全 文 ：2009 第十一卷 第一期 ★Vol.11 No.1
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
罗氏海盘车（Asterias rollestoni Bell.）是一种海星
纲棘皮动物，广泛分布于我国渤海、黄海地区，作为
一种海洋中药已有悠久的药用历史，味咸、性平，具
有平肝镇惊、制酸和胃、清热解毒等功效 [1]。罗氏海
盘车在高压、低营养、低温、缺光照、高盐的特殊环境
下生长，体内形成了多种特殊的代谢产物。近年来，
国内外学者对海盘车科多种海盘车体内的化学成分
研究做了大量工作，研究表明，海盘车中含有多肽、
蛋白、多糖、皂苷、嘧啶、氨基酸、生物碱、核苷等多种
有机化合物，并发现它们具有溶血、催吐、抗肿瘤、抗
休克、抗胃溃疡、壮阳等作用[1~7]。目前，关于海盘车的
文献报道主要集中在采用传统方法对海盘车中化学
成分的分离鉴定及药理活性试验研究上 [5~7]，而应用
液相色谱-质谱联用技术进行海盘车中化合物快速
鉴别的研究尚未见报道。近年来，高效液相色谱-质
谱联用技术在天然药物复杂体系化学成分的快速分
析、鉴别中已显示出越来越重要的作用[8~9]。利用 LC-
MS 技术不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的分离纯化
工作，而且能分离鉴定以往难于辨识的痕量活性物
质，从而迅速、方便地为天然产物中活性成分研究提收稿日期：2008-11-04
修回日期：2009-01-06
＊ 我国近海海洋综合调查与评价“908”专项（908-02-05-04）：海洋药用生物资源评价和《中华海洋本草》编纂，负责人：王长云；海洋一所基本科
研业务专项（GY-022008T32）：海洋绿藻活性成分分析、鉴别，负责人：陈军辉。
＊＊ 联系人：陈军辉，博士，助理研究员，主要研究方向：中药现代化相关研究，E-mail: jhchen@fio.org.cn。
HPLC- ESI-MS鉴定罗氏海盘车中的
多种化合物及相关指纹图谱研究＊
□张道来 陈军辉＊＊ 王 虹 赵恒强 程红艳
（国家海洋局第一海洋研究所青岛市现代分析技术及中药标准化重点实验室 青岛 266061）
王小如
李国强 （中国海洋大学医药学院 青岛 266003）
摘 要：目的：建立高效液相色谱-电喷雾质谱（HPLC-ESI-MS）联用技术用于海洋中药罗氏海盘
车有效成分快速鉴定及其指纹图谱研究的方法。方法：对罗氏海盘车药材进行超声波提取，采用
HPLC-ESI-MS对罗氏海盘车粗提物中多种化合物进行分析，并在此基础上建立罗氏海盘车药材的
HPLC特征指纹图谱。结果：结合文献，应用 HPLC-ESI-MS鉴定出罗氏海盘车提取物中的 11种化合
物；在化合物鉴定的基础上，建立了罗氏海盘车药材的 HPLC指纹图谱，发现不同批次罗氏海盘车的
质量存在差异。结论：本方法可用于罗氏海盘车药材有效成分的快速鉴定及质量控制。
关键词：高效液相色谱-电喷雾质谱 罗氏海盘车 指纹图谱
（国家海洋局第一海洋研究所青岛市现代分析技术及中药标准化重点实验室 青岛 266061）
（厦门大学化学化工学院化学系现代分析科学教育部重点实验室 厦门 361005）
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世界科学技术—中医药现代化★专题讨论
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
供大量的化学信息。本文首次采用 HPLC-MS联用技
术对罗氏海盘车提取物中的化学成分进行快速分
析，根据 HPLC-MS 获得的质谱分析结果，并结合文
献，对罗氏海盘车中多种活性物质进行了鉴别。另
外，在此基础上，建立了罗氏海盘车药材的 HPLC 指
纹图谱。
一、实验部分
1. 试剂与仪器
（1）药材。
本文所采用的罗氏海盘车样品均采自青岛海域
或购于青岛市内商场，经中国海洋大学水产学院曾
晓起教授鉴定 10批样品均为罗氏海盘车，详细样品
信息（见表 1）。
（2）仪器。
1100 型高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司），配
有二极管阵列检测器（DAD），四元泵，柱温箱，自动
进样器等；XCT 6320型离子阱质谱仪，配有电喷雾离
子源（美国 Agilent 公司）；KQ-400KDE 型高功率数
控超声波仪（中国昆山市超声仪器有限公司）；Milli-
Q(18.2 MΩ) 超纯水处理系统（美国 Millipore 公司）；
Z383K 型离心机（德国 HERMLE 公司），THZ-8 恒温
水浴锅（中国浙江嘉兴电热仪器厂）。
（3）试剂。
甲醇、乙腈、乙酸、甲酸、磷酸等试剂均为色谱纯
