全 文 ：对比研究 , 采用盐酸与硫酸水解方法所测定的含量偏低 , 误
差较大 , 故选择硫酸与甲醇混合液作为水解的方法。
本研究对胃欣舒胶囊中的有效成分大黄酸 、 大黄素 、 大
黄酚建立了含量测定方法 , 该方法简便 、 灵敏 、 准确且专属
性较强 , 可有效控制胃欣舒胶囊的产品质量。这对于中药复
方新药研究及质量控制具有一定的意义。
参考文献
[ 1] 中国药典 2005年版.一部 [ S] .2005:17.
[ 2] 李立荣 , 雷玉萍 , 殷帅.HPLC测定通便消痤片中大黄素 、 大
黄酚总量的含量 [ J] .中成药 , 2007 , 29 (3):458.
[ 3] 陶丽华 , 杨洪梅.高效液相色谱法测定大败毒胶囊中大黄酸 、
大黄素及大黄酚的含量 [ J] .通化师范学院学报 , 2008 , 29
(8):5-6.
[ 4] 王洪志 , 范俊婷 , 刘勇 , 等.HPLC法测定清胰片中芦荟大黄
素 、 大黄酸 、 大黄素 、 大黄酚的含量 [ J] .中国实验方剂学杂
志 , 2008 , 14 (9):31.
[ 5] 张毓红 , 宋丽丽 , 吕永宁, 等.高效液相色谱法测定肾衰丸中
大黄酸和大黄酚的含量 [ J] .中国医院药学杂志 , 2008 , 28
(10):854-855.
[ 6] 陈湘宏.RP-HPLC 测定十二味百消胶囊大黄素和大黄酚的含
量 [ J] .华西药学杂志 , 2006 , 21 (3):284-285.
[ 7] 肖燕 , 刘建锋.高效液相色谱法测定上清丸中大黄素和大黄酚
的含量 [ J] .中南药学 , 2009 , 7 (1):39-42.
[ 8] 方晓明, 曹爱民 , 孟宪生.高效液相色谱法测定消脂颗粒中大
黄酚含量 [ J] .辽宁中医杂志 , 2008 , 35 (4):385.
[ 9] 周嘉裕, 廖海 , 李利平 , 等.决明子愈伤组织中大黄素与大黄
酚含量的测定 [ J] .安徽农业科学 , 2008 , 36 (21):8912-
8913.
[ 10] 崔玉芹 , 董振敏 , 门金玉 , 等.高效液相色谱法测定通舒口
爽胶囊中大黄素 、 大黄酸 、 大黄酚和大黄素甲醚的含量 [ J] .
中南药学 , 2009 , 7 (1):20-23.
[ 11] 李立荣 , 雷玉萍 , 殷帅.HPLC 测定通便消痤片中大黄素 、
大黄酚总量的含量 [ J] .中成药 , 2007 , 29 (3):458-460.
[ 12] 朱光宇 , 吴红 , 王利 , 等.HPLC测定崧黄感冒颗粒中大黄
酸 、 大黄素 、 大黄酚的含量 [ J] .安徽医药 , 2007 , 11 (2):
128-130.
(收稿日期:2008-11-06;修回日期:2009-01-13)
柱前衍生化法测定葫芦巴中 4-羟基异亮氨酸的含量
李波1 , 曾光尧2 , 谭健兵2 , 周应军2＊ , 谭桂山2 (1.湖南省药品食品监督管理局 , 长沙 , 410013;2.中南大学药
学院, 长沙　420013)
摘要:目的　建立葫芦巴中 4-羟基异亮氨酸的含量测定方法。方法　采用反相高效液相色谱 、 柱前邻苯二甲醛衍生
化法。 Kromasil ODS (250 mm×4.6 mm , 5 μm)色谱柱为固定相 , 甲醇-0.05 mol· L-1醋酸钠水溶液 (pH =7.2 ,
其中加入 0.5%四氢呋喃)梯度洗脱 (0 min ～ 20 min , 30∶70;30 min , 40∶60), 检测波长为 340 nm , 柱温为
30 ℃, 流速为 1 m L · min -1 。结果　4-羟基异亮氨酸在 0.184 8 ～ 3.696 μg 与峰面积呈良好的线性关系 (r =
0.999), 平均回收率=99.12%, RSD=2.15%(n=6)。结论　测定方法简便 、 准确 , 首次建立了葫芦巴药材的 4-
羟基异亮氨酸的邻苯二甲醛柱前衍生化含量测定方法 , 为葫芦巴质量控制及综合利用提供了依据。
关键词:葫芦巴;4-羟基异亮氨酸;反相高效液相色谱法;柱前衍生化法
中图分类号:R927.2 , R284.2　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672-2981 (2009)04-0277-03
Content determination of 4-hydroxyisoleucine in
Triganella j oenumgraecum L.by pre-column derivatization of HPLC
