全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2007, 19:313-315
文章编号:1001-6880(2007)02-0313-03
　
　
　收稿日期:2005-11-30　　　接受日期:2006-02-26
＊通讯作者 Tel:86-731-4635304;E-mail:fu7879@yahoo.com.cn
高效液相色谱法测定葡萄叶中甘氨酸甜菜碱 、
脯氨酸及葫芦巴碱
傅冬和 1, 2＊
1湖南省天然产物工程技术研究中心 , 长沙 410128;2湖南农业大学茶学系 ,长沙 410128
摘　要:甘氨酸甜菜碱 、脯氨酸及葫芦巴碱的含量与葡萄的抗逆性能密切相关 ,应用离子交换树脂提取葡萄叶
中的这三种物质 ,采用 Suger-pak1 (waters)色谱柱 ,柱温:85℃;样品测定时间:70 min;进样体积:100μL;流速:
0.6 mL/min;检测波长:195 nm;流动相:50mg/LCa-EDTA的 HPLC同时分析测定这三种物质 , 甘氨酸甜菜碱 、
脯氨酸及葫芦巴碱线性相关系数分别为 0.9999, 0.9994及 0.9994;保留时间分别为 20.28, 25.66及 30.65 min;
检出限分别为 1.35, 2.56及 1.02ng/mL,回收率为 93% ～ 96%。此方法分离效果好 , 稳定 ,精确。
关键词:葡萄叶;甘氨酸甜菜碱;脯氨酸;葫芦巴碱;高效液相色谱法
中图分类号:R57.11 文献标识码:A
IdentificationandQualificationofGlycineBetaine, Prolineand
TrigonelineinGrapeLeavesbyHPLC
FUDong-he1, 2＊
1HunanProvincialNaturalProductsResearchCenter, Changsha410128 , China;
2TeaScienceDepartmentofHunanAgriculturalUniversity, Changsha410128 , China
Abstract:Theconcentrationofglycinebetaine, prolineandtrigonelineingrapeleavesiscloserelativetotheabilityof
grapes anti-stress.Theywereextractedbyion-exchangeresinandtestedbyHPLC.Thispaperdevelopedthemethodof
HPLC, whichincludedcolumntemperature:85 ℃, runtime:70 min, injectvolume:100 μL, flowrate:0.6 mL/min, λ:
195nm, column:suger-pak1 (waters), mobilephase:50mg/LCa-EDTA.Themethodisstable.Therelationshipcoefi-
cientsofglycinebetaine, prolineandtrigonelinewererespectively0.9999, 0.9994 and0.9994, theretentiontimewere
20.28, 25.66 and30.65min, anddetectionlimitswere1.35, 2.56 and1.02 ng/mLbythemethodofHPLC.Recover-
ieswere93% ～ 96%.
Keywords:grapeleaves;glycinebetaine;proline;trigoneline;HPLC
　　植物在逆境胁迫的条件下 ,其组织会产生一些渗
透调节物质 ,包括氨基酸如脯氨酸 、糖醇如甘露糖醇
及季胺类化合物如甘氨酸甜菜碱。这类渗透调节物
质积累在细胞质内保持与液泡的渗透平衡 ,对改善渗
透调节具有重要作用[ 1] , 甘氨酸甜菜碱还被广泛应
用于饲料添加剂 、精细化工及医药工业等方面 [ 2] 。有
很多试验证明植物在低温诱导下有利于甘氨酸甜菜
碱的积累[ 3-5] ,在盐和水分胁迫下 ,植物叶片内甜菜碱
逐步积累[ 6, 7] ,通过施用外源甜菜碱也可提高植物抗
逆性 [ 8] ,测定植物组织中渗透调节物质可以了解植物
的抗逆性能。植物中甘氨酸甜菜碱的多种测定方法 ,
如比色法[ 9] 、HPLC法[ 10, 11]等 ,这些方法主要是测定
甜菜碱一种物质 ,而且主要研究作物是小麦 、棉花 、草
莓等作物。葡萄是我国的主要水果之一 ,在其生长过
程中经常会遇到各种生长逆境。对于葡萄中这类物
质的研究还鲜见报道 ,本研究的目的是完善高效液相
色谱法同时分析测定葡萄叶中甘氨酸甜菜碱 、脯氨酸
及葫芦巴碱这类渗透调节物质 ,对研究葡萄的抗逆性
能 ,指导葡萄的栽培具有重大意义。
1　材料与方法
1.1　材料
葡萄叶采自新西兰林肯大学校园附近葡萄园 ,
waters712 WISP自动进样器 , Waters501泵 , Waters
490E检测器 , WatersSuger-pak1column(300mm×
6.5mm)色谱柱 ,甘氨酸甜菜碱 , 脯氨酸 ,葫芦巴
