全 文 ：Results:SophorasubprosratepolysaccharidesiginificantlypromotedproliferationofTlymphocytesandBlymphocytesatconcentrationsran-
gingfrom100 mg/Lto400mg/L(P<0.05 ～ 0.01).Afterincubationof24h, Sophorasubprosratepolysaccharidemarkedlyincreasedthe
productionofnitricoxide(NO)inmurinespleniclymphocytesatconcentrationsrangingfrom50 mg/L～ 200 mg/L(P<0.05)andtheNO
levelkeptahighlevelinthefolowing24hours(P<0.01).TheNOsecretedbyspleniclymphocytestreatedwithSophorasubprosratepoly-
saccharideatconcentrationof400 mg/Lrosemarkedlybeginningfrom24 hoursandkeptahighlevelinthefollowing24 hours(P<0.01).
Conclusion:Sophorasubprosratepolysaccharidewasabletostimulateproliferationofspleniclymphocytesandincreasetheproductionofni-
tricoxideofthetreatedcelsinvitro.
Keywords　Sophorasubprosratepolysaccharide;Lymphocyte;Proliferation;Nitricoxide
不同红芪多糖抗肿瘤和免疫调节作用研究＊
王希玉 ,路　莉 ,胡　燕 ,赵健雄 ,程卫东 ,王学习＊＊
(兰州大学基础医学院 ,兰州　 730000)
　　摘　要　目的:观察不同单体红芪多糖(HPS)的抗肿瘤和免疫调节作用。方法:不同 HPS作用于 S180荷瘤小鼠 , 观察其生存
质量 , 计算抑瘤率和胸 、脾指数 ,测定脾淋巴细胞转化功能 、NK细胞和 LAK细胞活性及红细胞天然免疫活性。结果:不同 HPS均可
提高荷瘤小鼠生存质量 ,抑制肿瘤生长 , 增强淋巴细胞转化功能 、NK细胞和 LAK细胞活性 , 改善红细胞天然免疫功能 , 但以 HPS-3
的作用最佳。结论:HPS-3具有一定的抑制肿瘤生长和改善荷瘤机体免疫状态作用。
　　关键词　红芪多糖;抗肿瘤;红细胞免疫
　　红芪多糖具有抑瘤 、调节免疫 、降血糖和促进损伤神经再
生等作用 , 但大部分是针对红芪总多糖的研究 [ 1 ～3] 。作者所在
实验室对红芪总多糖进行分离 、纯化得到 3种理化性质相对明
确的均一多糖 , 体外研究证实具有抗肿瘤作用 , 并与其结构相
关 [ 4, 5] , 故进一步研究其体内抗肿瘤作用。
1　材料与方法
1.1　试验药物　取无水乙醇回流提取 4h×3次后的自然阴干
红芪饮片残渣水煎 , 1.5h×2次 , 合并提取液 , 减压浓缩 , 离心取
上清液进行梯度醇沉 , 得沉淀物。沉淀物 H2O溶后透析去除小
分子杂质 , 中性酶法 、Sevag法除蛋白 , 再次醇沉。 沉淀物依次
以 95%乙醇 、无水乙醇 、乙醚洗涤 ,冷冻干燥得红芪总多糖。红
芪总多糖经 SephadexG-200柱层析分离得到红芪多糖 1(HPS-
1)、红芪多糖 2(HPS-2)、红芪多糖 3(HPS-3)。三种 HPS经检
测为均一多糖 ,其中 HPS-1, 白色絮状粉末 , 蛋白含量 0.2%,分
子量 9.4×104 Da, 由一种单糖 α-D-Glcp组成;HPS-2, 白色絮状
粉末 , 蛋白含量 0.4%, 分子量 6.4×104 Da, 由三种单糖 α-D-
Xylp、α-D-Galp和 α-D-Glcp组成 ,摩尔比 0.14:0.16:1.00;HPS-
3,淡黄色絮状粉末 , 蛋白含量 0.3%, 分子量 1.7 × 104 Da, 由
四种单糖 α-L-Rhap、α-D-Xylp、α-D-Galp和 α-D-Glcp组成 ,摩尔
