全 文 ：浙江中西医结合杂志 2015年第 25卷第 3期 Zhejiang JITCWM（Vol.25 No.3 2015）
·论 著·
摘 要 目的 观察黄根醇提取物体外对白色念珠菌生物膜及相关基因的影响。方法 M27-A2
测定黄根醇提取物对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）；XTT法评价黄根醇提取物对白色念珠菌
生物膜形成的影响；实时荧光定量 RT-PCR（qRT-PCR）检测黄根醇提取物作用后，ALS基因的表达
情况。结果 黄根醇提取物对白色念珠菌的 MIC为 8μg/mL；随着浓度的增加，黄根醇提取物对白
色念珠菌生物膜的抑制作用增强，呈正相关性；16μg/mL黄根醇提取物对不同生长阶段的白色念珠
菌生物膜均有抑制作用，抑制率随生物膜成熟逐渐降低；qRT-PCR结果显示，药物作用后 ALS2、
ALS3基因表达降低（7.87±0.27比 5.15±0.34；6.24±0.51比 2.13±0.23，P<0.05），ALS1基因表达无明
显变化（6.11±0.14比 5.95±0.31，P>0.05）。结论 黄根醇提取物对体外白色念珠菌生物膜有较明显
的抑制作用，可能通过抑制 ALS2、ALS3基因的表达而实现。
关键词 白色念珠菌；黄根醇提取物；RT-PCR
Alcohol Extract from Prismatomeris Tetrandra against Candida Albicans Biofilms in Vitro TAN Panli1, XU
Wen2, CAO Yi1. 1 The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou (310006), Chi－
na; 2 Xiaohe Hushu Community Health Service Center of Gongshu District, Hangzhou (310011), China
ABSTRACT Objective To study the effect of alcohol extract from Prismatomeris tetrandra on candida albicans（C.
albicans） biofilms and the expression of related genes in vitro. Methods M27-A2 was used to determine the min－
imum inhibitory concentration（MIC） of alcohol extract from Prismatomeris tetrandra against C. albicans. XTT assay
was performed to determine the effects of alcohol extract from Prismatomeris tetrandraon C.albicans biofilm forma－
tion. The real-time fluorescent quantitative RT-PCR（qRT-PCR） was used to determine the difference of ALS gene
expression between before and after alcohol extract from Prismatomeris tetrandra induction group. Results MIC of
alcohol extract from Prismatomeris tetrandra against C. albicans was 8μg/mL. With increasing concentration, the in－
hibitory effect of alcohol extract from Prismatomeris tetrandra on C. albicans biofilms enhanced. Alcohol extract
from Prismatomeris tetrandra at concentration of 16μg/mL showed distinct inhibitive effect on adhesion to C.albicans
cultured for 4h, 8h, 12h, 24h and 48h, and the effect weakened as the time of culture increased. qRT-PCR re－
sults showed that alcohol extract from Prismatomeris tetrandra resulted in a striking down-regulation of ALS2 and
ALS3（ALS2：7.87±0.27 vs 5.15±0.34; ALS：6.24±0.51 vs 2.13±0.23; all P<0.05）, while the expression of ALS1
showed no changes（6.11±0.14 vs 5.95±0.31, P>0.05）. Conclusion Alcohol extract from Prismatomeris tetrandra
has potent activity against C.albicans biofilms in vitro. The inhibition of alcohol extract from Prismatomeris tetrandra
on biofilms formation may depend on suppressing the expression of ALS2 and ALS3.
