全 文 ：104 2013, Vol.34, No.12 食品科学 ※工艺技术
新疆琐琐葡萄叶总黄酮提取工艺及抗氧化活性
古丽巴哈尔·阿巴拜克力
(新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054)
摘 要：采用分光光度法，以芦丁为标准样品，测定琐琐葡萄叶中黄酮类化合物的含量。在考察各影响因素的基础
上设计正交试验，得出各种因素对提取效果的影响主次顺序为提取时间＞乙醇体积分数＞温度＞料液比。黄酮类化
合物的最佳提取工艺为50%乙醇、提取时间100min、料液比1:50、提取温度70℃，在最佳提取条件下测定黄酮提取
液的还原力、抗氧化能力，总黄酮对不同自由基的抑制能力由大到小依次为DPPH自由基＞·OH＞O2－·。
关键词：琐琐葡萄叶；总黄酮；还原力；抗氧化
Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Leaves of Vitis viniferal L. Grown in Xinjiang
GULIBAHAER Ababaikeli
(College of Life Science, Xinjiang Normal University, Ürümqi 830054, China)
Abstract：The extraction of total fl avonoids from leaves of Vitis viniferal L. was optimized by orthogonal array design with
the objective of developing a sample preparation method for the spectrophotometric determination of total fl avonoids with rutin
as a standard reference material. Four extraction parameters were ranked in decreasing order of importance as follows: time,
ethanol concentration, temperature and solid-to-solvent ratio, and their optimal conditions were 100 min, 50%, 70 ℃ and 1:50,
respectively. The total fl avonoids obtained under the optimized conditions possessed free radical scavanging activity against
DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals in decreasing order as well as reducing power.
Key words：Vitis viniferal L.；total fl avonoids；reduction power；antioxidant activity
中图分类号：TS255.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)12-0104-05
doi:10.7506/spkx1002-6630-201312022
收稿日期：2012-10-10
作者简介：古丽巴哈尔·阿巴拜克力(1969—)，女，副教授，硕士，研究方向为植物有效成分分析。E-mail：gvlbahar.a@163.com
琐琐葡萄(Vitis viniferal L.)为葡萄科葡萄属落叶藤本
植物，又名SUOSUO葡萄、索索葡萄、豆粒葡萄，果粒
小如胡椒，为无核红葡萄系，木质藤本。琐琐葡萄干燥
的果实外皮红褐色，小颗粒，果皮有皱纹[1 -2 ]。研究[3 ]表
明，琐琐葡萄的生物活性和生理功能主要与其含有的多
糖、黄酮类等功能性成分有关。目前对琐琐葡萄的研究
主要集中于成分提取方面，而对其黄酮类生物学功能研
究甚少。本研究旨在优化琐琐葡萄叶中黄酮类化合物提
取工艺，在此基础上研究其清除自由基的能力，以期为
琐琐葡萄叶活性成分的开发和利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
琐琐葡萄叶于2010年9月采自新疆吐鲁番二堡乡。
芦丁对照品、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙
醚、无水乙醇、三氯化铁、过氧化氢、硫酸亚铁、水杨