比 0.04:0.19:0.19:1.00。环磷酰胺(CTX), 上海华联制药有限
公司 , 批号 080406。
1.2　试剂 　 酵母菌 、灭活 S180瘤细胞 , 上海长海医院输血科
免疫室;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、脂多糖 LPS、刀豆素 ConA, sig-
ma公司;RPMI-1640培养基 , GIBCO公司。
1.3　动物和细胞株　清洁级昆明种小鼠 60只 ,体重(20 ±2)
g,雌雄各半 , 兰州生物制品研究所动物室 , 合格证号:14-006;
S180小鼠肉瘤细胞株 ,兰州大学药理学研究所。
1.4　方法　小鼠 60只 , 右腋皮下接种 S180瘤细胞悬液(1 ×
107个细胞 /ml)0.2ml/只。 造模 24h后 , 荷瘤动物按体重分层
随机分为 5组:模型组(NS), 阳性对照组(CTX, 20mg/kg), HPS-
1组(HPS-1, 200mg/kg)、HPS-2组(HPS-2, 200mg/kg)和 HPS-3
组(HPS-3, 200mg/kg)。所有动物等体积 ip给药 , 1次 /d, 连续
14d。治疗结束次日动物称重 ,心脏采血 , 枸櫞酸钠抗凝 , 检测红
细胞天然免疫活性;处死动物 , 摘取脾脏 、胸腺和瘤体 , 称重 , 计
算脾脏指数 、胸腺指数和抑瘤率 , 并进行后继相关实验。
1.4.1　动物一般状况观察和生存质量评分 　 实验过程中观
察动物的一般状况 ,包括饮食 、皮毛和活动状况等。实验结束次
日 ,处死动物前 , 参考相关标准进行小鼠生存质量评分。
1.4.2　肿瘤组织形态学观察 　每组随机取 2只小鼠肿瘤组织
进行肿瘤组织形态学观察 , 包括瘤组织弥散程度 、坏死情况 、周
围炎细胞浸润状况和瘤细胞浸润程度等。
1.4.3　淋巴细胞转化功能测定 　无菌制备脾细胞悬液 ,每只
动物设 ConA/LPS刺激孔和对照孔 , 每孔设 3个复孔 , MTT法测
定 OD570nm值 , 计算刺激指数 ,用以表示 T淋巴细胞转化功能
和 B淋巴细胞转化功能。刺激指数 =刺激孔平均 OD值 /对照
孔平均 OD值
72 中药药理与临床 2009;25(5)
＊ 兰州市科技局项目(07-1-96);甘肃省科技攻关计划项目(2GS064-A43-020-32)　　　　＊＊通讯作者
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2009.05.005
1.4.4 　NK细胞和 LAK细胞活性检测　无菌制备脾细胞悬
液 , 调整细胞浓度为 5×106 /ml。取生长良好的 NK细胞敏感小
鼠淋巴瘤 YAC-1细胞和 LAK细胞敏感小鼠淋巴肉瘤 EL-4细
胞 , 调整细胞浓度为 5×104 /ml。每实验组分别设 100:1、 25:1
效靶比 , 同时设效应细胞对照和靶细胞对照 , MTT法测定
OD570nm值 , 计算 NK细胞活性和 LAK细胞活性。 细胞活性 =
[ 1-(实验孔 OD值-效应细胞对照孔 OD值)/靶细胞对照孔 OD
值 ] ×100%
1.4.5　红细胞天然免疫活性的测定　 治疗结束次日 , 心脏采
血 , 枸櫞酸钠抗凝 , 按郭峰法检测红细胞 C3b受体(RBC-C3b)
花环率 、红细胞免疫复合物(RBC-IC)花环率和红细胞肿瘤细胞
(RBC-TC)花环率。
2　结果
2.1　 HPS对荷瘤动物一般状况和生存质量评分的影响 　模
型组动物在实验后期饮食减少 ,形体消瘦 , 包块增大 ,运动缓慢 ,
皮毛无光泽 , 竖毛现象明显 ,反应迟钝 , 实验过程中死亡 1只。
CTX组小鼠状态不及其余各组 , 部分小鼠有便稀 /便秘现象 ,皮
毛无光泽而稀疏脱落 , 少动 , 喜群聚 , 且上述症状逐日加重。
HPS各组与模型组相比 , 一般情况尚可 , 被毛光泽 ,无竖毛现象 ,
仍喜活动 , 食量无明显减少。小鼠生存质量评分结果如表 1所
示 , HPS作用于 S180实体瘤小鼠 , 可以提高其生存质量评分值 ,
其中 HPS-3组与模型组比较差异有显著性。
2.2　 HPS的抗肿瘤作用　如表 1所示 , HPS作用于 S180荷瘤
小鼠 , 各组动物瘤体重量均有不同程度地减少 , 具有一定的抗
肿瘤作用 , HPS-1组抑瘤率为 12.8%, HPS-2组抑瘤率为 19.