（德国 Merck 公司），其它试剂均为国产分析纯；水为
自制 Milli-Q超纯水。
2. 供试品溶液的制备
在贮藏的样品中抽取罗氏海盘车干燥个体数
个，切片、粉碎、过 40 目筛，混合均匀，制备成干粉，
封装于样品瓶中，备用。准确称取 2.0g罗氏海盘车干
粉样品，置于 100mL具塞锥形瓶中，加入 20％甲醇水
溶液 50mL，超声提取 30min，静置、离心，取上清液，
过 0.45μm滤膜后作为供试品溶液。
3. HPLC-MS分析条件
（1）色谱条件
Agilent Zorbax Bonus -RP C18 色谱柱（4.6mm×
250mm，5μm）串联迪马 Diamonsil C18色谱柱（4.6mm×
150mm，5μm），流动相为 0.2 %冰乙酸水溶液（A），色
谱纯甲醇（B），进样量为 20uL，流速 0.8mL/min，室
温，检测波长 260nm，淋洗时间为 60min，梯度洗脱程
序 time:0-10-20-30-40-50-60min；B%:5%-5%-10%
-30%-40%-100%-100%。
（2）质谱条件。
正离子电离模式，毛细管电压 4500V，喷雾气压
310.27kPa，干燥气（N2）流速 12L/min，干燥气温度
350℃，破碎电压 100V，全扫描（Scan）质荷比（m/z）范
围为 50～1000。
二、结果与讨论
1. 样品溶液制备方法优化
结合文献 [10]，使用 6 种不同提取溶剂（水、甲醇、
乙醇及三者混合溶剂）制备罗氏海盘车提取物；所得
罗氏海盘车不同溶剂提取物溶液，按本文优化所得
色谱条件进样分析，根据提取物 LC-MS 分析结果，
发现罗氏海盘车甲醇水溶液作为提取溶剂时提取物
中目标成分最多。进一步对不同比例的甲醇水溶液
的提取效果进行比较，结果表明，以高浓度甲醇水溶
液为提取溶剂时，色谱峰分离效果差，出峰数量少且
各峰响应值较低，基线不平稳；而以 20%甲醇水溶液
作为罗氏海盘车指纹图谱样品提取溶剂时，所得到
的指纹图谱既有明显的指纹特征，又能反映罗氏海
盘车的多种活性成分，提取物中含有多种氨基酸及
核苷化合物，与文献[10]报道一致。本文同时比较了水
表 1 10批罗氏海盘车样品信息
No. 样品名 方式 时间 地点
1 罗氏海盘车 随渔船采集 2008.03.05 青岛胶南海域
2 罗氏海盘车 购买 2008.03.07 青岛中山路
3 罗氏海盘车 随渔船采集 2008.04.02 青岛近岸海域
4 罗氏海盘车 购买 2008.04.05 青岛栈桥商场
5 罗氏海盘车 随渔船采集 2008.04.16 青岛近岸海域
6 罗氏海盘车 购买 2008.05.07 青岛麦岛市场
7 罗氏海盘车 随渔船采集 2008.05.12 青岛近岸海域
8 罗氏海盘车 随渔船采集 2008.05.25 青岛近岸海域
9 罗氏海盘车 随渔船采集 2008.06.13 青岛近岸海域
10 罗氏海盘车 随渔船采集 2008.06.28 青岛近岸海域
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浴回流提取法（90℃，1h），超声波提取（0.5h）和冷浸
提取三种方法的提取效果，以各化合物的提取率为
指标，对三种提取方法进行了比较，结果表明，水浴
回流法提取效率稍高于冷浸法，但均不如超声波提
取法，且超声波提取法方便、快捷、便于操作、提取过
程重现性好，因而选用超声波提取法进行提取。
2. HPLC条件优化
根据文献报道 [1]，罗氏海盘车成分复杂含有丰富
的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、核苷、多羟基醇、皂苷等，
采用等度洗脱的方法很难将这些成分分离，因此采
用梯度洗脱方式进行分离。由于罗氏海盘车 20%甲
醇提取物中所含的活性成分极性较大，在 C18柱中的
保留作用很弱（需要采用纯水做流动相洗脱），故采
用 C18柱很难获得较为理想的分离效果；本研究比较
了多种 C8 和 C18色谱柱的分离效果，结果表明，使用
C18柱的分离效果优于 C8色谱柱，但部分化合物分离
效果仍不理想，于是选用两根不同性质的 C18色谱柱
（Zorbax Bonus-RP 和 Diamonsil色谱柱）串联进行分
离（无须采用纯水做流动相洗脱）。从得到的色谱图
（见图 1）可看出，应用双柱串联进行分离得到的色谱
图各峰分离度高，色谱峰分布均匀，峰型好看，谱图
信息量大，特征性强，具有较好的代表性，因此选择
两根不同的 C18色谱柱串联用于罗氏海盘车药材的
指纹图谱研究。通过对比甲醇和乙腈做流动相 B的
高效液相图谱，可知二者得到的图谱分离效果差别
不显著，因此在本实验中选择低毒，价格相对便宜的
甲醇做流动相。本实验还对不同浓度的冰醋酸和磷