碱标准品购自 Sigma公司 , Dowex-1、Biorex-70Dowex-
50及离子交换树脂 ,其他化学试剂均为分析纯。
1.2　方法
1.2.1　离子交换树脂的准备
将 Dowex-1树脂装入小玻璃柱 ,用两倍体积的
6 N的 NaOH淋洗 ,用蒸馏水洗至中性;将 Biorex-70
树脂装入小玻璃柱 ,用两倍体积的 2.5 mol/LHCl
淋洗 ,用蒸馏水洗至中性;将 Dowex-50树脂装入小
玻璃柱 ,用两倍体积的 2.5 mol/LHCl淋洗 ,再用蒸
馏水洗至中性。
1.2.2　样品制备
将嫩 0.5平方英寸的葡萄叶在 4 ℃下浸入 10
mL甲醇中至少 2d,再加入 5mL氯仿及 6mL水 ,用
力摇动 ,取上层溶液离心后弃去残渣 ,吹干 。
加入 2mL水于上述干样品中 ,摇均 ,溶液先上
等体积混合的 Dowex-l/Biorex-70层析柱 ,用 8 mL
H2O洗 ,洗脱液再过 Dowex-50层析柱 ,用 6 mLH2O
洗 Dowex-50柱 ,再用 6 mL6 mol/L氨水洗 ,收集氨
水洗脱液 ,吹干。加 1 mL蒸馏水溶解样品待测 。
2　结果与讨论
2.1　检测条件的确定
将甘氨酸甜菜碱 、脯氨酸及葫芦巴碱标准品配
成混合溶液在 190 ～ 400 nm波长下扫描 ,间隔波长
是 1.2 nm,发现波长为 195 nm能较理想地同时测
定三种物质 。
经过反复试验确定液相色谱的条件为:
柱温:85℃;样品测定时间:70min;进样体积:100
μL;流速:0.6 mL/min;检测波长:195 nm;色谱柱:Su-
ger-pak1(waters);流动相:50mg/LCa-EDTA。
2.2　保留时间的确定
将甘氨酸甜菜碱 、脯氨酸及葫芦巴碱的水溶液
分别按上述 HPLC条件测定 , 其保留时间分别为
20.28, 25.66及 30.65 min。再配成混合液进样测
定 ,图谱如图 1。从图 1可以看出三种标样的保留
时间间隔较长 ,分离度较好。
2.3　标准曲线
配制 6个不同浓度梯度的 3种标样的混合溶
液 ,即分别含甘氨酸甜菜碱 、脯氨酸 0.00、 0.40、
0.80、1.2、1.6、2.0 mmol/L,葫芦巴碱 0.00、0.005、
0.01、0.02、0.03、0.04mmol/L, HPLC测定后用浓度
y(单位:mmol/L)对响应值 x算出标准曲线方程 ,甘
氨酸甜菜碱的标准曲线方程为 y=2E-05x,相关系
数为 r=0.9999;脯氨酸的标准曲线方程为 y=7E-
05x,相关系数为 R=0.9994;葫芦巴碱的标准曲线
方程为 y=7E-7x,相关系数为 R=0.9994。
2.4　回收率 、相对标准偏差(n=5)及检出限的测
定
在待处理样品及 10mL甲醇中均分别加入甘氨
酸甜菜碱 、脯氨酸及葫芦巴碱 1.5和 0.5mg两个水
平的标准品按方法 1.2.2处理 ,重复 5次 ,再按 2.1
测定其含量 ,计算其回收率 、加样回收率和相对标准
偏差(RSD)(n=5),样品中所加标样的回收率的计
算是用加标样后的样品中所测得的含量减去样品空
白中所测得的含量除以标样添加量。将样品不断稀
释 ,测出其检出限 ,结果稳定 ,重复性好 ,如表 1。
表 1　标样回收率 、相对标准偏差(n=5)及检出限
Table1　Recovery, RSDsofspikedsamples(n=5)anddetectionlimit
组成
Compound
加入量
Added
(mg)
检出量
Found
(mg)
回收率
Recovery
(%)
相对标准偏差确
RSD(%)
甲 醇
Methanol
样品
Sample
甲醇
Methanol
样 品
Sample
甲 醇
Methanol
样品
Sample
检出限
Detectionlimit
(ng/mL)
甘氨酸甜菜碱
Glycinebetaine
1.50
0.50
1.43
0.48
1.44
0.47
95.3
94.0
96.0
96.0
3.2
3.3
3.4
3.3 1.35
脯氨酸
Proline
1.50
0.50
1.40
0.47
1.41
0.47
93.3
94.0
94.0
94.0
3.8
3.6
3.5
3.3 2.56
葫芦巴碱
Trigoneline
1.50
0.50
1.42
0.48
1.44
0.49
94.7
96.0
94.7
96.0
3.2
3.4
3.3
3.2 1.02
2.5　样品测定
按 2.1的色谱条件重复测定了 6个葡萄叶样
品 ,取平均值 ,这三种物质的含量如表 2,从表 2可
以看出 ,不同样品中此三种物质的含量不同 ,而且差
异较大 ,主要是不同个体的抗逆能力有差异。样品
2的 HPLC图谱如图 2,可以看出 ,样品中的甘氨酸
314 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.19
甜菜碱 、脯氨酸及葫芦巴碱能很好地被分离 ,各峰能
准确地被积分 ,说明测定结果可靠。
表 2　各样品的甘氨酸甜菜碱 、脯氨酸及葫芦巴碱浓度
Table2　Concentrationofglycinebetaine, prolineandtrigonel-
lineindiferentsamples
序号
No.