51%, HPS-3组抑瘤率为 26.83% 。
　　表 1　 HPS的抗肿瘤作用( x±s)
组别 剂量(mg/kg) n 生存质量评分
瘤重　
(g)　
抑瘤率
(%)
模型 11 2.0±0.8 1.64±0.21
CTX 20 12 1.8±1.1 0.74±0.19＊＊ 54.89
HPS-1 200 12 2.3±0.8 1.43±0.22＊＊ 12.8
HPS-2 200 12 2.5±0.9 1.32±0.24＊＊ 19.51
HPS-3 200 12 2.8±0.9＊ 1.20±0.24＊＊ 26.83
　　与模型组比较 ＊ P<0.05, ＊＊ P<0.01(下同)
2.3　 HPS对肿瘤组织形态学的影响 　镜下可见模型组肿瘤
组织血管丰富 , 纤维间质少;肿瘤细胞生长旺盛 , 数量丰富而密
集 , 肿瘤细胞大小不一 ,形态各异 , 胞核大 , 病理性核分裂相多;
肿瘤细胞从接种部位大量浸润至肌肉组织和脂肪组织。肿瘤
组织边缘的肿瘤细胞有少量坏死 , 胞核浓缩或碎裂 , 并伴有炎
性细胞浸润。 CTX组肿瘤组织内出现坏死区 , 可见肿瘤细胞残
影;坏死区呈网络状 ,将生长的肿瘤组织分割成小的瘤细胞团 ,
肿瘤细胞密度较模型组为小 , 少量细胞核固缩 , 细胞核碎裂增
多 , 有一些散在空泡。 HPS各组出现不同程度的肿瘤细胞减少 ,
部分细胞坏死 、变性 ,胞核固缩 、碎裂 , 可见肿瘤细胞残影 , 且肿
瘤周边组织反应明显;肿瘤间质内有以大量淋巴细胞为主的炎
性细胞浸润 , 部分呈条带状。
2.4　 HPS对荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的影响　如表 2所
示 , HPS作用于 S180荷瘤小鼠可提高脾脏指数和胸腺指数 ,其
中 HPS-3组与模型组比较 ,胸腺指数有显著性差异。 CTX组脾
脏指数和胸腺指数降低。
　　表 2　 HPS对荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的影响( x±s)
组别 剂量(mg/kg) n
脾脏指数　　
(mg/g)　　
胸腺指数　　
(mg/g)　　
模型 11 5.21±0.72 1.44±0.25
CTX 20 12 4.12±0.88＊＊ 1.16±0.19＊＊
HPS-1 200 12 5.38±1.12 1.52±0.21
HPS-2 200 12 5.18±0.94 1.61±0.22
HPS-3 200 12 5.81±0.81 1.66±0.23＊
2.5　HPS对荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响　如表 3所
示 , HPS作用于 S180荷瘤小鼠 ,可不同程度提高淋巴细胞转化
功能 ,其中以 HPS-3组最为明显。
　　表 3　 HPS对荷瘤小鼠 T/B淋巴细胞转化功能的影响( x±s)
组别 剂量(mg/kg) n T细胞刺激指数　　B细胞刺激指数
模型 11 1.43 1.19
CTX 20 12 1.34 1.01
HPS-1 200 12 1.40 1.21
HPS-2 200 12 1.48 1.24
HPS-3 200 12 1.51 1.38
2.6　 HPS对荷瘤小鼠 NK细胞和 LAK细胞活性的影响　如表
4所示 , HPS可增强 S180荷瘤小鼠 NK细胞活性和 LAK细胞活
性 ,与模型组比较 , HPS-3组 NK细胞和 LAK细胞活性均有显著
性差异 , HPS-2组 LAK细胞活性 100:1效靶比有显著性差异。
