全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用
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2015年 第40卷 第06期
收稿日期：2015-02-22 *通讯作者
基金项目：山西省高等学校科技创新项目(2013168)；山西省自然科学基金项目(2012011002-3)。
作者简介：褚盼盼(1982—)，女，硕士，讲师，研究方向为天然产物的研究与开发。
褚盼盼，吕艺瑶，朱晓换，康 丽，李建明，乔元彪*
(吕梁学院，吕梁 033000)
摘要：通过微生物液体发酵技术得到富含纤维素酶的发酵粗酶液，对黑豆衣进行酶解处理，以
红色素提取率为指标，确定微生物发酵粗酶液酶解提取最佳工艺条件。从自然界筛选出一株高
产纤维素酶菌株w8，确定其最佳产酶发酵条件为：初始pH值为8、1%玉米芯粉、0.5%硫酸铵、
0.05%吐温80、温度为30 ℃、接种量为3%、培养5 d，优化后，其FPA酶活提高至510.19 U/mL，
CMC酶活提高至3879.16 U/mL。微生物发酵粗酶液酶解提取黑豆衣红色素最佳条件为：料液比为
1:20、酶解温度为50 ℃、酶解时间120 min、酶用量为50 U/mL、初始pH值为6，浸提4次，合并
滤液经真空冷冻干燥获得黑豆衣红色素，提取率达到96.84%。
关键词：黑豆衣；红色素；纤维素酶；微生物发酵粗酶液；提取
中图分类号：TS 201.3 文献标志码：B 文章编号：1005-9989(2015)06-0262-07
New technology of enzymic extraction red pigment from black soybean
skin with microbial fermentation crude enzyme liquid
CHU Pan-pan, LYU Yi-yao, ZHU Xiao-huan, KANG Li, LI Jian-ming, QIAO Yuan-biao*
(Lyuliang University, Lyuliang 033000)
Abstract: Rich in cellulose enzyme is obtained by liquid fermentation technology of crude enzyme liquid
fermentation, enzymatic hydrolysis was carried out on the black soybean skin processing, red pigment
extraction rate as the index, to determine the microorganism fermentation crude enzyme liquid enzymic
extraction optimum technological conditions. Screening of high-yield cellulase strains w8 from nature.
Determine the optimal fermentation conditions for producing enzyme: initial pH of 8, 1% corn powder,
0.5% ammonium sulfate, 0.05% tween 80, temperature of 30 ℃, 3% inoculated quantity and cultivate 5 d,
after optimization, the FPA enzyme activity increased to 510.19 U/mL, CMC enzyme activity increased to
3879.16 U/mL. Microorganism fermentation crude enzyme liquid enzymic extraction conditions of the black
soybean skin red pigment as extracting agent for material liquid ratio of 1:20, enzymolysis temperature of
50 ℃, enzyme dosage 50 U/mL, enzymolysis time of 120 min, initial pH value of 6, leaching four times,
