全 文 ：20 11 年 2 月第 2 期 中国民族 医药杂志 6 5
A B 一 8大孔树脂并聚酞胺柱层析纯化瘤果黑种草子总黄酮△
耿东升 , 张淑粥
( 1
. 新疆军 区联勤部药品仪 器检验所 , 新疆 鸟鲁木齐 83 X( 巧3 ; 2 . 新疆 医科大学药学院 , 新疆 乌鲁木齐 83 X() 5 4 )
摘 要 : 目的 :研究 BA 一 8 大孔树脂并聚酞胺柱层析纯化瘤果黑种草子 总黄酮工 艺。 方法 : 用紫外分光光度法 测定瘤果黑
种草子总黄酮含量 , 以 总黄酮洗脱量为指标 , 筛选 BA 一 8 大孔树脂纯化工艺 。 结果 : 合适的上样条件 : pH 值为 3 ,上样液浓
度为 4 . 90 m g’ mL 一 ’ ,吸附流速为 I Bw h ,洗脱剂为 30 % 乙醇 。 结论 : A B 一 8 大孔树脂并聚酞胺树脂适合于瘤果黑种草子总黄
酮的分离纯化 。
关键词 : 瘤果黑种草 ;总黄酮 ; BA 一 8 大孔树脂 ;纯化
中图分类号 :咫 9 文献标识码 : A 文章编号 : 1(X巧 一 68 10( 20 川m - (兀巧5 一 03
黑种草属毛莫科黑种草属植物 ,有 3 种药用植物 ,分别 ( 3 4 )正交试验筛选 ,确定提取工艺如下 :称取瘤果黑种草子
是瘤果黑种草 (刀妙从 z G阮dn 以诉m rF 匀九 , N G ) 、 果黑种草 20 9 , 以 12 倍量 40 % 乙醇 , 回流提取 3 次 ,每次 1 . hs ,合并
(崛以必叙二 , NS )和黑种草 (从沙之么 刀田腮 ce an , ND )。 瘤果 提取液 ,浓缩至无醇味 ,备用 。
黑种草子为毛莫科植物瘤果黑种草的干燥成熟种子 川 。 除 2 . 2 总黄酮含量测定
了含有挥发油和脂肪酸外 ,还含有黄酮类 、 皂昔类 、 生物碱 2 . 2 . 1 测定波长的选择 :精密吸取芦丁对照 品溶液及供试
类等化学成分 ;具有抗菌 、 抗感染 、抗肿瘤 、 抗氧化活力 、 免 品溶液适量 ,置于 10毗容量瓶 中 , 加 1% 拟姚 4mL , 加乙醇
疫保护等多种药理活性图 。 大孔树脂是近年来国内外新发 至刻度 , 摇匀 , 放置 1漏n , 以 相应试剂做空 白 , 在 2o -
展的分离技术 ,并在天然药物精制中广泛应用 , 是提取分离 70 lun 波长范围内进行扫描 ,最大吸收波长为 27 l lun 。
中草药有效成分的一种有效方法 。 目前 ,国内外对瘤果黑 2 . 2 . 2 标准曲线的制备 :精密吸取浓度为 0 . 42 gm · mL 一 `芦
种草子的黄酮类成分纯化研究未见报道 ,本文应用 BA 一 8 丁对照品溶液 O , 0刀 . 1 、 0 . 2 、 0 . 3 、 0 . 4 、 0 . 5 、 O . 6mL 置 10mL 容
大孔树脂并聚酞胺柱层析 , 探索瘤果黑种草子总黄酮纯化 量瓶中 , 加 1% 从姚 溶液 4d , 加 乙醇至刻度 , 摇匀 , 放置
的最佳工艺 。 or 而 n , 以相应试剂做空白 ,按紫外分光光度法 (中国药典
1 仪器 、 试剂与材料 2X() 5年版一部附录 V A ) ,在 27 1nm 测定吸光度 。 以对照 品
1
、
1 仪器 : A 一 120 5 电子天平 : 西德塞多利斯公司 ; vu 一 溶液的浓度与吸光 度进 行直线 回 归 , 得 回归方 程 : Y =
245 0
: 日本岛津公司 ; w 一 20l B 数显恒温水浴锅 : 江苏金坛 0 . 03 48 x + 0 .姗5 , r = 0 . 9 5 , 芦丁在 4 . 2 一 25 . 2略 · mL 一 ’ 范
市医疗仪器厂 ; KD M 型调温电热套 ;甄城华鲁电热仪器有 围内呈良好线性关系 。
限公司 ; H G 101 一 ZAE 电热鼓风干燥箱 :南京红龙设备厂 。 2 . 2 . 3 精密度实验 :精密吸取提取液 6 份 , 稀释后按 “ 标准
1
.
