全 文 ：灰树花糖蛋白中总糖含量的测定
杨晓华 , 于广利 , 赵 　峡 , 宋乐天 , 高昊东
(中国海洋大学海洋药物与食品研究所 , 山东 青岛 266003)
摘　要:　探讨糖蛋白中总糖含量测定的简捷方法 , 以 2 种灰树花糖蛋白(GF6A , GF6B)为原料 , 分别以硫酸-苯酚法和次亚
碘酸钠法对其中的总糖含量进行了比较分析。结果显示 ,应用前者方法测定多糖含量分别为 85.45%和 38.46%, 采用后者
方法测定结果分别为87.03%, 36.51%, 2种方法测定的结果相近 ,其中以硫酸-苯酚法因不需对样品进行预水解 ,方法简便 、
可靠 ,更适合于糖蛋白中总糖含量测定。
关键词:　灰树花糖蛋白;硫酸-苯酚;次亚碘酸钠;总糖
中图法分类号:　Q936　　　　　文献标识码:　A　　　　　文章编号:　1672-5174(2006)06-929-03
　　灰树花(Gri fola frondosa)是 1 种药食两用真菌 ,
口味鲜美 ,营养丰富 ,含有多种活性物质 ,极具开发价
值。目前 ,灰树花大规模发酵技术已经成熟[ 1-3] ,为产
业化开发提供了前提 。针对该菌中活性物质尤其是多
糖及其复合物 ,国内外学者展开了深入研究 ,灰树花多
糖作为生物反应调节剂(BRM),其显著的生物活性逐
渐被人们认识。大量研究发现 ,灰树花多糖具有抗肿
瘤和免疫调节功能[ 4-5] ,调节血糖[ 6] ,降血压[ 7] ,抗HIV
病毒等作用[ 8-10] 。灰树花糖蛋白含 β-1 , 3/1 , 6-葡聚糖
结构 ,其口服制剂于 2005年 5月得到美国 FDA 批准 ,
进入 I/ II期临床用于抗乳腺癌。由于灰树花糖蛋白中
总糖含量影响产品的药效 ,为了有效控制产品的质量 ,
建立快速可靠的分析方法十分必要 。
糖蛋白中总糖含量一般采用硫酸-苯酚法进行定
性鉴别[ 11] ,总糖含量的可靠性研究较少 。本文以 2种
灰树花糖蛋白(GF6A ,GF6B)为材料 ,分别采用苯酚-硫
酸法[ 12-13]和次亚碘酸盐定量法[ 14]对 2种糖蛋白中多
糖含量进行了测定 ,综合比较了 2种方法在蛋白含量
不同情况下对多糖含量测定的影响 ,为糖蛋白中总糖
含量的测定提供简捷可靠的分析方法。
1　材料与方法
1.1 实验材料
灰树花菌丝粉(济南澳利生物工程公司);UV-
2102 PCS型紫外可见分光光度计(尤尼柯公司);快速
蛋白质纯化系统(FPLC , KTATM , UNICORNTM 4.11
Pharmacia ,瑞典);Q Sepharose FF 柱(1.6×30 cm , 90
μm ,Pharmacia ,瑞典);葡萄糖及牛血清白蛋白(Sigma ,
美国);Folin-酚试剂乙以及重蒸酚(北京鼎国公司);其
它试剂均为分析纯 。
1.2 实验方法
1.2.1 灰树花糖蛋白制备[ 1] 　　灰树花菌丝粉依次以
80%乙醇 ,100 ℃水 ,4 ℃2 mol/L NaOH 10%提取后离
心 ,收集残渣 ,再以 60 ℃2 mol/L NaOH 10%提取 、离
心 ,上清液经乙酸中和 、离心后 ,超滤浓缩 、脱盐并冻干
得到粗多糖 GF6 ,然后将 GF6用 Q-Sepharose FF 离子
交换柱进行分离纯化 ,得到 2种糖蛋白组分 GF6A 和
GF6B。
1.2.2 糖含量测定
1.2.2.1 苯酚-硫酸法[ 11-12] 　标准曲线绘制:精密吸取
0.1 mg/mL 葡萄糖标准溶液 0 , 0.05 , 0.1 , 0.2 , 0.3 ,
0.4 mL ,加水补至 0.5 mL ,分别加 0.3 mL 6%苯酚并
混合 ,以瓶口移液器(Brand公司)快速加入浓硫酸 1.5
mL ,涡流混合后 ,置沸水中加热 20 min ,冰浴中冷却后
用微量比色皿于 490 nm 测定吸光度。总糖含量的测
定:准确吸取已知浓度样品液 0.5 mL ,按标准曲线项
下操作 ,测定吸光度 ,并由回归方程计算总糖含量。精
密度试验 、显色稳定性试验以及回收率试验均按常规
方法进行测定 。
1.2.2.2 次亚碘酸钠法[ 13] 　0.1 mol/ L 硫代硫酸钠储
备液采用基准重铬酸钾法标定 , 0.01 mol/L 硫代硫酸
钠使用液临用前以上述贮备液稀释。单糖测定:精密
称量样品 40 mg ,用 10 mL 稀硫酸(1.026 mol/L)溶
解 ,加 1 ～ 2滴酚酞指示剂 ,以 2 mol/L 氢氧化钠试液

通讯作者 ,glyu@ouc.edu.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(30370345)资助
收稿日期:2005-10-22;修订日期:2005-12-05
作者简介:杨晓华(1980-),女 ,硕士。
　 第 36卷　第 6期 　