merge the filtrate obtained with vacuum freeze drying black soybean skin red pigment, extraction rate
reached 96.84%.
Key words: black soybean skin; red pigment; cellulase; microbial fermentation crude enzyme liquid; extract
微生物发酵粗酶液酶解提取
黑豆衣红色素新工艺
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.06.060
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黑豆衣呈黑色，富含红色素，其着色自然，
还具有保护肝脏、抗氧化、延缓衰老、抗肥胖、
降血脂[1]等生理功能，是一种非常重要的天然色素
和理想的食品添加剂。主要成分为飞燕草素-3-葡
萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-半
乳糖苷[2]。近年来，大多数科研工作者对于黑豆衣
红色素的提取主要采用传统的色素提取方法如传
统溶剂提取法[2-8]、微波辅助提取法[9]、超声波辅
助提取法[10-11]等，色素提取率大多在18%(按黑豆
衣干重计)。传统的色素提取方法在提取的过程中
不仅存在着提取时间长、热敏性组分易被破坏，
而且生产的色素产品纯度差、提取率低、存在异
味和溶剂残留等缺点[12]，直接影响了黑豆衣红色
素的综合开发与应用。
酶法辅助提取生物活性成分目前已得到广
泛的应用。黑豆衣是黑豆种子最外层的物质，主
要成分是植物纤维及细胞壁，约占全粒质量的
7%~12%，其中粗纤维的含量很高，约占40%，其
红色素往往被包裹在主要由纤维素组成的细胞壁
中不易溶出。纤维素酶是一类复合酶，它可以破
坏β-1,4-糖苷键，将纤维素骨架结构逐级降解，
植物细胞壁被破坏后导致细胞内色素的溶出，根
据上述原理，在提取黑豆衣红色素前先用纤维素
酶进行酶解，使其细胞壁破坏后再进行提取，可
提高色素成分的提取率[12]。目前，国内外已有应
用纤维素酶法提取黑豆衣红色素的研究报道[13]。
但是由于提取工艺中直接购买纤维素酶会产生一
定的成本，且作用效果有限，不宜实现工业化、
产业化推广。
事实上，纤维素酶广泛存在于自然界生物
体内，主要为丝状真菌。其产酶效率高且为胞外
酶，易于分离提取。另外，同时也会产生一些其
他酶类如淀粉酶、半纤维素酶、果胶酶等。基于
酶法提取天然植物色素的优点，本研究试图在自
然环境中筛选出高产纤维素酶的微生物，利用液
体发酵技术得到纤维素酶活力较高菌株的微生物
发酵粗酶液，对黑豆衣酶解提取红色素，旨在进
一步提高黑豆衣红色素的提取率、降低企业生产
成本和实现产业化开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 黑豆衣(青仁黑豆皮)：市售。
1.1.2 供试菌种 高产纤维素酶菌株w8：由本课题
组以牛粪、猪粪、羊粪等畜禽粪便及土壤为样本
筛选所得。
1.1.3 主要仪器与试剂 高速万能粉碎机：北京化
玻联医疗器械有限公司；冷冻干燥机：北京松源
华兴科技发展有限公司；UV-2100双光束紫外可
见分光光度计：上海捷辰仪器有限公司；THZ-C
汽浴恒温摇床培养箱：太仓市实验设备厂；
Neofuge 13R台式高速冷冻离心机：上海力申科学
仪器有限公司；Olympus BX41M型正置金相显微
镜：广州市明美光电技术有限公司；所有药品均
为国产分析纯。
1.1.4 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g/L，蔗
糖20 g/L，琼脂20 g/L，自然pH，121 ℃，灭菌20
min[14]。纤维素刚果红培养基：(NH4)2SO4 2.0 g，
MgSO4 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.5 g，CMC-Na
2.0 g，刚果红0.4 g，琼脂22 g，蒸馏水定容至1000
mL，pH7.0，121 ℃灭菌20 min[15]。液体发酵培养
基：KH2PO4 1.0 g/L，NaCl 0.1 g/L，NaNO3 2.5 g/
L，MgSO4 0.3 g/L，FeCl3 0.01 g/L，CaCl2 0.1 g/L，
麸皮10 g/L，pH7.2，121 ℃，灭菌20 min[7]。
1.2 方法
1.2.1 高产纤维素酶菌株的筛选
1.2.1.1 菌株的富集、分离与纯化 称取采集的土