2 材料 :瘤果黑种草子 :购自新疆和 田墨玉县 , 经新疆中 曲线 ” 项下显色后 , 测定吸光度』 S D 二 1 .的 % 。
药民族药研究所研究员李晓瑾鉴定为 从沙Z如 倪田诚砚J毋ar 2 . 2 . 4 稳定性试验 :精密吸取提取液 6 份 ,稀释后按 “ 标准
乃芍叽 的种子 ; 芦丁对照品 : 中国药品生物制品检定所 , 批 曲线 ” 项下眯色 ,每间隔 巧而 n 测定吸光度 ;在 60 而 n 之内样
号 : 0 80 一盯05 ; A B 一 8 树脂 : 天津市光复精细化工研究所 , 品的吸光度较稳定 ( RS D 二 1 . 59 % ) 。
批号 : 07 的 19 ;聚酞胺树脂 :沙漠省台州市路桥 四甲生物塑 2 . 2 . 5 重复性实验 : 精密吸取提取液 6 份 , 稀释后按 “ 标准
料厂 , 批号 :能m 293 ;其余试剂均为分析纯 。 曲线 ” 项下显色 ,测定吸光度月班D = 1 . 47 % , 本实验的重现
2 方法与结果 性良好 。
2
.
1 瘤果黑种草子提取液的制备 : 醇提工艺经单因素 、 肠 2 . 2 . 6 加样 回收率 : 精密称取已 知含量样 品 (巧 . Zmg ·— g 一 , ) ,分别加人 .0 50 34 gm ·毗 一 ’ 芦丁对照品 2 . 7 、 5 . 0 、 6 . 4mL△ 基金项 目 : 国家自然科学基金项 目(3 的60 5 12) 按含量测定方法测定 。作者简介 : 耿东升 ( 19 59 一 ) , 男 , 新疆乌鲁木齐人 , 硕士 , 主任药 2 . 3 妞 一 8 树脂纯化瘤果黑种草子总黄酮的工艺参数考师 ,硕士 生 导 师 , 研 究方向 : 新药研发与 中药药 理 , elT : ( 09 1) 察 :树脂的预处理川 。 BA 一 8 树脂先用 95 % 乙 醇浸泡 24 h49 8仅犯5 , F , : (柳劝497 529 , E 一 n画 1: don 咖二邓1 @ isn a . 。 onI 充分溶胀 ,然后用乙醇洗至流出液与水混合 ( 1 : 5 )不 呈 白色
DOI : 10. 16041 /j . cnki . cn15 -1175. 2011. 02. 028
6 6 中图 民族 医药杂志 0 11 2年 2月第 2期
浑浊为止 ;然后 以大量蒸馏水洗尽乙醇 。 然后酸碱处理 ,其
方法是在层析柱内加人高于树脂层 10C m 的 3 % 一 5% 盐酸
溶液浸泡 2 一 4 h , 然后进行冲洗。 再用 3 一 4 倍树脂床体积
(VB )同浓度的盐酸溶液洗脱 , 然后用蒸馏水洗至按近中
性 ;再用 3 % 一 5 % 的 Na ( ) H 溶液浸泡 h4 。 最后冲洗 , 用同浓
度的 3 一 4 倍树脂体积的氢氧化钠溶液通柱 ,最后用蒸馏水
清洗至 声值为中性 ,备用 。
表 1 加样回收率实验结果
样品芦丁 芦丁加人 实测得 回收率 平均 回收率 RS D
含量 (叱 ) 量 (吨 ) ( m g ) (% ) ( % ) ( % )
2
.
2 89 1
.
3 59 3
.
6 8 8 9 5
.
9
洗脱液 , 测定吸光度 ,结果如图 3 所示 , 上术液 声 为 3 总黄
酮洗脱量最多 。
亡J.ó`尸a八甘O
牛甘,。qé,2
,二nQJ咭J,八乙
ǎ的召)伽趁枉钧
2 3
吸附流速 ( By h/ )
图 2 吸附流速考察结果
2
.