酸、铁氰化钾、三氯乙酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲
烷、盐酸、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、磷酸氢二
钠、VC等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
RE-5旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；PL303-IC
电子天平(精确至0.0001g) 上海梅特勒-托利多仪器有
限公司；HH-S型水浴锅 余姚市亚星仪器仪表有限公
司；WFZ UV-2800H型紫外-可见分光光度计 尤尼柯
(上海)仪器有限责任公司；HZ-D循环水式真空泵、回流
提取装置 巩义市英峪予华仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 黄酮类化合物含量测定[4-5]
1.3.1.1 标准溶液的配制
精确称取0.02g经120℃烘干至恒质量的芦丁标准品，
用体积分数30%乙醇溶解并定容至100mL即为标准液。
1.3.1.2 测定波长的选择
分别取芦丁标准溶液1mL，置于25mL容量瓶中，加
入0.7mL 5% NaNO2，摇匀，放置5min后加入0.7mL 10%
Al(NO3)3，放置6min再加入10mL 1mol/L NaOH溶液，混
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.12 105
匀，用30%乙醇稀释至刻度，同时做空白对照，10min后
测定波长400～600nm区段的吸光度，以确定吸收峰。
1.3.1.3 标准曲线的制作和回归方程的建立
精密量取芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、
2.5、3.0mL于7只25mL容量瓶中，再分别加入0.7mL 5%
NaNO2，摇匀，放置6min后加入0.7mL 10% Al(NO3)3溶
液，摇匀，6min后再加入10mL 1mol/L的NaOH溶液，混
匀，用30%乙醇稀释至刻度，15min后于波长510nm处测
定吸光度，0为空白对照，测得不同质量浓度下的吸光
度。以标准溶液质量浓度(X)为横坐标，吸光度(A)为纵坐
标作标准曲线。
1.3.1.4 样品中黄酮含量测定
采用优化后的提取工艺得到琐琐葡萄叶总黄酮提取
液，按标准曲线的制作方法精密量取样品溶液0.0、1.0mL
于25mL容量瓶中，再分别加入0.7mL 5% NaNO2溶液，
摇匀，放置6min后加入0.7mL 10% Al(NO3)3溶液，摇匀，
6min后再加入10mL 1mol/L的NaOH溶液，混匀，用30%乙
醇稀释至刻度，15min后于波长510nm处测定吸光度，0为
空白对照，测得不同质量浓度下的吸光度，根据回归方程
找出样品中总黄酮的含量。重复测定4次，取其平均值。
1.3.2 单因素试验
1.3.2.1 乙醇体积分数对提取效果的影响
分别用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%
的乙醇，在温度70℃、料液比1:20(g/mL)、每次1h的提取
条件下提取2次，浓缩滤液，于25mL容量瓶定容，测定
其吸光度。
1.3.2.2 提取温度对提取效果的影响
温度分别为30、40、50、60、70、80、90℃时，用
60%的乙醇，在料液比1:20(g/mL)、浸泡1h的提取条件下
分别回流提取2次，浓缩滤液，于25mL容量瓶定容，测
定其吸光度。
1.3.2.3 提取时间对提取效果的影响
用60%的乙醇，在料液比1:20(g/mL)的提取条件下分别
浸泡20、40、60、80、100、120、140min并提取2次，浓缩
滤液，然后于25mL容量瓶定容，测定其吸光度。
1.3.2.4 料液比对提取效果的影响
分别用10、20、30、40、50、60、70倍量的60%乙
醇在温度70℃、料液比1:20(g/mL)、浸泡时间每次1h的
提取条件下提取2次，浓缩滤液，然后于25mL容量瓶定
容，测定其吸光度。
1.3.3 正交试验设计
采用L9(34)正交试验设计，进一步考察乙醇体积分
数、料液比、提取温度、提取时间对提取液中总黄酮含
量影响，以确定较佳的总黄酮提取条件。
1.3.4 还原力的测定[5-8]
分别准确吸取4.0mL不同质量浓度的样品液、VC溶
液，加入0.2mol/L pH6.8磷酸缓冲液4.0mL，1g/100mL
铁氰化钾4.0mL，50℃水浴20min后急速冷却，加入
10g/100mL三氯乙酸4.0mL，于3000r/min离心10min，取