甘氨酸甜菜碱
Glycinebetaine
(μmol/gFW)
脯氨酸
Proline
(μmol/gFW)
葫芦巴碱
Trigoneline
(μmol/gFW)
1 1.726 0.664 0.040
2 1.125 0.000 0.002
3 0.818 0.031 0.004
4 0.402 0.000 0.003
5 0.815 0.317 0.001
6 0.841 0.361 0.004
图 1　标样甘氨酸甜菜碱 、脯氨酸及葫芦巴碱混合液的
HPLC图谱
Fig.1　HPLCofmixedglycinebetaine, prolineandtrigoneline
图 2　样品 2的 HPLC图谱
Fig.2　TheHPLCofsample2
3　结论
本研究所采用的对渗透调节物质的提取方法较
方便 、快速 、稳定 ,回收率高 。
甘氨酸甜菜碱为季铵型水溶性生物碱 ,也是一
种非毒性的渗透调节物质 ,与植物的抗逆能力密切
相关 ,准确地测定各植物中的这类物质的含量 ,才能
研究植物的抗逆能力 。本研究所采用的测定方法 ,
各峰均能较好地分开 ,并能准确积分 ,测定结果精
确。三种物质的标准曲线线性相关性都很好 ,相关
系数十分高 ,都在 0.999以上 ,说明用本方法检测这
三种物质十分稳定 ,而且检出率低 ,此方法切实可
行 ,三种物质在此波长下的灵敏度有差异 ,葫芦巴碱
灵敏度最高 ,脯氨酸最低 。
参考文献
1　SakamotoA, MurataN.Theroleofglycinebetaineinthe
protectionofplantsfromstress:cluesfromtransgenicplants.
PlantCelandEnvironment, 2002, 25:163-171.
2　SongLL(宋丽丽), KanZR(阚振荣).Thepreparation,
measurmentandapplicationofbetaine.HebeiJForeOrch
Res(河北林果研究), 2002, 17:383-388.
3　WeibingX, RajashekarCB.Glycinebetaineinvolvementin
freezingtoleranceandwaterstressinArabidopsisthaliana.
EnvironmentalandExperimentalBotany, 2001, 46:21-28.
4　LiangJ.Betainecanimprovetolerancetolowtemperaturein
plant.JZhaoqingUniv, 2003, 24:36-40, 55.
5　KishitaniSK, WatanabeS, YasudaK, etal.Accumulationof
glycinebetaineduringcoldacclimationandfreezingtolerance
inleavesofwinterandspringbarleyplants.PlantCelland
Environment, 1994, 17:89-95.
6　AtipaliRR, KoluruVC, MunusamyV.Drought-inducedre-
sponsesofphotosynthesisandantioxidantmetabolism in
higherplants.JournalofPlantPhysiology, 2004, 161:1189-
1202.
7　LarherF, JolivetY, BriensM, etal.Osmoregulationinhigher
planthalophytes:organicnitrogenaccumulationinglycine
betaineandprolineduringthegrowthofastertripoliumand
suaedamacrocarpaundersalineconditions.PlantScience
Leters, 1982, 24:201-210.
8　DuD(杜栋), WangYN(王有年), YuJZ(于继洲), etal.
Theeffectsofexogenousbetaineonphotosynthesisofpeach
leavesunderwaterstress.JBejingAgricColl(北京农学院
学报), 2004, 2:2-4, 34.
9　CuiYH(崔艳红), YuanX(原霞), etal.Determinationthe
contentofbetaininmolassesbyusingchromametry.FeedIn-
dus(饲料工业), 2004, 25(2):50-51.
10 YinK(尹昆), AnLG(安利国), YuanJD(袁金铎), etal.
QuantitativedeterminationofbetaineinT.salsuginea.O.E.
SchulzandspinachbyreversephaseHPLC.JShandongNor-
malUniv, NatSci(山东师范大学学报 ,自科版), 2005, 1:
82-85.
11 BodapatiP.Separationofsugars, polyols, pralineanalogues,
andbetainesinstressedplantextractsbyhighperformance
liquidchromatographyandquantificationbyultravioletde-
tection.AustJPlantPhysiology, 1998, 25:793-800.
315Vol.19 傅冬和:高效液相色谱法测定葡萄叶中甘氨酸甜菜碱 、脯氨酸及葫芦巴碱