LI Bo1 , ZENG Guang-yao2 , TAN Jian-bing 2 , ZH OU Ying-jun2＊ , TAN Gui-shan2 (1.H unan Food and Drug A d-
ministration , Changsha 410013;2.School o f Pharmaceutical S ciences , Central South University , Changsha
410013)
Abstract:Objective　 To establish a method fo r the content de te rmination of 4-hydroxyiso leucine in Tri ganella j
oenumgraecum L.Methods　A pre-co lumn deriv ation w as developed by H PLC w ith o-phthaladehyde.H PLC w as used
with K romasil ODS(250 mm×4.6 mm , 5 μm)colum n , me thanol-0.5mo l· L -1 sodium ace tate(0 min～ 20 min , 30∶
　　作者简介:李波 , 男 , 博士研究生 , 主要从事天然药物研究　　＊通讯作者:周应军 , 副教授 , 博士 , 主要从事天然药物研究与开发 ,
Tel:(0731) 2650372 , E-mail:yingju nzhou@hotmail.com
277
中南药学 2009年 4月第 7卷第 4期　Cent ral S outh Ph armacy.Ap ri l 2009 , Vol.7 No.4
70;30 min , 40∶60)was used a s the mobile phase.The de tection waveleng th was 340 nm and the flow ra te was 1
mL ·min -1 .Results　The calibra tion curve of 4-hydroxy iso leucine was linear at 0.184 8 ～ 3.696μg(r=0.999).The
average recovery was 99.12%, RSD=2.15%(n=6).Conclusion　The method is rapid , accura te and suitable fo r
the quality contro l of Triganellaj oenumgraecum L.
Key words:Triganellaj oenumgraecum L.;4-hydroxyiso leucine;RP-H PLC;pre-co lumn derivation
　　葫芦巴为豆科植物葫芦巴属葫芦巴 (Triganellaj
oenumgraecum L.)的种子 , 始载于 《嘉佑本草》 , 归肾 、
肝经。其性温味苦 , 具有温肾壮阳 、 祛寒除湿等功效。用于
治疗寒疮 、 腹胁胀满 、 寒湿脚气 、 肾虚腰酸等 , 我国主产于
河南 、 河北 、 安徽 、 四川 、 新疆等地 , 且南北各地均有栽
培。胡芦巴干燥成熟种子作为常用中药收人中国药典 2005
年版一部[ 1] 。
胡芦巴在我国属药食同源之品 , 近年研究表明其种子具
有降血糖和防治高血压等作用[2 , 3] 。其化学成分主要为皂苷
类 、 黄酮类 、 三萜类 、 生物碱类及香豆素类 , 还含有多种氨
基酸类成分[ 4] , 其中(2S , 3R , 4R)-4 羟基异亮氨酸 (4-
hydroxyiso leucine , 以下简称 4-OH-Ile)的含量较高 , 且主
要研究都表明 4-OH-Ile为葫芦巴中主要降糖活性成分 , 其
作用机制为促进胰岛素的分泌 , 文献证实对Ⅱ型糖尿病疗效
确切[ 5] 。由于 4-OH-I le 没有紫外吸收 , 其含量测定相当困
难 , 本文采用反相高效液相法 , 以邻苯二甲醛 (OPA)与二
巯基乙醇为衍生化试剂 , 柱前衍生化测定葫芦巴中 4-OH-Ile
的含量。
1　仪器与试药
Ag lient高效液相色谱仪 (DAD 检测器 , ChemStation
色谱工作站 , 低压四元泵 , 自动进样器 , 美国 Ag lient 公
司)。
4-OH-Ile对照品由中南大学药学院天然药物化学教研室
自制 , 通过其 IR、1HNMR 与13 CNM R 图谱与文献[ 6] 比较确
