全 文 ：　实验研究　
沙棘总黄酮和广枣总黄酮对大鼠缺血心肌组织蛋白质表达的比较■
包头医学院心血管研究室(包头 014010)　杨玉梅　刘凤鸣＊　覃建民　徐继辉　应　康　张长在
摘　要:目的:探讨比较沙棘总黄酮(TFH)和广枣总黄酮(TFC)对缺血心肌的保护作用及其相关蛋白表达谱的改变。方法:
应用表面增强激光解吸离子化蛋白质芯片技术检测了经 TFH 和 TFC 处理后的缺血心肌组织和未经处理的的对照组缺血
心肌组织中的蛋白质谱。用 PHSII-C 型蛋白芯片阅读机读取数据并进行比较分析。结果:与对照组的缺血心肌组织相
比 ,经 TFH 处理后的缺血心肌组织 3 种芯片共捕获 6 个存在有差异的蛋白质峰 , 其中有 1 个呈高表达 ,有 5 个呈低表达;经
TFC 处理后的缺血心肌组织 3 种芯片共捕获 7 个存在有差异的蛋白质峰 , 其中有 2 个呈高表达 , 有 5 个呈低表达;TFH 和
TFC 比较 ,各蛋白质表达峰的强度有所差别。结论:TFH 和 TFC 均可从蛋白质水平进行调节从而产生抗心肌缺血作用 , 但
它们所影响的蛋白种类 、数量及作用机制均有所差别。
关键词:沙棘总黄酮;广枣总黄酮;心肌缺血;蛋白质组
中图分类号:R291.2　文献标识码:A　文章编号:1006-6810(2008)06-0052-03
　　沙棘(Hippophae Rhamnoides L)和广枣(Choerospondias
Axillaris Fructus)为两种传统蒙药。沙棘又名醋柳 、酸刺 , 为
胡颓子科植物沙棘属的一种野生浆果植物;广枣 ,又名南酸
枣[ Choerospondias Axillaris(Roxb.)Burrt et Hill] , 系漆树
科南酸枣属植物的干燥成熟果实。沙棘和广枣的主要活性
成份均为黄酮类 , 分别称为沙棘总黄酮(To tal Flavones of
Hippophae Rhamnoides L., TFH)和广枣总黄酮(To tal
F lavones of Choerospondias Axillaris Fructus , TFC)。前期研
究表明 , TFH 和 TFC 具有明显的抗心肌缺血 、抗心律失常
等作用〔1 ～ 4〕。为进一步探讨 TFH 和 TFC 抗心肌缺血损伤
作用的物质基础 ,我们应用表面增强激光解吸离子化蛋白
质芯片技术对 TFH 和 TFC 处理后心肌组织蛋白质表达的
差异进行了比较研究。
1　材　料
1.1　动物:Wistar大鼠 , 由内蒙古大学实验动物中心提供 ,
许可证号 SCXK(蒙)2002-0001(清洁级)。
1.2　药品和试剂:沙棘总黄酮(TFH), 呼和浩特天行健医
药新技术开发公司提供 , 批号 990921 , 以芦丁计 , 总黄酮的
纯度为 75%。广枣总黄酮(TFC), 内蒙古中蒙医研究所提
供 ,批号 030811 , 以芦丁计 , 总黄酮的纯度为 48%。 尿素 、
蛋白酶抑制剂 、T ris(三羟甲基氨甲烷)、HEPES(羟乙基哌
嗪乙磺酸)CHAPS〔3-(3-胆胺丙基)二甲氨基-1-丙磺
酸〕均购自 Sigma公司。 SPA 购自 F luka 公司。 IMAC3 蛋
白芯片 、SAX2 蛋白芯片和 NP20 蛋白芯片由北京师范大学
高等学校蛋白质组学研究院提供。
1.3　仪器:PHSI I-C 型蛋白芯片阅读机(美国 Ciphergen 公
司), 超声波破碎仪(美国思博明科学器材有限公司), BL-
■基金项目:内蒙古自治区自然科学基金资助项目(200208020615)
＊北京亿立生物技术研究所(北京 100044)
410 生物信号处理系统(成都泰盟公司)。
2　方　法
2.1　心肌缺血模型的建立:健康大鼠 30 只 , ♂♀兼用 , 体
重215±30g , 随机分为3 组:(1)结扎冠状动脉+生理盐水 ,
(2)结扎冠状动脉+TFH 600mg/kg(按生药浓度计算),(3)
结扎冠状动脉+TFC 23g/kg(按生药浓度计算), 每组各 10
只。大鼠以 2ml/ 100g 容量灌胃 ,对照组给予等容量生理盐
水 ,连续 14d。第 14d 给药 1h 后腹腔注射 3%戊巴比妥钠
30mg/ kg麻醉 , 仰位固定 ,记录Ⅱ导心电图 , 分离颈总动脉 ,