样或牛粪、猪粪、羊粪等畜禽粪便5 g，加入45 mL
无菌水，振荡10 min。稀释至100倍后取0.2 mL样
液涂布于PDA培养基30 ℃培养，3~5 d后将不同形
态的单个菌落分离纯化，PDA斜面培养基上低温
保存。
1.2.1.2 初筛与复筛 利用纤维素刚果红培养基进
行初筛，筛选时以透明圈的直径和菌落直径的比
值大小为标准。
通过测定CMC酶活力[16]和FPA酶活力(滤纸全
酶活)[17-18]对初筛得到的菌株进行复筛，具体方法
参照文献。酶活力的计算公式如下[19]：
酶活力单位：在适宜条件下，每小时由底物
生产1 μg葡萄糖所需底酶量为一个酶活力单位
(U)[19]。
1.2.2 高产纤维素酶菌株的鉴定 将分离纯化后目
的菌株点种于PDA培养基中心，30 ℃下培养5 d后
结合观察其菌落特征及镜检结果，初步确定菌株
的种属地位。并将该菌株交由上海生工进行18S
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rDNA测序。
1.2.3 高产纤维素酶菌株最佳产酶条件的优化 对
复筛得到的高产纤维素酶菌株产酶条件初始pH
值、碳源、氮源、表面活性剂、反应温度、接种
量、培养时间进行优化。通过对培养条件的单因
素分析，对较显著的4个单因素分别选取3个最优
水平。依据L9(34)表安排正交试验见表1，测其CMC
酶活力和FPA酶活力，确定该高产纤维素酶的最
佳产酶条件。
表1 微生物产酶条件因素水平表
水平
因素
初始pH
值 A 碳源 B
接种量/%
C
培养时间/
d D
1 6 1%麸皮 3 3
2 7 1%玉米芯粉 4 4
3 8 0.5%CMC+0.5%麸皮 5 5
1.2.4 微生物发酵粗酶液的制备 将高产纤维素酶
菌株接种于PDA斜面培养基上，30 ℃培养3 d，向
各试管中滴加5 mL无菌水，振荡均匀后制备菌悬
液(4.0×106 cfu/mL)。吸取1 mL接种于已优化的液
体发酵培养基中震荡培养，4 ℃、5000 r/min离心
10 min，所得上清液即为粗酶液。以FPA酶活力
(滤纸全酶活)来计算酶用量。
1.2.5 微生物发酵粗酶液酶解提取黑豆衣红色素
条件的优化 分别对料液比、酶解温度、酶解时
间、酶用量、初始pH值等影响黑豆衣红色素提
取效果的单因素进行研究。在单因素实验的基
础上，对较显著的4个单因素分别选取3个最优水
平。依据L9(34)表安排正交试验见表2，测其在280
nm处的吸光值，得出微生物发酵粗酶液酶解提取
黑豆衣红色素最佳条件。
表2 红色素提取条件因素水平表
水
平
因素
酶解温度/℃
A
酶解时间/
min B
酶用量/(U/mL)
C
初始pH值
D
1 40 90 30 5
2 50 120 50 5.6
3 60 150 60 6
1.2.6 黑豆衣色素提取率与吸收光谱 根据单因
素和正交实验综合得出的微生物发酵粗酶液酶解
处理黑豆衣最佳工艺参数对黑豆衣进行酶解，浸
提4次至无色，收集每次的色素提取液，测定其
体积(V)和吸光度值(A)，合并各次提取液得到总
体积(V总)和总吸光度值(A总)[13]。
黑豆衣色素提取率按最大吸收波长处吸光值
计算：提取率=A×V/(A总×V总)[13]
将获得的黑豆衣红色素在紫外可见分光光度
计200~700 nm进行光谱扫描，经检测，黑豆衣红
色素在280 nm处有吸收峰值。
1.2.7 数据分析与处理 本研究所获得菌株交由上
海生工进行测序鉴定。所有正交试验设计均通过
正交试验助手II V3.1完成。
2 结果与分析
2.1 高产纤维素酶菌株的筛选与鉴定
2.1.1 初筛与复筛 利用纤维素刚果红培养基对分
离纯化的38个菌株进行初筛。结合透明圈大小、
透明圈清晰程度、透明圈与菌落直径的比值及菌
落生长状态，筛选出8个菌株。
对初筛获得的8个菌株进行发酵培养，获得一
株酶活力较高菌株，编号为w8，其FPA酶活力为
105.58 U/mL，CMC酶活力为620.15 U/mL。
2.1.2 菌株的鉴定 30 ℃下，将w8菌株接种至
PDA培养基上进行培养，菌落生长较快，质地疏
松，初呈白色，后转至淡绿褐色。菌落大而不规
则，中心颜色与边缘颜色不同，菌落正反颜色不
同。在正置金相显微镜下观察，菌株w8菌丝呈分
枝状、有隔，分生孢子梗单生、顶端形成膨大的
顶囊，分生孢子头呈球形、放射状。结合菌落、
镜检特征初步判定该菌株为曲霉属。
图1 18S rDNA基因序列
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经上海生工测序后得到18S rDNA基因片段
为1740 bp，其基因序列如图1。将测序得到的