证结构 , 纯度 98.5%。
甲醇为色谱纯 , 邻苯二甲醛 、 二巯基乙醇 、 硼酸 、 醋酸
钠 、 四氢呋喃均为分析纯;水为双蒸水并经 0.45μm 滤膜过
滤。葫芦巴药材购自安徽亳州 , 由中南大学药学院李劲平副
教授鉴定为 Tri ganella j oenumgraecum L.的种子。
2　方法与结果
2.1　药材处理方法
取葫芦巴药材粉碎 , 称取 2 g , 加入 20 mL 30%的乙
醇 , 回流提取 1.5 h , 滤过 , 继续加入 16 mL 30%的乙醇 ,
回流提取 1 h , 滤过 , 合并 2 次提取液 , 过滤 、 定容到
50 mL , 备用。
2.2　色谱条件
色谱柱:Kromasil ODS-1 色谱柱 (4.6 mm ×250 mm ,
5 μm);流动相:A 液为甲醇 , B 液为 0.05mol· L-1醋酸钠
水溶液 (pH =7.2 , 其中加入 0.5%四氢呋喃), A 液:B 液
梯度洗脱 (0 min ～ 20 min , 30∶70;30 min , 40∶60)。柱
温 30 ℃;紫外检测波长 340 nm;流速 1 mL ·min-1 。
2.3　溶液配制
2.3.1　衍生化试剂的配制　称取 0.1 g 邻苯二甲醛 , 用
1 mL 溶解 , 再加入二巯基乙醇 0.2 mL 及硼酸-氢氧化钠溶
液 (pH=9.5)4 m L , 0.45 μm 滤膜过滤 , 避光置冰箱中备
用 , 每 2 周需重新配制。
2.3.2　对照品溶液的配制　精密称取 4-OH-Ile 适量 , 加
30%乙醇溶解 , 定容 , 配成 0.184 8 mg ·mL-1的溶液。
2.3.3　柱前衍生化条件　采用自动进样器程序进样 , 自动
吸取样品溶液与邻苯二甲醛溶液各 10 μL , 柱前自动混合 3
次 , 反应 2 min , 进样。
2.4　线性关系考察
分别取浓度为 0.184 8 mg·mL-1的 4-OH-Ile对照品溶液
1 、 2 、 5 、 8 、 10 、 15、 20 μL 和相同体积的邻苯二甲醛溶液自
动混合 3 次 , 反应 2 min , 进样。以进样量 (μg)为 X 轴 ,
峰面积为Y 轴 , 进行线性回归 , 其线性方程为Y=2 230X -
49.76 (r=0.999), 结果表明:4-OH-Ile 在 0.184 8～ 3.696
μg 进样量与峰面积呈现良好的线性关系。
图 1　样品的高效液相色谱图
Fig 1　HPLC ch rom atogram of sam ple
A.邻苯二甲醛色谱图 (OPA);B.对照品衍生化色谱图 (OPA+4-
OH-Ile);C.样品衍生化色谱图 (OPA+sample)
278
C ent ral S outh Ph arm acy.Ap ri l 2009 , Vol.7 No.4　中南药学 2009年 4月第 7卷第 4期
2.5　精密度试验
精密吸取 “ 2.3.2” 项下对照品溶液 , 连续测定 6 次 ,
每次进样 10 μL , 结果显示 RSD为 1.05% (n=6), 表明仪
器精密度良好。
2.6　稳定性试验
精密称取葫芦巴药材粉末 (批号:20050103)2 g , 依
“ 2.1” 项下方法制定样品溶液 , 分别于 0 、 6、 12、 18 、 24 、
30 、 36 h 取样测定 , 结果样品峰面积 RSD 为 1.33% (n=
7), 表明供试样品溶液在 36 h 内稳定。
2.7　重复性试验
取同一批葫芦巴药材 5 份 , 按 “ 2.1” 样品处理方法进
行处理 , 进样 10 μL , 计算 , 结果药材中 4-OH-Ile的平均含
量为 0.255%, RSD=1.5% (n=5)。
2.8　加样回收率试验
称取 6份已知含量 0.255%的葫芦巴药材粉末 , 每份
2 g , 精密称定;精密称取 4-OH-I le 对照品 30.14 mg , 置
25 m L量瓶中 , 加适量 30%乙醇超声 (功率 400 W , 频率
40 KH z)使溶解 , 放冷 , 稀释至刻度 , 摇匀 , 即得 4-OH-
Ile对照品储备液;分别在上述 6 份药材中加入 4-OH-Ile 对
照品储备液各 3.0 mL , 按 “ 2.1” 项下方法进行处理 , 制备
供试品溶液。测定 4-OH-Ile 的含量并计算回收率。结果见
表 1。
表 1　4-OH-Ile的加样回收率试验结果
Tab 1　Recovery of 4-OH-Ile
编号
(No.)