行气管插管术 ,连接动物呼吸机 , 左侧第四肋间开胸 , 剪开
心包 ,轻压胸壁挤出心脏 , 结扎冠脉左前降支后迅速将心脏
送回胸腔 , 用 BL-410 生物信号处理系统监测缺血前后心
电图变化。待心肌缺血 5h 后快速取出心脏 ,用生理盐水灌
注以清除血液成分 ,保存于液氮中待测。
2.2　细胞总蛋白的提取:从液氮中取出心肌组织 , 称重 , 剪
碎后加入 5 倍体积的细胞裂解液(8 mol/ L Urea、4%
CHAPS 、40 mmol/ L T ris-HCl pH7.4 、1μg/ mL的 Leupuptin
和 Aprotinin、0.1mmol/ L PMSF), 应用超声波破碎仪于冰
上将组织块进一步破碎 , 小心匀浆 , 防止产生过多泡沫 , 放
入离心机中(14000 G)离心 30 min , 取上清用 BCA 蛋白定
量试剂盒的微量测试法测定总蛋白浓度 , 其余上清分装于
Eppendo rf管中 ,置于-80℃以备用。
2.3　IMAC3蛋白芯片实验步骤:在 IMAC3 蛋白芯片 8 个点
(A-H)的表面加10μl 100mmol/ L CuSO4 ,置入温盒内室温下
孵育 15min , 吸去剩余 的 CuSO4 , 加 5μl 结合缓 冲液
(100mmol/ L NaCl , pH7)于芯片各点上 ,孵育 5min , 吸去芯片
各点上的液体 ,用超纯水冲洗芯片后, 将其安装于 Bioproces-
sor上 ,每点分别加 20μl的样品(100μg/点)和 80μl结合缓冲
液, 振荡后室温下孵育 30min , 弃去液体 ,各点用 200μl洗脱
缓冲液(100mmol/ L NaCl , pH7)洗涤 2 次 , 每次 5min , 卸去
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DOI :10.16041/j.cnki.cn15-1175.2008.06.054
Bioprocessor , 取出芯片 ,用超纯水洗涤 2 次 , 待芯片表面自
然干燥后 , 各点加 2 次 0.5μl SPA , 芯片表面干后 , 用蛋白
芯片阅读型机(PHSII-C 型)进行蛋白质谱分析。
2.4　SAX2 蛋白芯片实验步骤:芯片每点用 50μl结合缓冲
液(20mmol/ L NaCl , 50mmol/ L Tris , pH8)预处理后 , 温盒内
室温下孵育 15min ,吸去液体 , 用超纯水冲洗芯片后安装于
Bioprocessor上 , 向芯片 A-H 各点加 200μl SAX2 结合缓冲
液, 室温振荡 5min , 弃去液体 ,重复上述步骤 1次 , 每点分别
加20μl样品(100μg/点)和 80μl的结合缓冲液 ,振荡后室温
下孵育 60min , 弃去液体 , 用 200μl 洗脱缓冲液(20mmol/ L
NaCl , 50mmol/ L Tris , pH8)洗涤芯片 3 次 , 每次 5min , 用
1mmol/ L HEPES 洗涤芯片 1 次 , 卸下 Bioprocesso r , 取出芯
片 ,待芯片表面自然干后 , 向各点加 0.5μl SQA , 待芯片表
面自然干后 ,重复点加 0.5μl SPA , 芯片表面干后 , 用蛋白
芯片阅读型机(PHSII-C 型)进行蛋白质谱分析。
2.5　NP20蛋白芯片实验步骤:调节蛋白浓度至 0.2μg/μl.
每点上样 2μl ,晾干后 , 向各点加 0.5μl SPA , 待芯片表面自然
干后 , 重复点加 0.5μl SPA , 芯片表面干后 ,用蛋白芯片阅读
型机(PHSII-C 型)进行蛋白质谱分析。
2.6　数据采集:采用PBSII-C型蛋白芯片阅读机自动收集数
据,没有意义峰的信噪比为 3。仪器每天用标准多肽和低于
200000Da的蛋白标准分子校正, 系统的质量偏差为 0.1%。检
测芯片时蛋白质芯片阅读机设置如下:激光强度 230 ,检测灵
敏度 8 , 优化分子量范围 3000 ～ 50000Da, 最高分子量
200000Da,每个样品收集 50个点, 采用 Ciphergen Proteinchip 3.