上清液10.0mL，加蒸馏水8.0mL，0.1g/100mL三氯化铁
2.0mL，混合后10min以蒸馏水作参比于700nm波长处测
定吸光度。
1.3.5 抗氧化性能测定
1.3.5.1 总黄酮对·OH清除率的测定
反应体系[9-11]为：9mmol/L Fe2SO4 1.0mL、9mmol/L水
杨酸-乙醇溶液4.0mL、不同质量浓度总黄酮提取液、
VC溶液6.0mL，最后加8.8mmol/L H2O2 4.0mL启动反
应，37℃反应0.5h，以蒸馏水为参比，在510nm波长处
测定不同样品各质量浓度的吸光度，考虑到本身的吸
光度，以9mmol/L Fe2SO4 4.0mL，9mmol/L水杨酸-乙
醇溶液4.0mL，不同质量浓度总黄酮提取液、VC溶液
6.0mL，蒸馏水2.0mL作为样品液的本底吸收。其清除
率按式(1)计算。
gOH⏙䰸⥛/% = h100
A0－(Ax－Ax0)
A0
(1)
式中：A0为空白对照溶液吸光度；Ax为样品液吸光
度；Ax0不加H2O2样品液的本底吸光度。
1.3.5.2 总黄酮对O2－·清除率的测定
采用邻苯三酚自氧化法 [7,12-15]，取4.5mL pH8.2，
50mmol/L Tris-HCl缓冲液，4.2mL蒸馏水，混匀后在
25℃水浴保温20min后急速冷却，立即加入25℃预热过的
3mmol/L邻苯三酚0.3mL(以10mmol/L HCl溶液配制，空
白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCl溶液)，总体积
9.0mL。在加入邻苯三酚前先加入2.0mL不同质量浓度样
品液、VC溶液、蒸馏水相应减为2.2mL。测定反应启动
后10s时的A325nm。按式(2)计算O2－·清除率。
O2
－ g⏙䰸⥛/% = h100
Aぎ－Aḋ
Aぎ
(2)
式中：A空为空白管吸光度；A样为样品液吸光度。
1.3.5.3 总黄酮对DPPH自由基清除率的测定
利用DPPH自由基溶液特征紫红色团的吸收峰，用
分光光度法加抗氧化剂提取液后在517nm波长处吸收
的下降表示其对DPPH自由基的清除能力 [16-19]。2.0mL
(0.04mg/mL)DPPH自由基＋2.0mL 95%乙醇吸光度为
Ac；2.0mL(0.04mg/mL)DPPH自由基＋2.0mL样品液吸
光度为AI；2.0mL(0.04mg/mL)样品＋2.0mL 95%乙醇吸
光度为AJ；室温条件下放置30min后用95%乙醇作参比
调零。实验3次求平均值。DPPH自由基清除率按式(3)
计算。
DPPH㞾⬅෎⏙䰸⥛/% = (1－ )h100
AI－AJ
Ac
(3)
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2 结果与分析
2.1 芦丁标准溶液的最佳波长
0.20
0.00
0.05
0.10
0.15
440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550
A
⊶䭓/nm
图 1 芦丁标准液的吸收峰
Fig.1 UV-visible absorbance spetrum of rutin
结果表明，在440～550nm波长范围内进行可见光谱
扫描，510nm波长处吸光度最大。因此本实验选择510nm
作为测定波长。
2.2 标准曲线回归方程的建立
用最小二乘法经线性回归，得回归方程y =0.2157A＋
0.011，R2 = 0.9998，表明芦丁质量浓度与吸光度有良好
的线性关系。
2.3 单因素试验
2.3.1 乙醇体积分数对琐琐葡萄叶总黄酮提取率的影响
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
30 40 50 60 70 80 90
Э䝛ԧ⿃ߚ᭄/%
A 5
10
nm
图 2 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction effi ciency of
total fl avonoids
如图2所示，采用不同乙醇体积分数进行回流提取时
黄酮提取率有差别，随着乙醇体积分数的增加，提取率
将呈上升趋势，但当乙醇体积分数达到一定，黄酮类化
合物溶解度也变小，从而导致黄酮类化合物的提取率下
降。可能是因为乙醇体积分数的增加导致一些醇溶性杂
质、色素、亲脂性强的成分溶出量加大，这些成分与黄
酮类化合物竞争同乙醇-水分子结合的可能性增加。所以
选择50%～70%作为操作条件。
2.3.2 提取温度对琐琐葡萄叶总黄酮提取率的影响
由图3可知，黄酮提取率随提取温度升高而增大，达
到一定时提取率最高，随后提取温度再升高则呈现下降