2006年 11月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSIT Y OF CHINA
36(6):929～ 931
Nov., 2006
调节 pH 至中性 , 转移并定容至 100 mL。精密移取上
液 15 mL 于碘瓶中 ,准确加入 0.1 mol/L 碘液 5 mL ,
在剧烈搅拌下 ,逐滴加入 0.15 mol/L 氢氧化钠试液 5
mL ,密塞 ,暗处放置 30 min后 ,加稀硫酸 1 mL ,立即以
0.01 mol/ L 硫代硫酸钠滴定 , 消耗体积为 V 1 。多糖
测定:精密称量样品 40 mg ,加 10 mL 稀硫酸 ,充分溶
解 ,封管 ,于 105 ℃烘箱水解 6 h ,冷却至室温后调节
pH至中性并定容至 100 mL。取 15 mL 水解液如前法
滴定 ,消耗体积为 V 2。含量计算:每 1 mL 0.1 mol/L
碘液相当于 9.008 mg 无水葡萄糖 ,由公式{[ (V 1 -
V2)/10] ×9.008}×100/6计算多糖百分含量 。取水
解液 5份 , 按上述方法作精密度实验 。精密称量样品
40 mg ,准确加入 10 mg标准葡萄糖 ,按上法进行水解 、
中和 、定容和滴定分析 ,计算回收率 。
1.2.3蛋白含量测定[ 15] 　　采用 Folin-酚法。
2　结果与讨论
2.1 苯酚-硫酸法对糖含量测定的影响
苯酚-硫酸法自1956年Dubis M 等提出后 ,经不断
改良 ,已成为常规的糖类分析方法。该方法不仅适合
于单糖 、寡糖和多糖定性和定量分析 ,而且可用于各种
糖复合物如糖蛋白 、糖肽和糖脂中总糖的定性分析中 ,
尚未见该法用于中性糖蛋白中总糖定量分析 。该方法
虽然操作简单 ,但需要掌握操作中的某些关键点 ,如控
制样品溶液中糖的浓度 ,苯酚的纯度 、浓度和体积 ,滴
加浓硫酸的速度与体积 ,以及加热的温度和时间等因
素 ,否则影响测定结果的准确性和重现性。本实验室
在大量实验基础上 ,提出了如下改良方法:即样品体积
0.5 mL(含糖 1 ～ 40 μg), 6%重蒸酚 0.3 mL , 98%浓
硫酸 1.5 mL ,100 ℃水浴加热 20 min ,于 490 nm 波长
检测 。采用上述方法 ,以标准葡萄糖含量(Y ,μg)对吸
光度(X , ABS)作回归分析 , 得回归方程为 Y =
47.632X -0.181 7(r =0.999 7),经计算求得 GF6A
中多糖含量为 85.45%(RSD 0.51%, n=5),GF6B中
多糖含量为 38.46%(RSD 0.56%, n=5)。该法样品
用量较少 ,显色稳定性好(5 h 内 RSD<0.29%),对
GF6A与GF6B 平均回收率分别为 99.23%和99.86%,
其测定结果见表 1。为了探讨蛋白对糖含量测定结果
的影响 ,本文向 GF6A 中添加了不同量的 BSA ,采用上
述方法测定吸光度 ,并计算总糖含量 ,由表 2 结果知 ,
外加蛋白含量的多少并不影响 GF6A中总糖测定的结
果 ,7次平均测定结果为 85.64%。由于苯酚-硫酸法
有较好的准确性且回收率高 ,因此 ,是测定糖蛋白中总
糖含量的可靠方法。
表 1　苯酚-硫酸法测定 GF6A与 GF6B中总糖含量及其
回收率(n =5)
Table 1　Total sugar contents and recovery rates o f GF6A and
GF6B by sulfuric acid-phenol method / %
样品 Sample 糖含量
Sugar content
回收率
Recovery rate
蛋白含量
P rotein content
GF6A
GF6B
85.45
38.46
99.23
99.87
14.07
64.13
表 2　蛋白对苯酚-硫酸法测定 GF6A 总糖
含量的影响(n=3)
Table 2　I nfluence of pro tein on sugar content determination in
GF6A by sulfuric acid-phenol method
BSA加入量/μg
Added amount
of BSA
0 5 10 20 40 80 100
体系中蛋白
含量 Protein
in sy stem/ %
GF6A 中糖含
量 Sugar content
in GF6A/ %
14.07
85.45
31.26
85.93
42.71
86.50
57.04
85.74
71.36
85.48
82.81
84.97
85.68
85.41
2.2 次亚碘酸钠定量法对糖含量测定的影响
次亚碘酸盐定量法是测定中性还原糖的常用定量
方法之一 ,该方法利用碘在碱性条件下形成的 IO-离子
氧化醛糖 ,然后用硫代硫酸钠回滴过量的碘 ,从而间接
