探讨青藤碱对 BALB/c 近交纯系小鼠腹腔巨
噬细胞核转录因子κB 及其抑制因子 IκB 表达的影响 , 提供
其抗炎治疗类风湿性关节炎作用机制的实验依据。方法　
应用荧光标记和激光共聚焦扫描显微镜技术检测药物对
LPS(Lipopoly saccharides)刺激状态下腹腔巨噬细胞 NF-κB
p65(nuclear transcription factors)核移位的影响;采用 Western
blot方法检测药物对 LPS 刺激作用下的腹腔巨噬细胞 IκB-α
降解的影响。结果　高 、中剂量给药组与模型对照(control)
收稿日期:2003-11-19 , 修回日期:2003-12-28
作者简介:金晓琨(1978-),女 ,硕士生;
李卫东(1958-),女 , 博士 ,副教授 , 硕士生导师 ,通讯作
者 , 研究方向:抗炎免疫药理和肿瘤药理 , Tel:010-
82801473 , Fax:010-82801686 , E-mail:lw dpharma @ hot-
mail.com
组间 NF-κB p65 核移位和 IκB-α降解的差异有显著性(P <
0.01)。结论　青藤碱的抗炎抗风湿的作用可能与其抑制
NFκB p65 核移位和 IκB-α降解有关。
关键词:青藤碱;类风湿性关节炎;腹腔巨噬细胞;核转录因
子κB;IκB
　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis , RA)是一种
慢性全身性自身免疫性疾病 , 病理基础为关节滑膜
炎 。其病因不明 ,临床表现复杂多样 ,严重危害了人
类的身体健康。青藤碱(Sinomenine ,SIN)是从中药
青风藤(Sinomenium acutum Rehd.et Wils.)中提取
的生物碱单体。它具有抗炎 、免疫抑制 、镇痛 、降压 、
抗心律失常等药理作用[ 1 ,2] 。在治疗 RA 方面 ,该
药具有较明确的疗效 ,在临床上得到了广泛的应用。
目前国内外对青藤碱的基础药理学机制研究较少。
·788· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2004 Jul;20(7):788 ～ 91