全 文 ：植　物　学　报　 1995, 37( 1): 41— 47
Acta Bot anica Sinica
盐胁迫对高粱根质膜离子通道
通透性的影响
裴真明　汤章城
(中国科学院上海植物生理研究所 ,上海 200032)
摘　　要
用 100 mmol /L、 200 mmol /L、 300 mmol /L NaCl依次处理萌发后 3 d的高粱 ( Sorghum
vulgare Pers. )幼苗 ,分离纯化根质膜。 将质膜嵌入预先涂制好的平面脂双层 ,然后用电学方
法测定该脂双层的离子选择通透性。膜的两测分别加入 NaCl和 KCl,在电压钳位下测定不同
膜电位时的膜电流 ,通过 GHK电压等式计算膜的离子选择通透性。 结果表明质膜的离子选
择通透性在盐胁迫下发生显著变化 ,对照的 K+ 、 Na+ 通透比 ( PK∶ PNa )= 3. 5,处理后 PK∶ PNa
= 1. 5。 讨论了这一变化的含义。
关键词　平面脂双层 ;离子通道 ;盐胁迫 ;质膜 ;高粱⒇
EFFECT OF SALT STRESS ON ION CHANNEL SELECTIVE
PERMEABILITYOF PLASMALEMMA IN SORGHUM ROOTS
Pei Zhen-ming and Tang Zhang-cheng
( Shanghai Institute of Plant Ph ysiology , Academ ia Sinica , Sh anghai 200032)
Abstract
100 mmol /L , 200 mmol /L and 300 mmol /L NaCl was used in proper o rder to t reat
three-day old seedlings of Sorghum vulgare Pers. The plasma membrane of roots w as iso-
lated and purified by aqueous biphasic partition device. The plasmalemma was incorporated
into planar bilayer lipid membrane and ion channels were measured by electrical methods. Ion
selective permeabili ties ( PK: PN a ) w ere assayed in asymmetrical solutions containing 100
mmol /L NaCl in Cis chamber and 100 mmol /L KCl in Tran wi th chamber and w ere calcu-
⒇收稿日期: 1993-10-25　接受日期: 1994-01-19
　* 国家自然科学基金资助项目。
lated f rom Goldman-Hodgkin-Kaltz equation. PK: PNa was 3. 5 in plasmalemma of control
roo ts and 1. 5 in plasmalemma of salt st ressed roo ts. It show ed that the changes of ion selec-
tiv e permeabili ty was very significant under salt st ress. The importance of the change of ion
selective permeability is disscuted.
Key Words　 Bilayer lipid membrane; Ion channel; Salt stress; Plasmalemma;
So rghum
对植物盐胁迫下渗透调节的研究主要集中在细胞中存在的有机渗透调节物 ,如脯氨
酸 [1, 2 ]、甜菜碱、海藻糖和甘油 [1 ]及柠檬酸 [3 ]的作用。然而无机渗透调节物质 ,如某些盐离
子进出细胞也是盐胁迫和渗透调节的一个重要环节 [4, 5 ]。盐胁迫对植物的影响除了外界的