酸对分离的影响进行了考察，实验结果表明，二者作
流动相 A时分离效果差别不大，为便于进行质谱测
定选用冰醋酸；采用 0.2% 的冰醋酸较 0.1% 的冰醋
酸水溶液作流动相 A，信号响应值高，最终确定采用
0.2% 冰醋酸水溶液做流动相 A。采用二极管阵列检
测器通过全波段扫描，考察了不同检测波长对指纹
图谱的影响，结果表明，在 260nm 条件下检测到的色
谱指纹图谱信息量大，特征性强，具有较好的代表
性，因此选择 260nm为罗氏海盘车药材 HPLC 指纹
图谱研究的检测波长，与文献报道相符[11]。
3. HPLC方法学考察
（1）精密度。
按色谱条件，对同一供试品溶液重复进样 6 次
测定，分别测得其中五个主峰的峰面积和保留时间，
分别计算其相对标准偏差（RSD）。五个主峰峰面积和
保留时间 RSD值在 0.86%~2.81%和 0.41%~1.06%范
围之内，表明仪器精密度良好。
（2）重复性。
精密称取同一样品五份，按样品处理方法制成
供试品溶液，按照色谱条件进样测定，测得五个主峰
的峰面积和保留时间，并计算其 RSD值，五个主峰峰
面积和保留时间的 RSD 值分别为在 2.62%~4.59%
和 0.73%~1.05%范围之内，表明该方法重复性良好。
（3）稳定性
将供试品溶液按照色谱条件，分别在 0、1、3、6、
12、24、48h进样测定，结果显示供试品溶液中罗氏海
盘车提取物溶液的峰面积和保留时间无明显变化，
五个主峰峰面积和保留时间的 RSD值分别在 2.63%
~4.68%和 0.79%~1.28% 范围内，说明供试品溶液在
48 h内化学性质稳定。
综上所述，本文所选样品前处理方法简便易操
作，具有良好的重现性、稳定性，能够高效地将罗氏
海盘车体内目标化合物提取出来。本文采用两根反
相 C18柱串联分离技术，克服了单根反相柱对罗氏海
盘车活性成分保留作用偏低的缺陷，成功实现了罗
氏海盘车提取物中多种化合物的快速高效分离；方
法学考察结果表明，本文所发展的 HPLC 方法精密
度、重复性、稳定性良好，能满足建立罗氏海盘车
HPLC指纹图谱的要求。
4. 罗氏海盘车中多种化合物的鉴定
称取罗氏海盘车样品，按样品处理方法将其制
备成供试品溶液，按色谱-质谱联用分析条件进样分
析，罗氏海盘车提取物的 HPLC-DAD色谱图及其对
应的 HPLC-ESI-MS 总离子流质谱图见图 1。由图 1
可以看出，采用优化过的分析条件，罗氏海盘车提取
液中的化合物得到较好的分离与检测；同时这些色
谱峰对应化合物的紫外光谱图都呈现纯净化合物特
有的紫外吸收。对色谱图中的主要组分进行质谱鉴
别，可得到各化合物的分子量信息，参考相关文献 [9，12]
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及中国科学院上海有机化学研究所中药与有效成分
数据库，结合 DAD光谱图对各化合物进行鉴别；可
鉴定出提取物中含有亮氨酸、异亮氨酸、
酪氨酸、胸腺嘧啶、肌苷、尿苷、色氨酸、次
黄嘌呤、别呤醇、苯丙氨酸及肌苷的异构
体 C10H12N4O5共 11 种化合物，相关信息
（见表 2）。
5. 罗氏海盘车指纹图谱分析
取 10 批不同的罗氏海盘车样品，按
样品处理方法将其制备成供试品溶液，按
色谱条件进样分析，记录色谱图，建立罗
氏海盘车样品的 HPLC 指纹图谱。10 批
罗氏海盘车样品的色谱图见图 2。对获得
的 10 批罗氏海盘车样品的色谱图进行色
谱图积分获得各色谱峰保留时间、峰面积
等信息，再根据色谱图基线噪声水平，将
信噪比小于 10 的色谱峰除去不作计算。
在本研究所建立的分析系统下，罗氏海盘
车提取物成分出峰时间均在 40min之前，
主要有 15个色谱峰，这 15个色谱峰即构
成罗氏海盘车指纹图谱的指纹特征，也是
鉴别真伪、评价罗氏海盘车质量的主要指
标。为了消除系统误差，本研究采用相对
保留时间和相对峰面积进行计算，计算结
果表明，各罗氏海盘车样品的谱图中各峰
出峰时间的相对标准偏差很小，峰面积相
差相对较大，说明各样品中的化学成分种
类差异不大，而各成分的含量有一定差
别。
指纹图谱是样品的整体化学特征的
外在反映，但是仅依靠对指纹图谱峰的多
少和峰的大小进行直观比较，容易造成主
观偏差，难以获得客观的评价结果。相似
度分析可以定量的描述比较指纹图谱，可
以客观的对样品进行评价[13]。本文采用国
家药典委员会推荐使用，由浙江大学制药
工程研究所计算机辅助中药分析实验室
研发的“中药指纹图谱相似度计算软件”，
对 10 批不同供试样品指纹图谱的相似性进行计算，
结果见表 3。从表 2 可以看出 10 批罗氏海盘车中 2
图 1 罗氏海盘车提取物的质谱总离子流图（1）和液相色谱图（2）
80
60
40
20
0
m
Au
2
1
2
3
4
5 6
7
8
9
10 11