289 1
.
35 9 3
.
, 29 9 8
.
9
四盯2
.
2 8 9 2
.
5 17 4
.
(尧场 103 . 7 1X() . 6 2 . 8
2 2 8 9 2
.
5 17 4
.
95 2 1泥 . 0
2
.
2 89 3
.刀 2 5 . 62 8 1的 . 7 ::
2
.
28 9 3 22 2 5
.
6 84 1能 . 4
2
.
3
.
1 上样液浓度的确定 :将黑种草子浓度分别为 4 .卯 m g
·
inL
一 `
(l o
l n L )
、
2
.
45 gm
·
mL
一 `
( 20切工 ) 、 1 . 63 gm
·毗一 ` ( 30 mL ) 、
0
.
98 gm
·
mL
一 ’
( 50n 正 )上样液 ,通过 BA 一 8 大孔树脂的层析
柱 (似 . 5 x 3H c5 m )进行动态吸附 , 先用蒸馏水洗至无色 , 后
用 30 % 乙醇洗脱 , 收集洗脱液 , 测定吸光度结果如图 1 所
示 ,上样液浓度为 4 . 卯m g . mL 一 ’ 总黄酮洗脱量最多 。
2 l
l g
(:à举泛教镇
l 7
l 5
p ,益
图 3 州值考察结果
2
.
3
.
4 洗脱剂浓度考察 :将浓度为 4 .如 mg’ mL 一 ’ 黑种草子
上样液 , 通过 BA 一 8 大孔树脂的层析柱 (句 . s x F日5。 )进
行动态吸附 , 先用蒸馏水洗 至无色 , 分别用 30 % 、 50 % 、
70 %
、卯% 乙醇洗脱 ,收集洗脱液 ,挥干溶济 ,测定总黄酮含
量 ,结果如图 4 所示 ,洗脱剂为 30 % 醇总黄酮洗脱量最多 。
成Un.八,甘0ǎ门r月b哎Ud`IM勺`,二
公理伽泥权礴
ǎ旨à 、如心叙均
6
` - ~ 一` 一一 - - ~ 一` ~ 一一一 一一一- — 一0 . 98 0 . 6 3 2 . 4 5 4 . 9浓度 ( m g / m l )
图 1 上样液浓度考察结果
2
.
3
.
2 吸附流速的考察 : 将浓度为 4 . 90 mg ·呱 一 1黑种
草子上样 液 , 通过 BA 一 8 大孔 树脂 的层 析柱 (们 . 5 二
3H 5 cm )进行动态吸附 ,流速分别为 1、 2 、 3 、 4( BV · h 一 1)
进行吸附 。 先用蒸馏水洗至无色 , 后用 so % 乙醇洗脱 ,收
集洗脱液 , 测定吸光度 ,结果如图 2 所示 ,吸附流速为 BI .V
h
一 `总黄酮洗脱量最多 。
2
.
3
.
3 上样液 PH 值考察 : 将浓度为 4 . 卯m g . mL 一 `黑种草
子上样液分别用 lmol
·
L
一 ’ N aOH
、
H CI 调节上样液 p 7H 、 6 、 5 、
4
、
3
,上样先用蒸馏水洗至无色 ,后用 30 % 乙醇洗脱 , 收集
50 7 0
醉浓度 (% )
图 4 洗脱剂考察结果
2
.
3
.
5 降酞胺树脂纯化 : 聚酞胺纯化参数参考文献 〔` 一 6 〕 ,
并且经过 BA 一 8 大孔树脂 、 聚酞胺纯化后 , 总黄酮纯度达
到 62 . 2% ,达到药效试验要求 , 因此未对聚酞胺纯化参数
进行筛选 。
30 % 乙醇 BA 一 8 大孔树脂洗脱液 ,挥干溶剂 ,得棕黄色
粉末 0 . 巧09 9 ,用 or mL 水溶解 , 上聚酞胺柱 , 先用水洗脱 ,用
201 1 年 2月第 2期 中闯民族 医药杂志 6 7
4 BV o s%乙醇以 ZB V .h 一 ’洗脱 , 收集洗脱液 ,挥干溶剂 , 得精
制总黄酮 ,纯度为 62 % 。
2
.