趋势。温度的升高，有助于传质过程，使分子扩散运动
加剧，加快溶质的扩散和溶剂的渗透，有利于黄酮物质
的溶出；但随着温度的升高，也可能会导致部分黄酮物
质的分解而使黄酮提取率下降。所以，选择50～70℃，
作为提取操作条件。
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
30 40 50 60 70 80 90
⏽ᑺ/ć
A 5
10
nm
图 3 提取温度对总黄酮提取效果的影响
Fig.3 Effect of temperature on the extraction effi ciency of
total fl avonoids
2.3.3 提取时间对琐琐葡萄叶总黄酮提取率的影响
20 40 60 80 100 120 140
ᯊ䯈/min
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
A 5
10
nm
图 4 提取时间对总黄酮提取效果的影响
Fig.4 Effect of time on the extraction effi ciency of total fl avonoids
如图4所示，提取时间达到一定时提取率最高，随后
随时间延长则呈现下降趋势。黄酮类化合物在80min时提
取率较高，但随着时间延长，提取率略有变小。综合考
虑选择8～120min为选择范围。
2.3.4 料液比对琐琐葡萄叶总黄酮提取率的影响
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
A 5
10
nm
1:10 1:20 1:30 1:40 1:50 1:60 1:70
᭭⎆↨(g/mL)
图 5 料液比对总黄酮提取效果的影响
Fig.5 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction effi ciency of total
fl avonoids
如图5所示，采用不同料液比进行浸提时黄酮提取率
有差别，料液比实际上是溶剂的用量大小，一般当溶剂
的用量越大提取率也越大，但是过多的料液比会造成溶
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.12 107
剂和能源的浪费，综合考虑，选择1:30～1:50料液比作为
操作条件。
2.4 琐琐葡萄叶总黄酮提取的正交试验
综合以上单因素试验考察结果，以乙醇体积分数A、
提取温度B、提取时间C、料液比D为因素对琐琐葡萄叶
总黄酮进行正交试验，如表1所示。
表 1 琐琐葡萄叶总黄酮提取的正交试验设计及结果
Table 1 Orthogonal array design and results
试验号 A乙醇体积分数/% B提取温度/℃ C提取时间/min D料液比(g/mL) 吸光度
1 1(50) 1(50) 1(80) 1(1:30) 0.279
2 1 2(60) 2(100) 2(1:40) 0.312
3 1 3(70) 3(120) 3(1:50) 0.323
4 2(60) 1 2 3 0.298
5 2 2 3 1 0.256
6 2 3 1 2 0.261
7 3(70) 1 3 2 0.273
8 3 2 1 3 0.278
9 3 3 2 1 0.315
k1 0.305 0.283 0.273 0.283
k2 0.272 0.282 0.308 0.282
k3 0.289 0.300 0.284 0.300
R 0.033 0.018 0.035 0.017
通过表1比较极差，4种因素对琐琐葡萄叶总黄酮
提取率的影响顺序为C＞A＞B＞D，即提取时间＞乙醇
体积分数＞提取温度＞料液比，即提取因子中提取时间
对提取率影响最大。方差分析表与直观分析相吻合，直
观分析表还表明，提取琐琐葡萄叶总黄酮的最佳条件为
A1B3C2D3，即乙醇体积分数50%、提取温度70℃、提取时
间100min、料液比1:50。这4个因素对黄酮提取率的影响
都不显著，在最终选取A1B3C2D3提取工艺条件下，进行
了总黄酮含量提取率的验证实验，吸光度达0.352，总黄
酮含量达4.7%。
2.5 琐琐葡萄叶总黄酮的抗氧化能力
2.5.1 还原力
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
200 400 600 800 1000
䋼䞣⌧ᑺ/(μg/mL)
A
⧤⧤㨵㧘৊ᘏ咘䝂ᦤপ⎆
VC
图 6 不同抗氧化剂的还原力
Fig.6 Reduction power of total fl avonoids from leaves of Vitis viniferal L.