18S rDNA序列在NCBI网页上进行BLAST比对，该
菌的18S rDNA序列与数据库中Aspergillus oryzae
strain SEMCC-3.248 18S ribosomal RNA gene, partial
sequence(NCBI登录号为HM064501.1)比较接近，相
似性为99.9%。结合形态观察和分子鉴定结果，确
定该菌株为米曲霉Aspergillus oryzae。
2.2 高产纤维素酶菌株产酶条件的优化
2.2.1 不同pH值对酶活力的影响 由图2可知，综
合FPA和CMC酶活力两项指标，w8酶活力的最适
pH值为6，此时FPA酶活力达到263.19 U/mL，CMC
酶活力达到200.54 U/mL，说明w8产酶适合偏酸性
环境。
合CMC和FPA2种酶活力，当以0.5%硫酸铵为主要
氮源时，w8酶活最高，FPA和CMC酶活力分别为
385.50、750.82 U/mL；当氮源为0.5%酵母浸粉时
次之，0.5%尿素效果最差。
图2 不同pH值对w8酶活力的影响
图3 不同碳源对w8酶活力的影响
图4 不同氮源对w8酶活的影响
图5 表面活性剂(吐温80)对w8酶活力的影响
图6 反应温度对w8酶活力的影响
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2.2.2 不同碳源对产酶的影响 纤维素酶属于一种
诱导酶，当改变液体发酵培养基中的碳源时，实
验结果表明，碳源为0.5% CMC+0.5%麸皮时，菌
株w8的酶活力最高，FPA酶和CMC酶活力分别为
391.41、335.19 U/mL，碳源为1%玉米芯粉的效果
次之，而添加1%蔗糖的效果最差。
2.2.3 不同氮源对产酶的影响 选择一些无机氮
源和有机氮源，替换液体发酵培养基中的氮源硝
酸钠，加入量为其总量的0.5%。由图4可知，结
2.2.4 表面活性剂对产酶的影响 表面活性剂是一
端亲水和一端疏水的两性小分子，它能作用于细
胞膜，改变膜结构的通透性，有利于提高胞外酶
的产量[9]。但当表面活性剂添加太多，酶的产量
会略微有所下降。由图5可知，发酵培养基中添加
0.05%吐温80会提高菌株w8的2种酶活力。
2.2.5 反应温度对产酶的影响 由图6可知，30 ℃
时，FPA和CMC酶活力最高，分别为461.80 U/mL
和1750.38 U/mL，随着培养温度的提高，酶活力逐
渐呈下降趋势。
2.2.6 接种量对产酶的影响 由图7可知，随着接
种量的增加酶活力有所上升，增加至3%时，FPA
和CMC酶活力达到最高，分别为471.80、1950.39
U/mL，继续增加接种量，酶活力呈下降趋势。因
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此，该菌株的接种量是3%。 w8培养至第5天时，FPA和CMC酶活力达到最高，
分别为478.80、2650.38 U/mL。
单因素试验结果表明，高产纤维素酶菌株
产酶最佳条件为：初始pH值为6、碳源为0.5%
CMC+0.5%麸皮、氮源为0.5%硫酸铵、0.05%吐温
80，接种量为3%、培养时间为5 d。
2.2.8 高产纤维素酶菌株产酶条件正交试验 对表
3中极差R值进行比较，可以得出，以FPA酶活力
为指标高产纤维素酶菌株产酶条件影响因素的主
次顺序为：C(接种量)＞B(碳源)＞D(培养时间)＞
A(初始pH值)；以CMC酶活力为指标高产纤维素酶
菌株产酶条件影响因素的主次顺序为：B(碳源)＞
C(接种量)＞D(培养时间)＞A(初始pH值)。高产纤
维素酶菌株产酶条件最佳提取组合为A3B2C1D3，
即初始pH值为8、碳源为1%玉米芯粉、接种量为
3%、培养时间为5 d，FPA和CMC酶活力分别达到
510.19、3879.16 U/mL。为了避免错失最优组合，
经过多次验证试验，正交试验最佳组合优于单因
素最佳组合。
2.3 微生物发酵粗酶液酶解提取黑豆衣红色素条
件优化
2.3.1 料液比对黑豆衣红色素提取效果的影响
在酶用量为50 U/mL、酶解温度为50 ℃、pH
值为4.6、酶解时间120 min、料液比分别为1:20、
1:30、1:40、1:50，分别测定色素提取液在280 nm
处吸光值，见图9。结果表明，随着提取剂用量的
增加，吸光值逐渐降低，当黑豆衣与提取剂用量
即料液比为1:20时黑豆衣红色素提取率最高。
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图7 反应温度对w8酶活力的影响
2.2.7 培养时间对产酶的影响 由图8可知，菌株
图8 培养时间对w8酶活力的影响