低渗透势给植物造成水分胁迫外 ,进入细胞的离子也影响细胞内的离子组成和离子环境。
虽然已经证明盐胁迫下植物电解质的渗漏增加 [6, 7 ] ,但是电解质渗漏的增加只能从总体上
说明细胞膜透性发生变化 ,对膜透性变化的原因不能给予说明 ,因此有必要研究细胞透性
改变的原因 ,进一步探讨盐胁迫改变膜透性的机制。采用电生理的方法 (电压钳位 )测定离
子跨膜转运是目前最有效的方法之一 [4, 5, 8, 9 ] ,这种方法包括膜片钳技术和人工脂双层技
术 [9 ]。本实验采用平面脂双层技术研究盐胁迫对高粱根质膜离子选择通透性的影响 ,以期
探讨盐胁迫对植物造成的伤害以及抗盐机制。
1　材料 和 方法
1. 1　材料
高粱 ( Sorghum vulgare Pers. )“晋杂四号”种子 (山西省农业科学院提供 )经 1%新洁
尔灭消毒 5 min,冲洗后 25℃浸种 12 h,选饱满种子播于金属网上。发芽后用 Hoagland营养
液于人工气候室 (温度 25℃ ,相对湿度 70% ,光强 360μmol m- 2 s- 1 ,光照 15 h /d)培养。幼
苗生长 7 d,取根为实验材料。
1. 2　NaCl胁迫处理
正常培养 3 d的高粱幼苗 ,第四天在 100 mmol /L NaCl营养液中培养 ,第五天在 200
mmol /L NaCl营养液中培养 ,第六、七天在 300 mmol /L NaCl营养液中培养 ,然后取根为
实验材料。逐渐增加 NaCl的浓度是使植株能适应渗透胁迫 ,避免对质膜的伤害作用。
1. 3　质膜的分离和纯化
质膜提取和纯化参照文献 [10, 11]方法 ,略加修饰。称取一定量的高粱根 ,置研钵中 ,
加入少量液氮使组织变脆易于快速研磨。按 2 mL /g根加入匀浆液 [15 mmol /L Tris-MES
pH 7. 8, 1 mmol /L EDTA, 1 mmol /L DTT, 0. 25 mol /L蔗糖 , 0. 6% PV P ( W /V ) , 1
mmol /L PM SF]和少许石英砂研磨。用 4层纱布过滤 ,重复提取 1次。滤液 10000× g离心 15
min除去沉淀。上清液 80000× g离心 30 min,沉淀中质膜较多。加悬浮液 1 ( 5 mmol /L pH
7. 8磷酸缓冲液 , 0. 1 mmol /L DTT) ,其中没有加渗透保护剂的目的是降低溶液渗透势 ,
使包在膜微囊中的膜释放出来 ,有利于纯化 [11 ]。用玻璃匀浆器匀浆 ,此为粗提质膜。粗提
质膜不宜太浓 ,浓度大容易使质膜产生沉淀 ,对纯化、测定蛋白酶活力及嵌入脂双层都有
42 植　　物　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　 37卷
影响 ,一般浓度在 1— 5 mg /mL范围较为合适。粗提质膜在液氮中存放较长时间不会影响
酶活力。
通过水两相法 ( aqueous biphase partition)纯化质膜。按粗提质膜 样品系统液 [ PEG-
3350( Sigma) 6. 4% (W /V ) , Dex t ran T-500( Pha rmacia) 6. 4% (W /V ) , 0. 25 mol /L蔗糖 ,
4. 7 mmol /L pH 6. 8磷酸缓冲液 ]= 1 g 15 g混合 ,另外准备同样体积的两份洗涤系统液
( PEG-3350 6. 4% , Dex tran T-500 6. 4% , 0. 25 mol /L蔗糖 , 4. 7 mmol /L pH 6. 8磷酸缓冲
液 ) ,混合后上下反转 30次左右 ,使加入的被纯化样品和样品系统液及洗涤系统液充分混
合。1000× g离心 5 min,使上相 ( PEG)和下相 ( Dext ran T-500)分层。具体纯化程序按 Las-
son图 [10 ]进行。在将上相质膜沉淀时 ,需将上相稀释 5倍。120000× g离心 30 min,上相沉淀
质膜加悬浮液 2( 5 mmol /L Tris-MES, pH 7. 8, 5 mmol /L DT T, 0. 25 mol /L蔗糖 )用玻璃