3
.
6 瘤果黑种草子中总黄酮保留率的考察图 : 将浓度
4
.
g gm
·
mL
一 ’ 、 p H 值 4 . 0 样品溶液 , 以 BI v · h 一 ’ 的速率吸附 ,
吸附后先以 S B V 水洗去杂质 , 再用 4BV 的 30 % 乙醇以 Z BV
·
h
一 ’洗脱 , 收集洗脱液 ,测定总黄酮含量 。 结果瘤果黑种草
子经树脂纯化后 , so % 醇洗脱部黄酮的量是纯化前总固物
的 13 . 32 % , 纯化后样品中总黄酮 占总固物的 62 . 2 % ,保留
率为 52 . 08 % ,说明采用优选出的工艺纯化 , 可 以减少总固
物的得率 , 提高总黄听在总固物中的含量 。
3 讨 论
3
.
1 瘤果黑种草子经 AB 一 8 大孔树脂 、 聚酞胺树脂纯化 ,
总黄酮总在总固物中的含量由 6 % 提高到 62 % ,此纯化工
艺可为中试生产提供依据 。
3
.
2 总黄酮含量测定 , 通常以芦丁为对照品 , 以亚硝酸钠
一 硝酸铝 一 氢氧化钠显色后 , 在 sl onm 测定含量 ;瘤果黑种
草子总黄酮含量测定时 , 以此种显色方式显色后 ,在 sl o unr
没有出现最大吸收 ,考虑使用三氯化铝为显 色剂 , 27 l lun 测
定吸收度 , 对照 品 与样品经 过扫描 , 图谱 峰形相 似 , 在
27 1unr 有最大吸收 ,采用此显色方式测定黑种草子中总黄
酮的含量 ;方法稳定性考察 : 样品 60 nu n 后吸光度有所下
降 ,样品的测定通常在 20m in 内能够结束 。
3
.
3 上样液浓度考察 : 若上样液较稀 ,则上样液戮度较小 ,
在一定上样流速下溶液通过树脂柱的速度大于传质速度 ,
引起泄漏 ;若上样液太浓 , 则勃度过大 , 上样液在树脂内部
传质速度变慢 , 树脂周围总黄酮分子过多 ,使得未被吸附就
流出来了 ,这两种情况都不能使总黄酮达到充分吸附的目的。
3
.
4 上样液 州值考察 : 随着 pH 值有升高 , 总黄酮的量在
下降 ,总黄酮类的酚经基与树脂以氢键的形式结合 , 随着碱
性增强 ,酚经基上的氢解离成酸根离子 ,与树脂结合能力下
降 ,上样液的声 值的 3 较适宜 。
参考文献
〔1〕新疆植物志编辑委员会 . 新疆植物志 〔M 〕 . 第 2 卷 . 第 1
分册 . 乌普木齐 :新疆科技卫生 出版社 , 19 3 . 2 31 .
〔2 〕信学雷 ,薛慧清 . 黑种草属植物研究进展〔J〕 . 时珍 国医
国药 , 2X() 8 , 19 ( 6 ) : 15 14 .
〔3〕魏红 . 四种 中药总黄酮 提取 纯化 、 杭氧化及抑菌研究
〔D〕. 天津师范大学 , 2X() 8 .
〔4 〕张纬 ,葛志强 ,蒋建兰 . 聚酞胺树脂分 离纯化复方 山检提
取物中总黄酮的研究〔J〕 . 中草药 , 2 X( 拍 , 40 ( 1 ) : 63 一 6 .
〔5 〕田燕 . 黄酮类化合物在聚鱿胺树枝上的层析行为 〔J〕 . 大
连医科大学学报 , 2印 2 , 24 ( 2 ) : 147 一 148 .
〔6〕何星存 ,邹月娥 ,伍正清 ,等 . 聚鱿胺树脂吸附机理的研
究〔J〕. 广西师范大学学报 , 自然科学版 , 19 7 , 15 ( 3 ) : 58
一 6 1
.
〔7 )刘韶 ,谭阳阳 ,徐平声 ,等 . 大孔吸附树脂法纯化 巴 西甘
薯叶中的总酚酸〔J〕. 中国医院 药学杂志 , 2X( 刃 , 29 ( 15) :
巧 34 一 15 36 .
20 10 年 11 月 30 日收稿
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