表3 L9(34)正交试验结果
试验号
因素 FPA酶
活力/
(U/mL)
CMC酶
活力/
(U/mL)A B C D
1 1 1 1 1 414.37 720.06
2 1 2 2 2 385.41 3382.20
3 1 3 3 3 347.52 1336.43
4 2 1 2 3 178.05 293.89
5 2 2 3 1 442.97 3490.17
6 2 3 1 2 489.81 2263.85
7 3 1 3 2 263.50 1175.55
8 3 2 1 3 510.19 3879.16
9 3 3 2 1 300.68 1239.18
FPA酶
活力/
(U/mL)
K1 1147.30 855.92 1414.37 1158.03
K2 1110.83 1338.58 864.14 1138.72
K3 1074.37 1138.01 1053.99 1035.75
k1 382.43 285.32 471.46 386.01
k2 370.29 446.19 288.06 379.57
k3 358.12 379.34 351.33 345.26
R 24.31 160.87 183.40 40.74
CMC酶
活力/
(U/mL)
K1 5438.68 2189.49 6863.07 5449.41
K2 6047.91 10751.52 4915.27 6821.59
K3 6293.89 4839.47 6002.15 5509.47
k1 1812.90 729.83 2287.69 1816.47
k2 2015.97 3583.84 1638.42 2273.87
k3 2097.96 1613.15 2000.72 1836.49
R 285.07 2854.01 649.27 457.40
图9 料液比对黑豆衣红色素提取效果的影响
图10 酶解温度对黑豆衣红色素提取效果的影响
2.3.2 酶解温度对黑豆衣红色素提取效果的影响
根据2.3.1实验结果，选择料液比为1:20，其他条
件不变，酶解温度分别在20、30、40、50、60 ℃
测定黑豆衣红色素提取液在280 nm处的吸光值。
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由图10可知，提取温度在20~60 ℃范围内，吸光
值呈先逐渐上升的趋势，随后趋于下降或平缓。
提取温度为50 ℃时吸光值最高，说明黑豆衣红色
素在50 ℃时提取效果最好。
2.3.3 酶解时间对黑豆衣红色素提取效果的影响
2.3.4实验结果，选择料液比为1:20、酶解温度为50
℃、酶解时间120 min，酶用量为60 U/mL，其他条
件不变，pH分别为3.6、4、4.6、5、5.6、6时测定
黑豆衣红色素提取液在280 nm处的吸光值。由图
13可知，pH值在3.6~6范围内，吸光值总体呈上升
趋势。结果表明，pH为6时吸光值最高，为黑豆衣
红色素提取最适pH值。
图11 酶解时间对黑豆衣红色素提取效果的影响
图12 酶用量对黑豆衣红色素提取效果的影响
图13 初始pH值对黑豆衣红色素提取效果的影响
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ѹݼQ)Ϙ根据2.3.2实验结果，选择料液比为1:20、酶
解温度为50 ℃、酶解时间为120 min，其他条件不
变，酶解时间分别为60、90、120、150、180 min
测定黑豆衣红色素提取液在280 nm处的吸光值。
由图11可知，酶解时间在60~180 min范围内，吸
光值呈先逐渐上升的趋势，随后趋于下降。这可
能是由于酶解时间过长，一部分色素降解所致。
结果表明，酶解时间为120 min时吸光值最高，说
明黑豆衣红色素酶解120 min时提取效果最好。
2.3.4 酶用量对黑豆衣红色素提取效果的影响 根
据2.3.3实验结果，选择料液比为1:20、酶解温度
为50 ℃，酶解时间120 min，其他条件不变，酶用
量分别为20、30、50、60、80、90 U/mL时测定黑
豆衣红色素提取液在280 nm处的吸光值。由图12
可知，酶用量在20~90 U/mL范围内，吸光值呈逐
渐上升后趋于下降的趋势。这是因为在一定实验
条件下，酶用量低于最佳值时酶解不完全，随着
酶用量的加大直至达到最佳值时酶降解进行得较
为彻底，此时如果继续加大酶用量，提取率反而
有所下降。可能的原因是底物浓度不能对酶达到
饱和，导致酶的作用受到抑制，导致色素提取率
呈下降趋势[20]。结果表明，酶用量为60 U/mL时吸
光值最高，说明黑豆衣红色素提取最适酶用量为
60 U/mL。