KEY WORDS Candida albicans; alcohol extract from Prismatomeris tetrandra; RT-PCR
黄根醇提取物体外抗白色念珠菌生物膜作用的实验研究
谈潘莉 1 徐 雯 2 曹 毅 1
随着广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂等
的广泛应用，免疫受损人群不断增加，条件致病真菌
中念珠菌的感染率日渐升高 [ 1 -2]，其中白色念珠
菌（candida albicans）是临床最常见的致病真菌，在机
体免疫功能低下时，可引起黏膜和全身性的感染[3]。
白色念珠菌对传统抗菌药物产生耐药性是治疗此类
感染的难点。研究显示，真菌的耐药性与生物膜有着
密切关联[4]。寻找抗真菌生物膜的药物是防治真菌病
基金项目：国家自然科学基金（No.81173271）
作者单位：1浙江中医药大学附属第一医院检验科（谈潘莉）、皮肤科
（曹毅）（杭州 310006）；2杭州市拱墅区小河湖墅街道社区
卫生服务中心（杭州 310011）
通信作者：曹毅，Tel：13588887388；E-mail：caoyi1965@163.com
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浙江中西医结合杂志 2015年第 25卷第 3期 Zhejiang JITCWM（Vol.25 No.3 2015）
的关键。黄根为茜草科植物三角瓣花（prismato-
meriste-trandra）的根，性微苦，味凉，具有软坚散结、
凉血止血、祛瘀生新、强壮筋骨和利湿退黄等功效[5]。
广西民间多用以治疗慢性肝炎，有文献报道用乙醇
回流提取的黄根制剂还具有抗菌作用[6]。本研究就黄
根醇提取物对白色念珠菌生物膜形成及相关基因表
达的影响进行初步研究，以期为白色念珠菌生物膜
的预防和治疗提供新的思路。
1 实验材料
1.1 菌 株 ATCC10231 购自中国科学院微生物
研究所。
1.2 药物及试剂 黄根醇提取物的制备：将黄根粉
碎成粗粉，用乙醇加热回流提取两次，合并提取液，
滤过，浓缩至无醇味，于 4°C冰箱保存备用；XTT粉
末：Sigma公司；维生素 K3：Alexis公司；丙酮：蚌埠化
学试剂厂；RPMI-1640 培养基、YPD 培养基依据文
献配制[7]。
2 实验方法
2.1 最小抑菌浓度 黄根醇提取物对白色念珠菌最
小抑菌浓度（minimal inhibitory concentrations，MIC）
值测定采用国际上通用的微量稀释法，即美国临床
实验室标准化研究所（CLSI）M27-A2[8]。
2.2 白色念珠菌生物膜制备 将白色念珠菌接种于
YPD培养基中，35°C摇床过夜培养，收集菌体，用
RPMI-1640培养基稀释，调整菌液浓度为 1×106菌
落形成单位/毫升（CFU/mL）。将 100μL 该浓度菌液
接种于 96孔细胞培养板中，37°C培养 2h后弃去培
养基，用 pH7.4、0.01mol/L 磷酸缓冲盐水（PBS）洗 3
次，加入 100μL RPMI-1640培养基，作为培养的 0
点，37°C继续培养，每 24h更换 1次培养基。
2.3 不同浓度黄根醇提取物对白色念珠菌生物膜影
响 在生物膜培养的 0点，加入倍比稀释的黄根醇
提取物溶液（终浓度分别为 2～64μg/mL），空白对照
孔加入培养基，37°C继续培养 48h后，弃去培养基，
PBS洗涤 3次，用 XTT减低法测定不同浓度黄根醇
提取物对白色念珠菌生物膜的抑制作用：XTT 用
0.5g/L林格液稀释及 0.22μm孔径的滤器过滤除菌，
分装后存放于-70°C冰箱备用。临用前，加入维生素
K3（menadione，用丙酮稀释至终浓度 10mmol/L）。取
XTT-menadione溶液 100μL加到已形成生物膜的培
养孔中（menadione在 XTT中的终浓度为 1μmol/L）。
37°C避光孵育 2h后，在酶标仪波长 490nm处检测
各孔光密度（optical density，OD）值，每组设 3 个复
孔，实验重复 3次。
2.4 黄根醇提取物对不同生长阶段白色念珠菌生物
膜的影响 将 100μL菌液接种于 96孔细胞培养板
中，分别在生物膜培养的 0、4、8、12、24和 48h时弃