匀浆器匀浆 ,此为纯化质膜。纯化质膜根据需要量分装 ,保存于液氮中。
1. 4　 ATP酶活力测定
ATP酶活力测定参照 Ohnishi等 [12 ]方法。纯度检测是通过测定在不同抑制剂存在时
的 ATPase活力 [ 13]。叠氮钠抑制线粒体 ATPase活力 ;钼酸盐抑制酸性磷酸酶活力 ;硝酸
盐抑制液泡膜 A TPase活力 ;钒酸盐抑制质膜 ATPase活力 ;质膜 ATPase活力受 K+ 激
活 [11, 13 ]。只有在 - K+ 的测定中不加入 K+ ,其它情况均加 K+ 。抑制剂浓度见表 1。
1. 5　蛋白测定
蛋白测定参照 Bradford[14 ]的方法。
1. 6　质膜嵌入脂双层及电学测量
质膜嵌入脂双层及电学测量采用文献 [ 15, 16 ]的方法。涂膜液含 25 mg大豆卵磷脂
( Sigma产品 )、 5 mg胆固醇 ( Sigma产品 ) /正 -喹烷 (广州化学试剂公司 ,日本进口分装 )。
放大器为 CEZ-3100单电极电压钳位放大器 (日本光电株式会社 )。用记录仪记录膜电
流和膜电压 ,同时在放大器数字显示器读膜电位和膜电流值。前槽电极电位为膜电位 ,后
槽电极电位为参考电位。质膜 (含 5— 20μg蛋白 )加在后槽 ,搅拌几分钟后膜电导下降 ,说
明质膜嵌入脂双层。停止搅拌后在电压钳位下测量。膜电位由放大器直接加入。
1. 7　离子选择通透性测定
测定离子选择通透性时 ,前槽加入 100 mmol /L NaCl,后槽加入 100 mmol /L KCl,测
定不同的膜电位时的膜电流 ,通过线性回归得稳态逆转膜电位。由逆转膜电位 ,根据 Gold-
man-Hodgkin-Katz( GHK)电压等式:
Erev=
RT
Z F
ln
PNa [Na+ ]后+ PK [K+ ]后
PNa [Na
+
]前+ PK [K+ ]前
计算 K+ , Na+的通透比 ( Pk PNa ) [15 ]。其中 R气体常数 , T绝对温度 , F发拉第常数 , Z离子
所带电荷。钾离子和钠离子为 1, 20℃时 RT /ZF= 25. 26 mV, Pk、 PNa , K+ 和 Na+ 的通透系
数 , [　 ]前、 [　 ]后为前后槽中的浓度。
2　实　验　结　果
2. 1　分离纯化质膜的纯度
ATP酶是植物质膜的一个重要的标志酶 [13 ]。从表 1可知 ,经纯化的质膜 K+ 激活
431期　　　　　　　　裴真明等: 盐胁迫对高粱根质膜离子通道通透性的影响
ATPase活力的比例增加 ,从 25%增至 46% ;钒酸钠抑制的比例增加 ,从 41%增至 51% ;按
相同方法计算 ,其它抑制剂抑制的比例下降。质膜 K+激活 ATP比例增加和钒酸钠抑制
的比例增加说明质膜纯度高 [ 11, 13]。水两相法是纯化质膜的一种良好的方法 ,因此常用于
植物质膜的纯化。
表 1　 ATP酶抑制剂对纯化质膜 ATP酶的抑制作用
Table l　 Effects of inhibitors on ATPase activities in plasmalemma vesicals
反应介质
Reaction medium
ATP酶活力　 ATPase activi ties (μmol( Pi ) /mg /h )
粗提质膜 Crude PM (% ) 纯化质膜 Puri fied PM (% )
　　　　　 - K+ 　　　　 22. 5( 75) 　　　　 16. 0( 54)
　　　　　+ 50 mmol /L KCl 　　　　 29. 9( 100) 　　　　 29. 3( 100)
　　　　　 50μmol /L Na3VO4 　　　　 17. 6( 59) 　　　　 14. 4( 49)
　　　　　 10 mmol /L KNO3 　　　　 20. 4( 69) 　　　　 23. 7( 81)
　　　　　 10 mmol /L NaN3 　　　　 17. 3( 58) 　　　　 22. 7( 77)
　　　　　 500μmol /L Na3MoO4 　　　　 15. 4( 51) 　　　　 24. 6( 84)
　　
PM. Plasma membrane.