单因素试验结果表明，黑豆衣红色素最佳提
取条件为：料液比为1:20、酶解温度为50 ℃、酶
解时间120 min、酶用量为60 U/mL、初始pH值为
6。考虑到初始pH值对酶活力的较大影响，在进
行3.2.4单因素试验在初始pH值为4.6时，酶用量在
50、60 U/mL提取效果非常接近，为了避免错失最
优提取组合并做到经济节约，经过验证试验，发
现酶用量为50 U/mL提取结果优于60 U/mL。
2.3.6 微生物发酵粗酶液酶解黑豆衣正交试验 对
表4中极差R值进行比较，可以得出，黑豆衣红
色素提取影响因素的主次顺序为：A(酶解温度)＞
B(酶解时间)＞D(初始pH值)＞C(酶用量)。黑豆衣
表4 L9(34)正交试验结果
实验号
因素 OD280 nm
A B C D
1 1 1 1 1 0.4544
2 1 2 2 2 0.4401
3 1 3 3 3 0.5055
4 2 1 2 3 0.5781
5 2 2 3 1 0.5184
6 2 3 1 2 0.5792
7 3 1 3 2 0.5122
8 3 2 1 3 0.5559
9 3 3 2 1 0.5771
K1 1.3999 1.5446 1.5895 1.5499
K2 1.6757 1.5143 1.5953 1.5315
K3 1.6452 1.6619 1.5361 1.6394
k1 0.4666 0.5149 0.5298 0.5166
k2 0.5586 0.5048 0.5318 0.5105
k3 0.5484 0.5540 0.5120 0.5465
R 0.0919 0.0492 0.0197 0.03602.3.5 pH值对黑豆衣红色素提取效果的影响 根据
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用
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2015年 第40卷 第06期
红色素最佳提取组合为A2B3C2D3，即酶解温度为
50 ℃、酶解时间为150 min、初始pH值为6、酶用
量为50 U/mL。与此结果比较接近的是6号试验，
为了确认正交试验最佳提取组合进行黑豆衣红色
素提取是否为最优，进行试验并与6号试验和单因
素试验的结果进行比较，取效果最佳的方案。
经多次验证，微生物发酵粗酶液酶解提取
黑豆衣红色素最佳条件为：料液比为1:20、酶解
温度为50 ℃、酶解时间120 min、酶用量为50 U/
mL、初始pH值为6。
3 结论
本研究以牛粪、猪粪、羊粪等畜禽粪便及土
壤为样本，筛选出一株酶活力较高的菌株w8。结
合菌落形态和18S rDNA测序结果，确定该菌株为
米曲霉Aspergillus oryzae。为了进一步优化培养基
成分及培养条件以提高该菌株产纤维素酶的酶活
力，本实验对初始发酵培养基进行优化，分别对
不同初始pH值、碳源、氮源、表面活性剂、反应
温度、接种量、培养时间等进行单因素和正交试
验。研究表明，最佳产酶发酵条件为：初始pH值
为8，1%玉米芯粉、0.5%硫酸铵、0.05%吐温80，
温度为30 ℃，接种量为3%、培养5 d。经优化实
验后，其FPA酶活力提高至510.19 U/mL，CMC酶
活力提高至3879.16 U/mL。
对微生物发酵粗酶液酶解提取黑豆衣红色素
选取料液比、酶解温度、酶解时间、酶用量、初
始pH值等因素进行单因素试验，结合单因素和正
交试验结果，经过多次验证，微生物发酵粗酶液
酶解提取黑豆衣红色素最佳工艺条件为：料液比
为1:20、酶解温度为50 ℃、酶解时间120 min、酶
用量为50 U/mL、初始pH值为6，浸提4次，合并
滤液经真空冷冻干燥获得黑豆衣红色素。实验结
果显示，采用微生物酶法提取黑豆衣红色素经济
节约、提取条件温和、简单高效且无溶剂残留问
题，可用于工业化生产。
2010年，孙晓侠等研究了黑豆衣色素酶法
提取工艺，对纤维素酶法(市售纤维素酶1.5万U/
g)提取工艺条件进行优选，确定最佳提取工艺条
件为：酶用量80 U/mL、酶解温度50 ℃、酶解时
间120 min、pH值为4.5，该工艺条件下进行3次浸
提，色素提取率达到96.8%[13]。本试验采用微生物
酶法提取黑豆衣红色素与其提取条件及提取率基
本相同，但酶用量比孙晓侠等减少37.5%，这可能
由于微生物发酵粗酶液中不仅存在丰富的纤维素
酶还存在其他有利于破坏黑豆衣细胞壁促进色素
溶出的酶类如果胶酶，该推论有待于后续试验的
进一步验证。
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