　　表 4　 HPS对荷瘤小鼠 NK细胞和 LAK细胞活性的影响( x±s)
组别 剂 量(mg/kg)
NK细胞活性 (%)
25:1 100:1
LAK细胞活性 (%)
25:1 100:1
模型 19.88±5.87 22.43±5.96 28.38±7.26 34.63±7.80
CTX 20 20.33±5.78 22.29±7.27 26.12±5.49 31.95±6.81
HPS-1 200 24.29±6.25 24.81±5.98 28.29±6.87 36.17±7.04
HPS-2 200 24.48±6.46 27.35±6.19 31.32±7.49 40.81±6.41＊
HPS-3 200 25.92±7.53＊ 29.17±6.97＊ 35.35±7.13＊ 43.42±7.82＊
2.7　 HPS对荷瘤小鼠红细胞天然免疫功能的影响 　如表 5
所示 , HPS作用于 S180荷瘤小鼠 , 可不同程度提高 RBC-C3b和
RBC-TC花环率 ,降低 RBC-IC花环率。与模型组比较 , HPS-3组
RBC-C3b和 RBC-TC花环率有显著性差异 , HPS-2组 RBC-TC
花环率有显著性差异 , CTX组 RBC-TC花环率有显著性差异。
　　表 5　 HPS对荷瘤小鼠红细胞天然免疫功能的影响( x±s)
组别 剂量(mg/kg) n
花环率 (%)
RBC-C3b RBC-IC RBC-TC
模型 11 10.26±3.56 13.83±4.96 16.28±4.12
CTX 20 12 7.12±2.44 15.86±3.87 12.69±3.43＊
HPS-1 200 12 12.49±3.76 13.94±4.65 18.45±4.64
HPS-2 200 12 12.98±3.49 10.84±3.96 19.78±3.89＊
HPS-3 200 12 14.87±3.54＊ 10.23±3.44 21.36±4.88＊
3　讨论
　　研究者所在实验室体外研究证实红芪三种多糖具有抗肿
瘤作用 ,并与其结构相关 [ 4, 5] , 因此进行体内抗肿瘤作用研究。
结果显示:三种多糖均有一定的抗肿瘤和免疫调节作用 , 以
HPS-3的作用最佳。
　　现代研究认为 ,人人机体都有癌细胞存在 , 带有癌细胞的
健康人不患癌症的主要原因是人体中的免疫活性细胞存在有
较强的免疫监视功能 ,使癌细胞的繁殖速度与清除速度处于一
个平衡状态。而大多数肿瘤患者则是由于肿瘤细胞逃脱了免疫
系统的攻击 ,进而逐步发展为肿瘤 [ 6] , 因此肿瘤患者免疫功能
状态的改善对肿瘤的治疗和愈后至关重要。
73中药药理与临床 2009;25(5)
　　胸腺与脾脏为主要的免疫器官 , 其中胸腺是 CD4 +T细胞
分化和发育成熟的主要场所 , 而脾脏则是机体进行免疫应答的
主要场所 , 它们与体液免疫 、细胞免疫均有密切关系 , 二者结构
和功能的正常对于维护机体的免疫功能 , 发挥机体自身的抗肿
瘤免疫效应非常重要。 NK细胞和 LAK细胞是具有杀瘤活性的
效应细胞 [ 7] , 杀瘤谱较广 ,可通过与瘤细胞的密切接触 , 直接杀
伤同系 、同种及异种瘤细胞。该研究中 HPS作用于 S180荷瘤
小鼠可提高 T/B细胞刺激指数 , 增强小鼠脾淋巴细胞增殖反应
及 NK细胞和 LAK细胞杀瘤活性。同时 , 还可提高脾指数及胸
腺指数 , 增加免疫器官重量。荷瘤小鼠上述免疫活性的改善 , 有
助于发挥机体自身的抗肿瘤免疫效应。
　　在机体抗肿瘤免疫效应机制中 ,红细胞是血循环中最重要
的天然免疫细胞 , 其细胞膜上有许多与免疫有关的物质(如