　2. 2　对照质膜嵌入脂双层后的离子通道活力
图 1　多通道的膜电流电流图
Fig. 1　 Curr ent r ecords of multi-channels in bilay er
lipid membrane incorpora ted with plasmalemma
在后槽加入 5— 20μg蛋白的质膜 ,嵌
入脂双层后 ,表现为多通道的几率很大 ,
而且多通道可能是多种通道蛋白嵌入质
膜的结果 ,因此某种程度可以代表质膜整
体离子通透性 ,所以本实验测定多通道的
特征。图 1为高粱根质膜嵌入脂双层后典
型的多通道电流特征图。其中前后槽均加
入 100 mmol /L KCl,膜电位 ( Vm ) = 50
mV ,膜电流 ( Im )大于 50 pA,电流向上代
表通道开放 ,电流由上向下代表通道关
闭。从图中可以看出 ,通道开放和关闭的
电流特征是不连续的电流 ,及具有“单位
电流”或称通道的“单位电导”。假如嵌入
脂双层的通道都为同一种通道 ,通道开放
和关闭时的电流变化都是按这一单位电
流的倍数进行。图 1A为多通道的爆发式
开关。在测定通道电流时会发现随机地有
　许多通道同时开放或者关闭 ,这就是通道的爆发式开关 ,像这种爆发式开关在整个测定过
程中出现较少。图 1B是多通道的一般情况的电流特征 , Im在几个通道的开关之间变化 ,一
般记录的通道电流为此时的电流值。
2. 3　对照质膜的离子选择通透性
图 2是对称的 100 mmol /L KCl溶液条件下测得的 I-V关系图 ,脂双层上嵌有多个离
子通道。该 I-V图的特点是通过 Vm= 0mV , Im= 0pA这一点 ,说明离子在前后槽之间的
44 植　　物　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　 37卷
双向流动是一样的。
图 3是有多通道嵌入脂双层时 ,在不对
称溶液条件下 (前槽 100 mmol /L NaCl,后
槽 100 mmol /L KCl)测得的Ⅰ -Ⅴ关系。图 3
中 ,各个点经线性回归的直线和电位坐标的
交点是 32 mV ( n= 3) ,及逆转膜电位 ( Erev )
= 32 mV。根据 GHK电压等式 ,将 Erev= 32
mV代入得 PK PNa= 3. 5 ( n= 3)。
2. 4　盐胁迫后质膜的离子选择通透性
后槽加 100 mmol /L KCl,前槽加入 100
mmol /L NaCl,形成不对称的体系 ,质膜加
在后槽。待质膜嵌入脂双层后改变膜电位 ,
测定膜电流得图 4。
图 2　对称溶液 ( 100 mmo l /L KCl)中多通道的 Im-Vm关系图
Fig. 2　 Current-voltag e relation o f multi-channels
in bilay er lipid mem brane in symmetrio al
solutions of 10 mmol / L KCl
图 3　不对称溶液 ( 100 mmol /L NaCl 100
mmo l /L KCl)中多通道的 Im-V m关系图
Fig . 3　 Current-vo ltag e relation of multi-channels
in bilay er lipid membrane incorpora ted with plas-
malemma o f salt stressed seedlings in asymmetrical
solutions ( 100 mmol / L NaCl 100 mmol /L KCl)
图 4　盐处理质膜在不对称溶液 ( 100 mmo l /L NaCl
100 mmol /L KCl)中多通道的 Im -Vm关系图
Fig. 4　 Current-voltag e relation o f multi-channels
in bilayer lipid membrane incorpora ted with
sa lt-stress pla smalm ma in a sym metrical so lution
( 100 mmol /L NaCl 100 mmo l /L KCl)
当膜电位向小于 Erev变化时 ,膜电流为负 ,这是 K+电流 ;当膜电位大于 Erev时 ,膜电流