in comparison with that of VC
由图6可知，琐琐叶葡萄总部黄酮提取液与VC的吸
光度都随质量浓度的增加而增大，吸光度越高，说明这
种反应混合物的还原性越强。经SPSS分析，其回归方
程样品和VC的分别为Y=0.1484X＋0.2514(R2=0.9825)、
Y=0.0327X＋1.5809(R2=0.987)，琐琐葡萄叶总黄酮提取液
的还原力与质量浓度呈线性相关。
2.5.2 ·OH清除率
⏙
䰸
⥛
/%
200 400 600 800 1000
䋼䞣⌧ᑺ/(μg/mL)
⧤⧤㨵㧘৊ᘏ咘䝂ᦤপ⎆
VC
100
80
60
40
20
0
图 7 不同抗氧化剂清除·OH活性
Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of total fl avonoids from
leaves of Vitis viniferal L. in comparison with that of VC
利用H2O2与Fe2+混合产生·OH，但由于·OH具有
很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水
杨酸，就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物。该产
物510nm波长处有强吸收，若在此反应体系中加入具有
清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，从而
使有色产物生成量减少。由图7可知，两者对清除·OH
均有较好的量效关系。在小于300μg/mL左右质量浓度
下，琐琐葡萄叶的清除能力明显高于VC，质量浓度大于
300μg/mL时清除能力呈逐渐增强趋势，但是上升幅度不
大，经SPSS分析，得琐琐葡萄叶总黄酮提取液、VC两者
的曲线方程分别为Y=3.600X＋38.4(R2=0.987)、Y=13.173X＋
23.439(R2=0.9932)。
2.5.3 O2
－·清除率
0
10
20
30
40
50
60
70
200 400 600 800 1000
䋼䞣⌧ᑺ/(μg/mL)
⏙
䰸
⥛
/%
⧤⧤㨵㧘৊ᘏ咘䝂ᦤপ⎆
VC
图 8 不同抗氧化剂清除O2－·活性
Fig.8 Superoxide anion radical scavenging activity of total fl avonoids
from leaves of Vitis viniferal L. in comparison with that of VC
由图8可知，两者对O2－·的清除作用都随质量浓度
的增大而增强，VC清除能力增强的趋势大于琐琐葡萄
叶黄酮提取液。对琐琐葡萄叶总黄酮提取液与VC的曲
线进行模拟得：Y=4.96X－0.24(R2=0.996)、Y=12.878X－
1.158(R2=0.9888)。可知对O2－·的清除能力强弱为：VC
大于琐琐葡萄叶总黄酮提取液。
108 2013, Vol.34, No.12 食品科学 ※工艺技术
2.5.4 DPPH自由基清除率
䋼䞣⌧ᑺ/(μg/mL)
⏙
䰸
⥛
/%
⧤⧤㨵㧘৊ᘏ咘䝂ᦤপ⎆
VC
0
20
40
60
80
100
200 400 600 800 1000
图 9 不同抗氧化剂清除DPPH自由基活性
Fig.9 DPPH radical scavenging activity of total fl avonoids from leaves
of Vitis viniferal L. in comparison with that of VC
由图9可知，琐琐葡萄叶黄酮提取液在质量浓度
小于200μg/mL时清除率就高达6.8%。并随着质量浓
度的增加而逐步上升，质量浓度在800μg/mL以内时清
除率高于VC，在质量浓度达到800μg/mL时清除率与
VC一致。经SPSS分析，琐琐葡萄叶总黄酮提取液与
VC模拟曲线分别为：Y=2.58X＋94.82(R2=0.9203)、
Y=12.606X＋22.606(R2=0.9268)。可知在质量浓度低于
800μg/mL时琐琐葡萄叶总黄酮提取液对DPPH自由基清除
能力大于VC，质量浓度达到1000μg/mL时VC大于琐琐葡
萄叶总黄酮提取液。
3 结 论
3.1 在单因素基础上以乙醇为溶剂对琐琐葡萄叶总黄酮
进行了黄酮提取工艺优化，采用分光光度法测定总黄酮
含量，正交试验结果表明，琐琐葡萄叶部总黄酮含量为
4.7%。
3.2 在最佳提取工艺基础上探讨了总黄酮类物质的抗
氧化作用，结果表明琐琐葡萄叶总黄酮对不同的自由
基有一定的清除作用，琐琐葡萄叶提取液总黄酮质量浓
度为1000μg/mL时对·OH的清除作用最大，清除率达
57%；含量为1000μg/mL时对O2－·的抑制作用最强，达
到25%；总黄酮质量浓度为1000μg/mL时对DPPH自由基
的清除作用最大，清除率达91.5%。
3.3 琐琐葡萄叶总黄酮对3种自由基的清除能力大小
为：DPPH自由基＞·OH＞O2－·。
3.4 琐琐葡萄叶部总黄酮具有很强的还原能力和自由基
清除活性，通过本实验的研究得知琐琐葡萄叶部具有应
用于医学的价值，这将为利用该资源进行工业化生产黄
酮类药物提供参考依据，为进一步深入研究琐琐葡萄的
应用提供理论依据。
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