CD35、CD44s、CD58、CD59、SOD酶等),它具有识别 、粘附 、浓缩 、
杀伤抗原 、清除循环免疫复合物等天然免疫功能 , 该研究通过
检测 RBC-C3b、RBC-IC和 RBC-TC花环率 , 证实 HPS可增强红
细胞天然免疫功能。
　　红细胞与其它免疫细胞相互作用 , 形成复杂的免疫调节网
络 , 参与机体的免疫调控 [ 8] 。通过平衡红细胞免疫活性可纠正
淋巴细胞的病理状态 , 可增强白细胞对抗原的识别能力 , 同时
可增强抗原对白细胞 , 包括淋巴细胞 、和粒细胞等 , 激活和效应
作用 [ 9, 10] ,调节机体的免疫功能 , 起到抗肿瘤作用。该研究中检
测 HPS对荷瘤小鼠红细胞天然免疫活性和其它细胞免疫功能
的影响 , 结果佐证了上述观点 , 即同一 HPS对红细胞免疫活性
有较强改善者 , 则其对相关白细胞的功能改善亦显著。
　　该研究中 , 三种红芪多糖均有一定的抗肿瘤和免疫调节作
用 , HPS-3的作用最强 , HPS-1最弱 , 这与体外实验结果不完全
一致 [ 4, 5] 。分析原因 ,与两者肿瘤细胞株的选择不一致和体内
外实验体系差异有关。同一样品体内外实验结果往往有很大
差异 ,该研究结果差异的具体原因有待于通过增加细胞株种类
和重复实验进一步探讨。
参考文献
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2006;28(2)∶ 79 ～ 83
大黄息风止痉功能研究
张文风 ,梁茂新
(辽宁中医药大学 , 沈阳 　110032)
　　摘　要　目的:观察大黄对实验性癫痫的防治作用 , 为借助古代方剂文献获取的大黄息风止痉潜在功能提供客观依据。方
法:采用最大电惊厥(MES)、戊四唑 、士的宁等化学性癫痫模型 , 给予大黄 1g/kg、 2g/kg、 4g/kg每日 1次灌胃 , 观察动物的惊厥发作
次数 、发作潜伏期及动物存活时间以及脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性的影响。
结果:大黄可减少 MES发作次数 , 延长戊四唑 、士的宁所致小鼠惊厥的潜伏期 , 延长戊四唑癫痫大鼠发作潜伏期 , 提高脑组织 SOD、
GSH-PX活性 , 降低 MDA水平。结论:大黄可以对抗小鼠 MES、戊四唑和士的宁等化学性惊厥及癫痫大鼠脑组织氧化 , 对癫痫有一
定的防治作用 , 为确认其息风止痉功用提供了客观依据。
　　关键词　大黄 ;息风止痉 ;癫痫
　　2005版国家药典一部载大黄有泻热通肠 , 凉血解毒 , 逐瘀
通经功能。借助《普济方》数据库管理系统 [ 1] , 以大黄为关键词
进行检索 , 发现大黄复方用于一切痫 32方 、惊痫 26方 、风痫 17
方 、熱痫 10方 、截痫法 8方 、癫痫 7方 、痫 7方 、痫瘥复发 4方 、
食痫 4方 , 总计 115方。这些复方中 , 独活汤 、茯苓钩藤汤 、丹砂
丸 、茯苓汤等由 4种药物组成;细辛大黄汤 、麻黄汤 、地黄汁汤和
虎睛丸等由 5种药物组成 , 6种药物的大黄复方则有当归大黄
汤 、茵陈汤 、钩藤饮子 、干姜汤 、钩藤散 、独活散等。由此推测 , 大
黄单味药物可能对癫痫也有一定的治疗作用。 倘若如此 ,在大
黄传统功能之外 ,似乎还应存在息风止痉的潜在功能。这可
能是其被配伍在 115方中用于治疗各种痫疾的根本依据。本研
究通过最大电惊厥 、戊四唑 、士的宁惊厥模型对大黄的抗惊厥作
用及机理进行初步研究 , 以证实其息风止痉作用的客观存
在。
74 中药药理与临床 2009;25(5)