为正 ,是 Na+ 电流。从图 4中可以看出 ,与普通质膜的 K+ 、 Na+ 选择性 (图 3)相比较 , K+ 电
流和 Na+ 电流的差异变小 , Erev变小 ,为 9. 6 mV ( n= 5)。由 GHK电压等式得 PK PNa= 1. 5
( n= 5)。很明显通过盐胁迫后 , Na+ 的通透性增加 ,同时说明膜上离子通道的选择性降低。
3　讨　　论
膜的选择通透性是膜很重要的一个特征 ,选择通透性是通过膜上诸多的组分完成的 ,
比如选择性受体 (激素受体或其它信息受体 ,结合后使信息从胞外传递到胞内或相反方向
传递 )、非离子转运体 (跨膜蔗糖运输 )、泵 (包括离子泵和非离子泵 )、离子通道等。
盐胁迫后 ,用测定电导的方法测定的电解质含量的变化 (增加 ) [6, 7 ]是反映细胞膜向外
渗透电解质的量增加 ,这些电解质包括多种离子、氨基酸、有机酸及其它一些可使电导增
451期　　　　　　　　裴真明等: 盐胁迫对高粱根质膜离子通道通透性的影响
加的组分。因此简单地说明电解质外渗不能解释盐胁迫后膜透性变化的细节及其有关方
面。
本实验为盐胁迫后通透性改变提供一种解释 ,即质膜上的离子通道的选择通透性发
生变化。在对照中 PK PNa值大 ,表明通道对 K+ 的选择性大 ,主要是透 K+ ,而 Na+ 进 (出 )
细胞的速率较小 ,盐胁迫后 PK PNa值小 ,表明对 K+ 的选择性降低 ,相对 Na+ 的选择性增
加 , Na+进 (出 )细胞速率增加。其结果 ,在外界存在大量 Na+的情况下细胞内 Na+ 含量提
高 ,另一方面对 K+的选择性降低 (某种程度可代表对 K+ 的亲和力 )影响 K+ 的吸收 ,胞内
K
+ 含量或相对含量降低。在低盐的介质中 Na+通过对 Na+ 选择性大的通道从细胞内流
出 ,致使介质的电导增加 ,这样产生电解质渗漏增加。盐胁迫还有可能改变其它电解质的
通透性 ,这里只能从对 K+ 、Na+ 选择性的改变推测对其它电解质通透性的改变。
通道为蛋白形成的一种可通透离子的亲水孔道 ,通道口为带负电的氨基酸形成的环 ,
已经证明通道选择性由通道蛋白亚基的氨基酸顺序决定 [9, 17 ] ,因此对质膜透性的改变有
两种看法: 1)由于植株经高浓度的 NaCl处理后 , Na+通透率增加 ,大量 Na+ 进入细胞 ,细
胞同时也增加了向外排 NaCl的能力 ,对于不同抗性的植物这种能力的差别可能比较大 ,
这是植物对盐害抵抗的一种生理反应 ,所以盐胁迫诱导植物表达有利于通透 Na+ 的通道
蛋白的基因表达 ,产生新的通道蛋白 ; 2)盐胁迫后使膜上原有的通道蛋白受到一定程度的
破坏 ,有可能导致通道蛋白部分降解 ,这样也可改变通道蛋白的氨基酸顺序 ,所以对 K+
和 Na+的区分能力下降 ,是一种伤害的结果。我们认为伤害的因素大一些。
Maathuis和 Prins[8 ]用膜片嵌方法证明盐胁迫后液泡膜离子通道的单位电导没有发
生改变 ,但是通道的平均开放时间减少 ,因此可以推断出盐胁迫后跨膜离子运输减少。本
实验结果证明是离子跨膜运输增加了 ,尤其可能 Na+ 比正常情况下生长的植株更容易从
细胞内流出。这可能是质膜和液泡膜的差别。
总之 ,植物离子通道对盐胁迫响应的研究尚属起步阶段 [ 4, 5]。盐胁迫后是否有新的离
子通道的出现 ,原有的离子通道的特性是否发生变化等还不清楚 ,因此有必要深入研究。
参 考 文 献
1　石谷学 ,荒川奎太 ,高倍铁子 .植物耐盐性の分子机制 .植物の化学调节 . 1990. 25: 149— 162
2　 Tang Z C. The accumulation of f ree proline and it s roles in water-st ressed sorghum seedlings. Acta Ph ytophys Sin,
1989. 15: 105— 110
3　 Timpa J D, Burke J J, Quisenberry J E et al . Effects of w ater s tress on th e organic acid and carbohydrate oomposi tion
of cot ton plants. Plant Ph ysiol , 1986. 82: 724— 728
4　 Hedrich R, Sch roeder J I. The ph ysiology of ion channels and elect rogenic pump in high er plan ts. Plant Mol Biol ,