计算糖含量。该法不仅需要准确标定硫代硫酸钠的浓
度 ,而且需要对样品进行全水解 ,考虑到氯离子对滴定
反应有影响 ,选用稀硫酸为水解剂 ,同时为了避免高温
水解时对糖造成的氧化损失 ,采取氮气保护密封水解
法。采用本法分析后 ,GF6A与 GF6B总糖含量分别为
87.03%和 36.51%, 加样回收率分别为 98.46%和
96.19%,结果见表 3。结果表明 ,次亚碘酸法和苯酚-
硫酸法的准确性和回收率均较高 ,但次亚碘酸法样品
前处理步骤复杂 ,每次滴定样品量为几个毫克 ,因此不
适合于微量样品中总糖含量测定 。
表 3　次亚碘酸钠法测定 GF6A与 GF6B中总糖含量及回
收率(n=5)
Table 3　Total sugar contents and recovery rates o f GF6A and
GF6B by NaIO method　 / %
样品
Sample
糖含量
Sugar content
回收率
Recovery rate
蛋白含量
P rotein content
GF6A 87.03 98.46 14.07
GF6B 36.51 96.19 64.13
930 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 6 年
3　小结
本文以灰树花糖蛋白为原料 ,探讨了苯酚-硫酸法
和次亚碘酸钠定量法对 GF6A 和 GF6B中总糖含量测
定的影响 。结果表明 ,2种方法均适合于糖蛋白中总糖
含量分析 ,样品中蛋白含量的高低(<85%)对糖蛋白
中总糖测定结果影响较小 。次亚碘酸盐定量法只适用
于醛糖样品测定 ,体系中不能含有还原性杂质 ,不能用
于寡糖和多糖的直接分析 ,样品必须全水解为单糖 ,操
作步骤较繁琐 ,且样品用量为毫克级 ,使其在微量样品
分析中受到一定的限制 , 然而苯酚-硫酸法无上述缺
点 ,可对糖蛋白中多糖和寡糖的总量进行直接分析 ,因
而在微量糖分析方面具有显著优势 ,因此 ,当样品量较
少(≤40 μg)且主要含中性己糖时 ,可采用苯酚-硫酸
法。此外 ,由于本法只以葡萄糖为标准 ,且样品为葡聚
糖蛋白 ,而有些糖蛋白由于单糖的种类复杂 ,除了含有
中性己糖外 ,还可能含有大量的酸性糖如糖醛酸和唾
液酸及其衍生物等 ,如果进行该类糖蛋白中总糖定量
分析 ,还应考虑采用其它分析方法 。
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Determination of Total Sugar in Glycoprotein of Grifola frondosa
YANG Xiao-Hua , YU Guang-Li , ZHAO Xia , SONG Le-Tian , GAO Hao-Dong
(I nstitute of Marine Drug and Food , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:　In this study , the to tal sugar contents of tw o glycoproteins(GF6A and GF6B)purified f rom Gri-
fola frondosa were compared and analy zed by the sulfuric acid-phenol colorimetric method and the NaIO tit ra-
tion method.The experimental results showed that the total sugar contents of GF6A and GF6B were 85.45%
and 38.46%, respectively by the sulfuric acid-phenol method , and 87.03% and 36.51%, respect ively by the
NaIO method.The reliabili ty and stability of the two methods were similar;how ever , compared to the NaIO
method;the sulfuric acid-phenol method w as faster and convenient , therefore it is more suitable for the total
sugar analy sis in g lycopro tein.
Key words:　Gri fola frondosa glycoprotein;sulfuric acid-phenol;NaIO;total sugar
责任编辑　于　卫
9316期 杨晓华 ,等:灰树花糖蛋白中总糖含量的测定