0.2 版本的分析软件自动采集数据 , P<0.05为差异蛋白。
2　结　果
与生理盐水组比较 , TFH600mg/ kg 连续给药 14d 后 ,
冠脉结扎所致心肌缺血组织蛋白质表达出现差异。 3 种芯
片共捕获 6个存在有差异的蛋白质峰 , 其中有 4 个出现在
IMAC3 芯片上 , 分别命名为 XJPR1(5239Da)、 XJPR2
(6736Da)、XJPR3(7425Da)、XJPR4(8680Da), 1 个出现在
SAX2 芯片上 , 命名为 XJPR5(4102a), 1 个出现在 NP20 芯
片上。6 个差异蛋白质峰中 , 有 1 个在 TFH 处理后的缺血
心肌组织呈高表达 ,有 5 个在 TFH 处理后的缺血心肌组织
呈低表达。而在 TFC23 g/kg 组 , 3 种芯片共捕获 7 个存在
有差异的蛋白质峰 , 其中有 4 个出现在 IMAC3 芯片上 , 分
别为 XJPR1(5239Da)、XJPR2(6736Da)、XJPR3(7425Da)、
XJPR4(8680Da), 1 个出现在 SAX2 芯片上 , 为 XJPR5
(4102a), 2 个出现在 NP20 芯片上 , 命名为 XJPR6(10141
Da)、XJPR7(17627 Da)。 7 个差异蛋白质峰中 , 有 2 个在
TFC 处理后的缺血心肌组织呈高表达 , 有 5 个在 TFC 处理
后的 缺血 心肌 组织呈 低表 达。 TFH600mg/ kg 组 和
TFC23g/kg组比较 , 各蛋白质表达峰的强度有所差别 , 在 I-
MAC3芯片上的 XJPR1(5239Da)、XJPR2(6736Da)、XJPR3
(7425Da)、XJPR4(8680Da)蛋白中 , XJPR1(5239Da)在 TFH
组呈低表达但在 TFC 组表达量更低 , XJPR2(6736Da)在
TFH 组呈低表达但在 TFC 组呈高表达 , XJPR3(7425Da)
在 TFH 组呈低表达但在 TFC 组表达量更低 , XJPR4
(8680Da)在 TFH 组呈高表达但在 TFC 组呈低表达;在
SAX2芯片上的 XJPR5(4102a)蛋白在 TFH 组呈低表达但在
TFC 组表达量更低;在 NP20 芯片上的 XJPR6(10141Da)和
XJPR7(17627Da)中, XJPR6(10141Da)在 TFH 组呈低表达但
在 TFC 组呈高表达 , XJPR7(17627Da)在 TFH 组未检测出差
异, 但在 TFC 组呈现低表达。见表1。
表 1　TFH 和 TFC与对照组比较的差异蛋白质
差异蛋白(Da) 蛋白质峰( X±S)
NS TFH TFC
4102 29.1±9.7 28.0±6.7＊ 19.0±4.4＊
5239 14.8±4.6 10.4±4.8＊ 9.3±1.6＊
6736 7.8±1.4 7.0±1.1＊ 10.1±2.2＊
7426 13.9±4.4 12.3±2.6＊ 7.2±1.8＊
8681 8.4±3.2 13.6±3.7＊ 7.7±2.0＊
10141 8.3±2.2 5.2±0.8＊ 9.6±2.2＊
17627 10.3±3.2 6.7±0.9＊
　　与对照组比较:＊P<0.05
3　讨　论
心肌缺血损伤可引起多种基因的损伤和表达改变 , 其
结果是使心肌组织和细胞内的蛋白质在种类和数量上发生
变化 ,包括与心肌细胞凋亡相关的基因 , 如 caspase 基因;与
心肌细胞保护相关的蛋白 , 如 HSP-70 等〔5〕。随着分子生
物学技术的应用 ,依据这些基因和蛋白方面的变化寻找新
的抗心肌缺血损伤药物已成为研究热点〔5 ～ 7〕。
大量的研究结果表明 , TFH 和 TFC 具有明显的抗心
肌缺血作用〔1 ～ 4〕。在此基础上 , 我们应用蛋白质组学的方
法采用了 SELDI蛋白质芯片技术检测了 TFH 和 TFC 干预
后心肌缺血区相关蛋白谱的变化 ,为阐明心肌缺血病变机
理和中(蒙)药治疗的分子机制提供依据。
研究结果发现, 与未处理的缺血心肌组织比较 ,在 TFH
处理后的心肌组织中检测出 6 个差异蛋白 , 在 TFC 处理后
的心肌组织中检测出 7个差异蛋白。实验结果提示 , TFH 和
TFC 均可以作用于心肌细胞 , 影响缺血心肌组织的蛋白质表
达, 从蛋白质水平进行调节从而产生抗心肌缺血作用。
TFH 和 TFC组均被 IMAC3 芯片检测出 4 个差异蛋白
(XJPR1 、XJPR2、XJPR3 、XJPR4)。被 SAX2 芯片检测出 1 个
差异蛋白(XJPR5)。在 NP20 芯片上的 XJPR6(10141 Da)检
测出 TFH 和 TFC;在 XJPR7(17627 Da)只检测出 TFC 组, 而
未检测出 TFH 组。在 TFH 组检测出的 6 个差异蛋白质峰
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中,有 1 个呈高表达 , 5 个呈低表达。在 TFC 组检测出的 7
个差异蛋白质峰中 ,有 2 个呈高表达 , 5 个呈低表达。结果
提示 , TFH 和 TFC 所影响的蛋白种类 、数量是有所差别的。
TFH 和 TFC 在各蛋白质表达峰的强度有所差别 , 即
各差异蛋白表达量在两组是不同的 , 提示两种总黄酮调节
蛋白质变化的机制也是不同的。此外 , 经 TFH 和 TFC 干
预后的缺血心肌组织中共有多个差异蛋白被捕获 , 提示调
节表达的蛋白质不是单一蛋白 , 很可能是调节几种或一组