12 13
14 15
10 20 30 40
Time（min）e
3×107
2×107
1×107
ab
un
da
nc
e
1 2
3
4 5 6 7 8
9
10 11
12 13 14
15
1
10 20 30 40
Time（min）
表 2 罗氏海盘车中 15种化合物色谱峰的 HPLC-ESI-MS分析
色谱峰
保留时间
(min) 分子量 分子式 化合物名称 参考文献
1 8.28 131 C6H13NO2
亮氨酸或
异亮氨酸
中药与有效成分数据库
2 8.82 131 C6H13NO2
亮氨酸或
异亮氨酸
中药与有效成分数据库
3 11.04 181 C9H11NO3 酪氨酸 中药与有效成分数据库
4 12.82 136 C5H4N4O
次黄嘌呤
或别呤醇
12
5 13.54 244 C9H12N2O6 尿苷 12
6 15.44 153 - 未知 -
7 17.32 126 C5H6N2O2 胸腺嘧啶 9
8 18.61 - - - -
9 19.63 165 C9H11NO2 苯丙氨酸 9
10 22.76 268 C10H12N4O5
C10H12N4O5
或肌苷
9
11 24.60 283 - 未知 -
12 25.63 136 C5H4N4O
次黄嘌呤
或别呤醇
12
13 27.49 268 C10H12N4O5
C10H12N4O5
或肌苷
9
14 29.29 - - - -
15 32.05 204 C11H12N2O2 色氨酸 中药与有效成分数据库
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Identification of active components in Asterias rollestoni Bell. by HPLC- ESI-MS and
Study on Their HPLC Fingerprint
Zhang Daolai, Chen Junhui, Wang Hong, Zhao Hengqiang, Cheng Hongyan
（QingDao Key Lab on Analytical Technology Development and Standardization of Chinese Medicines, First Institute
Oceanography of SOA, Qingdao, 266061）
Wang Xiaoru
号、4号及 6号样品相似度值较低，均低于 0.80，其它
7批样品的相似度值在 0.90 以上，可以看出不同批
次的罗氏海盘车样品的质量参差不齐。综合样品的
相似度值及特征峰的峰面积等相关信息，对照表 1
样品信息可以发现，在市场上随机购买的 3 个罗氏
海盘车干品与作者随渔船在青岛沿海采集的样品质
量差别较大，估计可能是样品在加工或保存过程不
同造成的。由此可见，根据不同批次罗氏海盘车药材
的指纹图谱特征，结合相似度分析，可以区分质量有
差异的罗氏海盘车样品，对罗氏海盘车药材质量评
价有重要意义。
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100
80
60
40
20
0
10 20 30 40
Time（min）
m
Au
图 2 10批罗氏海盘车样品 HPLC指纹图谱
表 3 相似度计算结果
No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Similarity 0.94 0.67 0.94 0.76 0.93 0.65 0.96 0.92 0.99 0.98
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Flash evaporation-gas chromatography-mass spectrometry for the analysis of volatile compounds in
Ligusticum chuanxiong Hort.
Zhang Cong，Qi Meiling，Fu Ruonong
（Department of Chemistry, School of Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081）
This paper describes a novel flash evaporation-gas chromatography-mass spectrometry (FE-GC-MS) for the
analysis of volatile compounds in Ligusticum chuanxiong Hort. The results show that the optimum flash evaporation