取样量
(sample)/g
样品含量
(sam ple con tent)
/mg
对照品加入量
(added am ount)
/mg
测得量
(detected amount)
/mg
回收率
(recovery)
/ %
平均回收率
(average recovery)
/ %
RSD
/ %
1 1.985 2 5.01 3.62 8.63 98.97
2 2.010 2 5.06 3.62 8.68 98.71
3 2.124 2 5.27 3.62 8.89 97.29
4 1.987 8 5.12 3.62 8.74 101.01 99.12 2.15
5 2.150 8 5.41 3.62 9.03 98.64
6 2.072 2 5.29 3.62 8.91 100.11
2.9　多批药材含量测定结果
分别对多批药材按 “ 2.1” 药材处理方法进行处理 , 把
样品液注入高效液相色谱中 , 进行含量测定 , 结果见表 2。
表 2　样品测定结果
Tab 2　Sample determination
批号 (Lot No.) 百分含量 (con tent percentage)/ %
20050103 0.255
20050402 0.227
20050513 0.294
20050924 0.301
20060604 0.248
3　讨论
3.1　衍生化条件确定
在前期基础研究中对葫芦巴中 4-OH-I le 的柱前衍生化
条件进行深入摸索 , 考察了流动相 、 色谱柱及衍生化试剂的
用量 、 柱前衍生化时间等因素 , 认为所配邻苯二甲醛溶液与
该药材处理方法所得样品溶液按 1∶1 进行柱前衍生化 2 min
能较好地满足葫芦巴中 4-OH-Ile的含量测定。
3.2　检测波长的确定
经 DAD 检测器检测 , 4-OH-Ile 被衍生化后在 200 ～
400 nm 的全波长扫描图中在 340 nm 有最大吸收 , 故确定其
检测波长为 340 nm。
3.3　意义
4-OH-Ile为葫芦巴的主要化学成分 , 具有较强降糖药理
活性 , 对其含量进行测定 、 建立其含量测定方法学 , 有利于
对该药材中 4-OH-Ile的资源调查和质量控制。
本氨基酸测定方法与使用氨基酸分析仪相比 , 具有快
速 、 灵敏 、 不需专用仪器等优点。 4-OH-I le为氨基酸类化合
物 , 其紫外吸收较弱 , 尽管目前已有使用蒸发光散射对其进
行含量测定的报道[ 7] , 但利用柱前衍生化进行含量测定具有
操作方法简单 、 应用广泛等特点 。使用邻苯二甲醛进行衍生
化 , 相比较于 9-芴基甲氧基羰酰氯 、 异硫氰酸苯酯及丹酰氯
等 , 步骤更简单 , 且剩余试剂不产生干扰 , 衍生物可用多种
检测器检测[ 8-10] 。
参考文献
[ 1] 中国药典 2005版.一部 [ S] .2005:167.
[ 2] 周玖瑶 , 邓素坚 , 黄桂英 , 等.葫芦巴对链佐霉素诱导糖尿病
模型大鼠药理研究 [ J] .中华中医药学刊 , 2007 , 25 (5):
1005-1007.
[ 3] 魏友霞, 李选社 , 封卫毅 , 等.葫芦巴种子提取物对糖尿病大
鼠的影响 [ J] .中成药 , 2007 , 29 (3):450-451.
[ 4] 荆宇 , 赵余庆.胡芦巴化学成分和药理作用研究进展 [ J] .中
草药 , 2003 , 34 (12):1146-1149.
[ 5] 刘玲 , 丁永良 , 张国林.4-羟基异亮氨酸的研究进展 [ J] .天
然产物研究与开发 , 2006 , 18(3):491-496.
[ 6 ] Alcock NW , Crout DHG , Gregorio MVM , et al.Stereo-
ch emist ry of the 4-hyd roxyisoleu cine f rom T rig onella forenum-
g raecum [ J] .Phy toch emist ry , 1989 , 28 (7):1835-1841.
[ 7] 房杰 , 刘智宇 , 熊正涛.HPLC-ELSD测定胡芦巴中 4-羟基异
亮氨酸的含量 [ J] .华西药学杂志 , 2004 , 19 (5):355-356.
[ 8] 朱智甲.邻苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色谱法测定水牛角
中氨基酸的含量 [ J] .分析化学 , 2000 , 28 (5):609-612.
[ 9] 王玉君 , 李烈英 , 陆田生.HPLC 柱前衍生法测定海水中溶解
态游离氨基酸 [ J] .海洋科学 , 1989 , 2 (3):43-47.
[ 10] 李增宁 , 骆彬 , 勉丽娜 , 等.高效液相色谱法测定肠内制剂
中的谷氨酰胺含量 [ J] .中国临床营养杂志, 2008 , 16
(3):175-177.
(收稿日期:2009-02-12;修回日期:2009-03-10)
279
中南药学 2009年 4月第 7卷第 4期　Cent ral S outh Ph armacy.Ap ri l 2009 , Vol.7 No.4