相关联的蛋白质发生变化 ,可能包括与心肌收缩功能相关
的蛋白 、与心肌细胞能量代谢相关的蛋白 、与细胞信号转导
有关部门的蛋白 、与心肌细胞凋亡和保护相关联的蛋白等。
黄酮类化合物的功能基团是其苯环结构上的羟基 , 其
抗氧化性取决于羟基功能团的数目 、位置及供氢能力 ,羟基
的数目越多其活性就越强〔7〕。 TFH 和 TFC 均可从蛋白质
水平进行调节从而产生抗心肌缺血作用 , 但它们所影响的
蛋白种类 、数量及作用机制均有所差别 , 这可能与两种总黄
酮的组成及结构差异有关。其机制尚有待于进一步研究。
参考文献
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FreeRadicMed , 1997 , 22(5):749-753.
2007 年 8 月 6 日收稿
Comparing the action of the microarray expression analysis identified
several key protein candidates as the potential mediators of total
flavones of Hippophae Rhamnoides L.and Choerospondias
axillaries fructus on myocardial protection
Yang Yu-mei ,Zhang Qi , Liu Feng-ming＊ , Qin Jian-min ,
Xu Ji-hui , Ying Kang ,Zhang Chang-zai
Department of Cardiovascular Research , Baotou Medical college ,Baotou 014010 , China
Abstract:Object:Total Flavones of Hippophae Rhamnoides L.(TFH)and To tal F lavones of Choerospondias
Axillaris Fructus(TFC)had showed a pro tection on myocardial ischemic injuries.However , the molecular basis
of such protection remains unclear.Comparing the action of the microarray analy sis for the pro tein expression
in myocardium provide a st rong tool to explo re the key protein candidates involved in the pathogenesis of is-
chemic injury.Methods:Surface enhanced laser desorption/ionization (SELDI)mass spect rometry w ith pro-
tein chip IMAC3 , SAX2 and NP20 w as used to compare the dif ferentially expressed protein in TFH -t reated ,
TFC-t reated and untreated ischemic myocardium in rats and the results w ere analysized wi th Proteinchip
Sof tw are 3.0.2.Results:Six differentially expressed proteins w ere identified in TFH treated myocardium and
these differential effects correlated wi th the expression of five dow nregulated proteins and one upregulated pro-
teins.Seven differentially expressed proteins were identified in TFC treated myocardium and these differential
effects co rrelated w ith the expression of five dow nregulated proteins and two upregulated proteins.Conclusion:
The myocardial protection of TFH and TFC may be mediated by the differencial expression of these proteins
w hich could be the key protein candidates for dif ferent kinds and amounts.
Key words:total flavones of hippophae rhamnoides L.;total flavones of choerospondias axillaries f ructus;my-
ocardial ischemia;proteome
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