can be achieved by using ~4mg of the ground sample at 250℃ for 10s. In comparison with traditional steam distilla－
tion, the present FE-GC-MS method is rapid and only needs a few milligrams of the ground sample and a few sec－
onds of flash evaporation time. It is an effective and feasible method for the quality control of traditional Chinese
medicines (TCMs).
Keywords: FE-GC-MS; volatile compounds; traditional Chinese medicines
（责任编辑：张志华）
（QingDao Key Lab on Analytical Technology Development and Standardization of Chinese Medicines, First Institute
Oceanography of SOA, Qingdao, 266061）
（Department of Chemistry and the Key Laboratory of Analytical Science of the MOE, College of Chemistry and
Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China）
Li Guoqiang
（School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266063, China）
Objective: A new method based on high performance liquid chromatography - electrospray ionization mass
spectrometry (HPLC-ESI-MS) was developed for the rapid identification of active compounds in Asterias rollestoni
Bell and development of its fingerprints. Method: Samples were extracted by ultrasonic -assist extraction, and the
extraction conditions were optimized. The developed HPLC -ESI -MS method was used to identification of the
components in Asterias rollestoni Bell extract, and a chromatographic fingerprint based on HPLC analysis was
established. Result: Eleven compounds in Asterias rollestoni Bell extract could be primary identified by ESI -MS
on-line detection combined with literature review. The result of similarity evaluation for fingerprint indicated that
the quality of different Asterias rollestoni Bell samples were not entirely consistent. Conclusion: This method has the
advantages of simple operation, rapid measurement and it is a powerful tool for identification of active components
in Asterias rollestoni Bell and its quality control.
Keywords: HPLC-ESI-MS, Asterias rollestoni Bell, Fingerprint.
（责任编辑：张志华）
（Continued from Page 167）
178