去培养基，加入黄根醇提取物，使其终浓度为 16μg/
mL，空白对照组仅加入培养基，37°C继续培养 24h。
XTT法测量各孔在 490nm处的 OD值。每组设 3个
复孔，实验重复 3次。
2.5 黄根醇提取物对白色念珠菌生物膜相关基因影
响
2.5.1 样品制备 将白色念珠菌接种于 YPD 培养
基中，35°C摇床过夜培养，收集菌体，用 RPMI-1640
培养基稀释，调整菌液浓度为 1×106CFU/mL，将
80mL 菌液加入细胞培养皿中，37° C 静置黏附
90min，弃上清液，用灭菌 PBS缓冲液洗 3次，向细胞
培养皿中加入黄根醇提取物，使得其终浓度为 16μg/
mL，37°C继续静置培养 1h，弃上清液，用灭菌 PBS
缓冲液洗 3次，用生物被膜刮刀刮取细胞培养皿底
部细胞，收集离心，用 DEPC水洗 1次，离心并弃上
清备用。
2.5.2 RNA提取 取沉淀用 Novelase消化液悬浮，
室温消化 10min后，参照 Trizol试剂（Invitrogen）说明
书介绍的步骤提取总 RNA，紫外分光光度法测定其
RNA浓度[9]。
2.5.3 实时荧光定量 RT-PCR（qRT-PCR）引物 根
据文献报道 [10]的 ALS1、ALS2、ALS3 基因序列，采用
Primer Premier 5.0软件设计检测白色念珠菌 ALS1-
mRNA、ALS2-mRNA、ALS3-mRNA 和 18S-RNA 的
qRT-PCR引物（表 1），各引物由上海 Invitrogen公司
合成。
2.5.4 qRT-PCR 定量分析 以 1μg 总 RNA 为模
板，采用逆转录试剂盒（TaKaRa）、SYBR Premix Ex.
TaqTM荧光定量 PCR试剂盒（TaKaRa）、上述引物及
ABI-7500型实时荧光定量 PCR仪检测 ALS1-mR－
目的基因引物序列（5-3）
ALS1 F-GACTAGTGAACCAACAAATACCAGA
ALS1 R-CCAGAAGAAACAGCAGGTGA
ALS2 F-CCAAGTATTAACAAAGTTTCAATCACTTAT
ALS2 R-TCTCAATCTTAAATTGAACGGCTTAC
ALS3 F-CCACTTCACAATCCCCATC
ALS3 R-CAGCAGTAGTAGTAACAGTAGTAGTTTCATC
18S RNA-F TCTTTCTTGATTTTGTGGGTGG
18S RNA-R TCGATAGTCCCTCTAAGAAGTG
表 1 qRT-PCR扩增引物序列
扩增长度
318bp
366bp
342bp
348bp
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浙江中西医结合杂志 2015年第 25卷第 3期 Zhejiang JITCWM（Vol.25 No.3 2015）
NA、ALS2-mRNA、ALS3-mRNA，反应参数：95℃30s；
95℃5s、60℃30s，40个循环。每个基因测 3个复管，每
次实验重复 3次。实验中以 18S-RNA为内参照，采
用 ΔΔCt模型及 REST2005软件对 qRT-PCR数据进
行定量分析[11]。
2.6 统计学方法 应用 SPSS19.0软件进行统计分
析，计量资料均用（x±s）表示，采用 t检验，方差分析，
以 P<0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果
3.1 黄根醇提取物最小抑菌浓度 黄根醇提取物对
白色念珠菌最小抑菌浓度（MIC）为 8μg/mL。
3.2 不同浓度黄根醇提取物对白色念珠菌生物膜形
成的影响 黄根醇提取物对白色念珠菌生物膜的形
成具有抑制作用，呈浓度相关性，抑制率随着黄根醇
提取物浓度增高而增高，各浓度组间差异有统计学
意义（P<0.05），见表 2。
3.3 黄根醇提取物对不同生长阶段白色念珠菌生物
膜的影响 16μg/mL黄根醇提取物对不同生长阶段
的白色念珠菌生物膜均有抑制作用，且呈时间相关
性，抑制率随生物膜成熟逐渐降低，各生长阶段组间
有显著性差异（P<0.05），见表 3。
3.4 黄根醇提取物对白色念珠菌生物膜相关基因影
响 16μg/mL 黄根醇提取物作用后，ALS2、ALS3 基
因表达水平明显低于药物作用前，差异有统计学意