1989. 40: 539— 569
5　 Sch roed er J I, Hedrich R. Involvement of ion chann els and activ e t ransport in osmoregulation and signaling of higher
plants cells. T IBS , 1989. 14: 87— 92
6　石德成 ,殷立娟 .盐 ( NaCl)与碱 ( Na2CO3 )对星星草胁迫作用的差异 .植物学报 , 1993. 35: 144— 149
7　赵可夫 ,卢元芳 ,张宝泽等 . Ca对小麦幼苗降低盐害效应的研究 .植物学报 , 1993. 35: 51— 58
8　 Maathuuis F JM , Prins H B A. Patoch clamp studies on root cellvacuoles of a salt-tolerant and asalt-sensitiv e Plnata-
go Species. Plant Ph ysiol , 1990. 92: 23— 28
9　 Tester M . Plants ion ch nnels: wh ole-cell and single-channel studies. N ew Phytol , 1990. 144: 305— 340
10　 Larsson C, Widell S, Kjellbom P. Preparation of high-pu rity plasma memb ranes. J Methods Enzymol , 1987. 148:
558— 575
11　 Sandelius A S, Morre D J. Plasma mem brane isolation. In: Larsson C, Momm er M eds. , The Plant Plasma Mem-
46 植　　物　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　 37卷
brane. Berlin: Springer-Verlag, 1990. 44— 61
12　 Ohnishi T, Gall R S, Mayer L M. An improved assay of inorganic phosphate in th e ph soph ate compounds: Applica-
tion to th e AT Pase assay in the presence of ph osphocreatine. Anal B ioohem, 1975. 69: 261— 167
13　 Donald P B, Robert T L, Thomas K H. Isolation of th e plasma m embrane: Membrane markers and general pronci-
ples. J Methods Enzymolog y, 1987. 148: 542— 558
14　 Bradford M M. A rapid and sensitiv e method for th e quantitation of microg ram quan titi es of protein using th e principle
of protein-d ye binding. Anal Biochem, 1976. 72: 248— 254
15　施玉木梁 ,王文萍 ,周亦昌 .金褐霉素 ( aureofuscin)在人工脂双层形成的离子通道 .生理学报 , 1991. 43: 128— 133
16　裴真明 ,汤章城 .平面双层脂膜系统用于植物离子通道研究 .植物生理学通讯 , 1993. 16: 445— 446
17　 Sakmann B. Elementary steps in synaptic t ransmission revealed by ourrents through single ion ch annels. Neuron,
1992. 8: 613— 629
471期　　　　　　　　裴真明等: 盐胁迫对高粱根质膜离子通道通透性的影响