义（P<0.05）。ALS1 基因表达水平无明显变化（P>
0.05），见表 4。
4 讨 论
白色念珠菌（candida albicans）是人类最常见的
条件致病菌，可导致深部感染危及生命。该菌容易在
各种生物材料表面形成生物被膜。有文献报道，白色
念珠菌形成生物被膜后对临床常用抗白色念珠菌药
物如氟康唑、两性霉素 B等的敏感性下降几十倍、几
百倍[12-13]。生物膜内的念珠菌比浮游菌更加耐药、难
治、所致感染易复发[14]。寻求抗生物膜的药物显得至
关重要。
Chandra 等 [15]发现白色念珠菌生物膜的形成分
为 3个阶段：早期（0-11h），中期（12-30h）和成熟期
（38-72h）。早期的黏附尤为重要，随着培养时间的延
长，生物膜逐渐发育成熟，故抑制黏附是抗白色念珠
菌生物膜感染的关键措施。本研究选取具有较强生
物膜形成功能的白色念珠菌标准株 ATCC10231 为
标准菌株[16]，发现黄根醇提取物对白色念珠菌的早期
黏附有明显的抑制作用，抑制率与浓度呈正相关，当
黄根醇提取物浓度达到 16μg/mL时，抑制率明显提
高，故选取 16μg/mL黄根醇提取物作用于不同时期
（0~48h）白色念珠菌生物膜，发现其对不同生长阶段
的白色念珠菌生物膜均有抑制作用，提示黄根醇提
取物对白色念珠菌生物膜的发育有明显的干预作
用。由此推测其抑制白色念珠菌生物膜的作用可能
与其抑制细胞黏附过程相关。
为从分子机制角度进一步阐述黄根醇提取物对
白色念珠菌黏附抑制作用，我们检测了 ALS基因家
族中具有代表性的黏附相关基因 ALS1、ALS2、
ALS3。ALS基因是编码白色念珠菌细胞壁表明大分
子糖蛋白的一组基因，ALS基因家族至少包含 8个
基因（ALS1-7，ALS9），其表达产物 Alsp属锚定蛋白，
在生物膜形成的初期即黏附阶段发挥重要作用[17]，与
白色念珠菌细胞和宿主之间的黏附有密切关系。有
研究表明，ALS基因家族的表达产物大多参与了生
物膜形成。O’Connor 等[18]在医用硅胶上构建白色念
珠菌生物膜，用实时定量 RT-PCR方法检测到 ALS1
表达上调；Zhao等 [19]研究认为，ALS2 在白色念珠菌
黄根醇提取物浓度（μg/mL）
2
4
8
16
32
64
表 2 不同浓度黄根醇提取物对白色念珠菌生物膜形成
的相对抑制率（x±s，n=9）
抑制率（%）
18.20±1.12
30.51±0.97
41.35±0.45
62.09±0.81
78.41±0.67
87.64±0.75
生长阶段（h）
0
4
8
12
24
48
表 3 黄根醇提取物对不同生长阶段白色念珠菌生物膜
的影响（x±s）
抑制率（%）
79.51±0.33
67.81±1.21
59.27±0.98
53.71±1.05
47.23±0.77
39.11±0.51
观察时间
黄根醇提取物作用前
黄根醇提取物作用后
P
表 4 16μg/mL黄根醇提取物作用前后 ALS基因
表达水平的变化（x±s，n=9）
ALS1
6.11±0.14
5.95±0.31
>0.05
ALS2
7.87±0.27
5.15±0.34
<0.05
ALS3
6.24±0.51
2.13±0.23
<0.05
mRNA水平
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从酵母相向菌丝相转换中可能发挥一定作用。在体
外条件下，ALS3缺失菌株对人类重组细胞的黏附能
力几乎完全丧失，不能形成结构完整的被膜[20]。本研
究 qRT-PCR实验结果显示，黄根醇提取物作用后，
ALS2、ALS3表达下调，ALS1则未见明显变化。Nailis
等[21]利用 CDC生物膜反应器构建了连续流动条件下
的生物膜，经 RT-PCR检测发现，ALS1在生物膜形
成早期（0.5、1、6h）的表达无明显变化，后期（72、96h）
则表达下调。本实验中黄根醇提取物与白色念珠菌
生物膜的作用时间为 1h，即属于早期黏附阶段，故
ALS1表达无明显变化，与文献报道相符。结合本实
验结果，我们推测 ALS2、ALS3是黄根醇提取物的主
要作用基因，从而导致对黏附作用的抑制。
参 考 文 献
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